第二章基因工程工具酶(简化版).pptx

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1、第二章第二章 基因工程的工具酶基因工程的工具酶一、限制性核酸内切酶的发现一、限制性核酸内切酶的发现第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制限制 (restriction)修饰修饰 (modification)限制性核酸内切酶的生物学功能：自我保护功能限制性核酸内切酶的生物学功能：自我保护功能(只只切外来的切外来的DNA，自身，自身DNA被甲基化后切不动被甲基化后切不动)核酸酶：水解断裂多核苷酸链的两个相邻核苷酸的核酸酶：水解断裂多核苷酸链的两个相邻核苷酸的3,5磷酸二酯键磷酸二酯键核糖核酸酶（核糖核酸酶（RNase）：）：脱氧核糖核酸酶（脱氧核糖核酸酶（DNase）：）：核酸外切酶（

2、核酸外切酶（exonuclease）：）：核酸内切酶（核酸内切酶（endonuclease）：）：限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶：二、限制性核酸内切酶的分类二、限制性核酸内切酶的分类主要特性主要特性I I 型型II II 型型III III 型型限制修饰限制修饰多功能多功能多功能多功能单功能单功能单功能单功能双功能双功能双功能双功能蛋白结构蛋白结构异源三聚体异源三聚体同源二聚体同源二聚体异源二聚体异源二聚体辅助因子辅助因子辅助因子辅助因子ATP,MgATP,MgATP,MgATP,Mg2+2+2+2+,SAM,SAM,SAM,SAMMgMgMgMg2+2+2+2+ATP,MgATP,MgA

3、TP,MgATP,Mg2+2+2+2+,SAM,SAM,SAM,SAM识别序列识别序列识别序列识别序列特异性非对称特异性非对称特异性非对称特异性非对称性序列性序列性序列性序列特异性特异性特异性特异性4-8bp4-8bp4-8bp4-8bp旋旋旋旋转对称序列转对称序列转对称序列转对称序列特异性非对称特异性非对称特异性非对称特异性非对称性序列性序列性序列性序列切割位点切割位点距识别序列距识别序列1 1kbkb处随机性切割处随机性切割识别序列内或识别序列内或附近特异性切附近特异性切割割距识别序列下距识别序列下游游24-2624-26bpbp用途用途无应用价值无应用价值应用广泛应用广泛无应用价值无应用

4、价值平末端平末端粘性末端粘性末端1单位酶活性单位酶活性(1unit 1U)：在最适反应条件下在最适反应条件下1小时完全切割小时完全切割1ugDNA样品的酶量。样品的酶量。同序同裂酶同序同裂酶(识别及酶切位点相同识别及酶切位点相同):同序异裂酶同序异裂酶(识别位点相同但酶切位点不同识别位点相同但酶切位点不同):同尾酶同尾酶(酶切位点不同但产生相同的粘性末酶切位点不同但产生相同的粘性末端端):):酶切位点的计算：酶切位点的计算：四核苷酸识别序列：四核苷酸识别序列：4 44 4=256=256六核苷酸识别序列：六核苷酸识别序列：4 46 6=409640962 2个假设：个假设：a a 随机排列；随

5、机排列；b GCb GC含量含量50%50%如：如：用用BglBgl(A/GATC/T)(A/GATC/T)酶切酶切DNA49KbDNA49Kb）:理论上的切点数：理论上的切点数：49000/4096=1 49000/4096=12 2个个 实际情况？实际情况？三、限制性核酸内切酶的命名1973年年H.Smith和和D.Nathans提议提议每每一一种种酶酶都都由由产产生生并并纯纯化化生生出出该该酶酶的的细细菌菌的的种种属属名名中中的的三三个个英文字母合起来代表：英文字母合起来代表：第一个字母采用细菌属名的第一个字母大写；第一个字母采用细菌属名的第一个字母大写；第二和第三个字母小写，采用细菌种

6、名的前两个字母；第二和第三个字母小写，采用细菌种名的前两个字母；如如大大肠肠杆杆菌菌（Escherichia coli）用用Eco表表示示，代代表表从从大肠杆菌中分离出的限制性内切酶。大肠杆菌中分离出的限制性内切酶。第第四四个个字字母母表表示示菌菌株株的的类类型型（大大小小写写均均有有），如如EcoR中中的的R代表大肠杆菌代表大肠杆菌R株。株。如如果果一一个个菌菌株株有有几几种种限限制制酶酶，则则在在代代表表菌菌株株的的字字母母后后用用罗罗马马数字表示。数字表示。思考题：思考题：流感嗜血杆菌（流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）d菌株菌株有三种限制酶，分别怎么表示？有三

