微生物的计数——血球计数板法37122.pdf

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1、 微生物的计数血球计数板法【摘要】测定微生物细胞数量的方法很多，有分光光度法、显微直接计数法和平板计数法。分光光度法比拟简便，易操作，但是会使数据严重偏大。而平板计数法则会使实验数据严重偏小。显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫霍泽Petrof Hausser细菌计数板。两种计数板的原理和部件一样，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。本实验采用血球计数板法，主要目的是了解血球计数板法的构造和使用方法，学会用血球计数板对酵母菌细胞进

2、展计数。一、实验目的与要求 1、了解微生物计数常用的三种方法：分光光度法；平板计数法；血球计数板法。2、了解血球计数板的构造和使用方法。3、学会用血球计数板对酵母细胞进展计数。二、根本原理 利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液或孢子悬液放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进展计数。由于计数室的容积是一定的0.1mm2，所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平

3、台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进展。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16 个中方格，而每个中方格又分成 25 个小方格；另一种是一个大方格分成 25 个中方格，而每个中方格又分成 16 个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方 格数都是一样的，即 1625=400 小方格。每一个大方格边长为 1mm，则每一大方格的面积为 1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为 01mm，所以计数室的容积为 01mm3。在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然

4、后求得每个中方格的平均值，再乘上16 或 25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成 1ml 菌液中的总菌数。下面以一个大方格有 25 个中方格的计数板为例进展计算：设五个中方格中总菌数为 A，菌液稀释倍数为 B，则，一个大方格中的总菌数 因 1ml=1cm3=1000mm3，=50000AB个 同理，如果是 16 个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为 A，则 三、实验材料 1菌种：酿酒酵母菌 2用品：显微镜、血球计数板、酒精灯、盖玻片、接种环、番红染液、胶头滴管。四、实验方法 1、实验流程图 2、实验步骤 1镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进展镜检。假设有污物，则需清洗后才能

5、进展计数。2将酿酒酵母菌悬液进展适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。3)取干净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。然后在显微镜下找到计数室。假设计数室沾有杂质或者菌体，要用蒸馏水冲洗计数板，用滤纸吸干其上的水分。然后再放到显微镜下找到计数室。4)将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴不宜过多，让菌悬液利用液体的外表张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。5)静置片刻，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。制备稀释液加样找计数室计数 6)计

6、数时假设计数区是由 16 个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的 4 个大方格即 100 小格的菌数。如果是 25 个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央 l 个大方格的菌数即 80 个小格。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。本实验采用25 格16 格的血球计数板。计数时应数5 个大方格。7)计数。每个样品重复计数23 次 每次数值不应相差过大，否则应重新操作，求出每一个小格中细胞平均数N，按公式计算出每 mlg菌悬液所含酵母菌细胞数量。8)测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏

7、网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。9计算结果。可用以下公式进展计算 116 格25 格的血球计数板计算公式：细胞数/ml=100 小格内细胞个数/10040010000稀释倍数 225 格16 格的血球计数板计算公式：细胞数/ml=80 小格内细胞个数/8040010000稀释倍数 五、实验结果 计算次数 各大格中细胞数 大格中细胞总数 稀释倍数 总菌数CFU/mL或g)左上 右上 左下 右下 中间 第一次 32 37 40 39 44 960 100 960000000 六、结论与分析 1、误差来源 本次试验中我们组用的是 2 号酵母培养液，是本次试验所用的酵母培养液中浓

8、度最高的培养液。但是经过教师分析，实验数据仍然偏大的一点。产生这种误差的原因大概如下：酵母细胞计数的误差分别来源于技术误差和固有误差。其中由于操作人员不注意细节，器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等因素所造成的误差属技术误差；而由于仪器计数板、盖片、吸管等不够准确与精细带来的误差称仪器误差，由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差属于分布误差或计数域误差filederror。由于时间的关系，实验计数的次数太少，难以得到准确均匀的实验数据。在实验过程中，操作人员也存在一定的不严谨性，导致实验结果产生误差。由于没有足够多的平行数据，难以用科学的计数方法进展结果的计算，因此难以得到比拟准

9、确的实验数据。因此，搞好酵母细胞计数的质量控制一般需采用以下措施。1防止技术误差，纠正仪器误差 所用器材均应清洁枯燥，计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸管的规格应符合要求或经过校正。严格操作，从消毒、稀释、加样到计数都应标准，尤其应注意的是样品稀释要作到充分混匀。必须一次性充满计数室，防止产生气泡，充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与盖玻片之间的矩形边缘为宜。2缩小计数域误差或分布误差由于血细胞在充入计数室后呈随机分布或，而我们所能计数的细胞分布范围是有限的，由此造成的计数误差称为计数域误差或分布误差。缩小这种误差的有效方法就是尽量扩大细胞计数范围和计数数目，一般先进展误差估计，然后决定所需计数

10、的数目和计数范围，只要能将误差控制在允许范围内即可。2、缺乏之处 血球计数板在显微镜下直接进展测定。它观察在一定的容积中的微生物的个体数目，然后推算出含菌数，简便快捷。但是在计数时包括死活细胞均被计算在内，还有微小杂物也被计算在内。这样得出结果往往偏高，因此适用于对形态个体较大的菌体或孢子进展计数。七、思考题 1、试述血球计数板的计数原理。为什么用两种规格不同的计数板计数同一样品，结果是一样的？答：每块计数板由 H 形凹槽分为 2 个同样的计数池 计数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高 0.10mm 的计数池。计数池画有长、宽各3.0mm 的方格，分为 9 个大方格，每个大格面积为 1.0mm;.容积为 0.1mm，中央大方格用双线分成 25 个中方格，位于正中及四角 5 个中方格是红细胞计数区域，用单线划分为 16 个小方格。四角的 4 个大方格是白细胞计数区域，用单线划分为 16 个中方格。血球计数板的计数原理：通过对一定数量的小格计数，根据相应小格所占的体积，可以推算出单位体积的溶液中微生物细胞的密度和总数。因为不同规格用不同的计算公式计算，最后得出的都是微生物细胞的密度和总数，所以结果一样。