7、种限制酶，分别怎么表示？Hind I、HindII、HindIIIBaciUus amyloliquefaciens H Streptomyces albus I一、天然一、天然DNADNA的制备的制备 1 1、天然、天然DNADNA的来源的来源染色体染色体DNADNA病毒和噬菌体病毒和噬菌体DNADNA质粒质粒DNADNA线粒体和叶绿体线粒体和叶绿体DNADNA第二节第二节 DNADNA分子片段化分子片段化2、天然、天然DNA的提取的提取 准备生物材料。准备生物材料。裂解细胞。裂解细胞。分离和抽提分离和抽提DNA。二、二、DNA的纯化的纯化 琼脂糖凝胶电泳洗脱法琼脂糖凝胶电泳洗脱法 适适用用

8、于于小小剂剂量量DNA的的纯纯化化和和酶酶切切DNA片片段的回收。段的回收。三、三、DNA的浓缩的浓缩 乙醇沉淀法乙醇沉淀法在含一价阳离子的在含一价阳离子的DNA溶液中加入溶液中加入2体体积的无水乙醇，使积的无水乙醇，使DNA沉淀沉淀（-20，时间在，时间在30min以上）以上）通过离心收集沉淀的通过离心收集沉淀的DNA溶于适量的溶于适量的TE缓冲液或无菌水中缓冲液或无菌水中四、限制性核酸内切酶反应四、限制性核酸内切酶反应1 1、限制性核酸内切酶反应缓冲液、限制性核酸内切酶反应缓冲液 2、单酶切法、单酶切法 若若DNA样品是环状样品是环状DNA分子，完全酶切后，产分子，完全酶切后，产生与识别序

9、列数（生与识别序列数（n）相同的相同的DNA片段数，并且片段数，并且DNA片段的两末端相同片段的两末端相同 若若DNA样品本来就是线形样品本来就是线形 DNA片段，完全酶切片段，完全酶切的结果，产生的结果，产生n 1个个 DNA片段数，其中有两个片片段数，其中有两个片段的一端仍保留原来的末端段的一端仍保留原来的末端 3、双酶切法、双酶切法 应应先先用用需需要要较较低低盐盐浓浓度度缓缓冲冲液液的的酶酶进进行行切切割割，然然后后调调节节缓缓冲冲液的盐浓度，再加入需要较高盐浓度缓冲液的酶进行切割。液的盐浓度，再加入需要较高盐浓度缓冲液的酶进行切割。如如果果两两种种限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶的的

10、最最适适反反应应温温度度不不同同，则则应应先先用用最最适适反反应应温温度度较较低低的的酶酶进进行行切切割割，升升温温后后再再加加入入第第二二种种酶酶进进行切割。行切割。若若两两种种限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶的的反反应应系系统统相相差差很很大大，会会明明显显影影响响双双酶酶切切结结果果，则则可可以以在在第第一一种种酶酶切切割割后后，经经过过凝凝胶胶电电泳泳回回收收需需要要的的DNADNA片片段段，再再选选用用合合适适的的反反应应系系统统，进进行行第第二二种种限限制制性性核酸内切酶的切割。核酸内切酶的切割。4、部分酶切 当当某某种种限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶在在待待切切割割的的DNA分

11、分子子上上有有多多个个识识别别序序列列，并并且且其其中中一一个个识识别别序序列列正正好好在在切切割割后后需需要要回回收收待待用用的的DNA片片段段上上，若若完完全全酶酶切切，势势必必将将此此待待用用的的DNA片片段段从从中中切切断断。在在此此情情况况下下，对对DNA样样品品进进行行部部分分酶酶切切，经经过过凝凝胶胶电泳，根据待用电泳，根据待用DNA片段的大小，可回收待用的片段的大小，可回收待用的DNA片段片段 5、DNA分子的限制性图谱五五、影响核酸内切限制酶活性的因素、影响核酸内切限制酶活性的因素（1）DNA的纯度的纯度（2）DNA的甲基化程度的甲基化程度（3）酶切消化反应的温度）酶切消化反

12、应的温度（4）DNA的分子结构的分子结构（5）星星活性）星星活性 第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶 间断间断(discontinuity)：在在DNA的一条链上某一位置的一条链上某一位置两个相邻的核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂。两个相邻的核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂。缺刻缺刻(nick)：某一位置上丢失了一个或几个核苷酸。某一位置上丢失了一个或几个核苷酸。（1）以）以DNA聚合酶聚合酶I为代表的为代表的“合成型合成型”（2）以）以klenow聚合酶为代表，只有聚合酶活聚合酶为代表，只有聚合酶活性和部分外切酶的活性性和部分外切酶的活性（3）逆转录酶类，以）逆转录酶类，以RNA作为聚合模板作为聚

13、合模板根据模板和作用方式的不同分为三类：二、大肠杆菌二、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I（全酶）全酶）1 1、性质、性质:53 53 DNADNA聚合酶活性聚合酶活性3535外切核酸酶活性外切核酸酶活性5353外切核酸酶活性外切核酸酶活性三、大肠杆菌三、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段（Klenow片段）片段）1、性质、性质 它它具具有有5353聚聚合合活活性性和和3535外外切酶活性切酶活性,失去了失去了5353的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性.四、四、T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶1、性质性质具具有有53聚聚合合酶酶活活性性及及35外外切切核核酸酸酶酶活活性性。其其35外外切切酶酶

14、活活性性对对单单链链DNA的的作作用用比比对对双双链链DNA的的作作用用更更强强。它它的的外切核酸酶活性比外切核酸酶活性比kenow片段要强片段要强200倍。倍。2、用途、用途1）补平或标记限制性内切酶消化）补平或标记限制性内切酶消化DNA后产生的后产生的3凹端。凹端。2）对带有）对带有3突出端的突出端的DNA分子进行末端标记。分子进行末端标记。五、五、T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶1 1、性质性质 持续合成能力最强持续合成能力最强 3535外外切切核核酸酸酶酶活活性性为为klenowklenow片片段段的的10001000倍倍 没有没有5353外切酶活性。外切酶活性。2 2、主要用途、主

15、要用途1 1）用于拷贝长段模板的引物延伸反应。）用于拷贝长段模板的引物延伸反应。2 2）通通过过补补平平或或交交换换（置置换换）反反应应进进行行快快速速末末端端标记。标记。六、六、Taq DNA聚合酶聚合酶 具具有有5353外外切切核核酸酸酶酶活活性性。最最佳佳作作用用温温度度为为75-8075-80。无33 55外外切切核核酸酸酶酶活性，纠错功能较差。活性，纠错功能较差。用途用途1 1）可使特定序列扩增）可使特定序列扩增10106 6倍。倍。2 2）用用于于聚聚合合酶酶链链式式反反应应（PCRPCR），对对DNADNA片片段段进行体外扩增。进行体外扩增。七、逆转录酶（七、逆转录酶（rever

16、se transcriptase）依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶聚合酶商品化逆转录酶：商品化逆转录酶：禽源反转录酶（禽源反转录酶（AMVAMV），鼠源反转录酶（鼠源反转录酶（MoMLVMoMLV）反转录酶的基本特性：以反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合为模板聚合cDNA链链 双向外切双向外切双向外切双向外切DNA-RNADNA-RNA杂合链中的杂合链中的杂合链中的杂合链中的RNARNA链链链链第四节第四节 PCRPCR反应及应用反应及应用PCRPCR（Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction）称为聚合酶链反应或称为聚合酶链反应

17、或PCRPCR扩增技术，是一种高效快扩增技术，是一种高效快速的体外速的体外DNADNA聚合程序。具有聚合程序。具有特异性强、灵敏度高、简特异性强、灵敏度高、简便快速、对标本的纯度要求低等特点。便快速、对标本的纯度要求低等特点。变性变性94C延伸延伸72C退火退火Tm-5C基本反应步骤基本反应步骤 PCRPCR技术的特点技术的特点高特异性高特异性高灵敏度高灵敏度简便快速简便快速低纯度标本也可使用低纯度标本也可使用第五节第五节 DNA连接酶（连接酶（ligase）DNA连接酶：将两个连接酶：将两个DNA片段通过催化形成片段通过催化形成3，5磷酸二酯键而连接起来的酶。磷酸二酯键而连接起来的酶。p T

18、4 DNA连接酶：可连接连接酶：可连接DNA链（平粘端均可），链（平粘端均可），也可连也可连RNA链，应用广泛。链，应用广泛。p E.coli DNA连接酶：平端连接效率远低于连接酶：平端连接效率远低于T4DNA连接酶，不能连接连接酶，不能连接RNA分子。分子。p T4 RNA连接酶：可催化两个单链连接酶：可催化两个单链DNA或或RNA分子分子的连接。的连接。一、连接酶功能一、连接酶功能1、间断修复功能、间断修复功能2 2、连接功能、连接功能三、粘性末端连接技术三、粘性末端连接技术 1、衔接体、衔接体(linker)技术技术 2、结合体、结合体(adaptor)技术技术 3、同聚体、同聚体(h

19、omopolymer)加尾技术加尾技术第六节第六节 结合体技术的应用结合体技术的应用AFLP AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）AFLPAFLP一词是一词是19911991年年GustavoGustavo提出的提出的;该方法结合了该方法结合了RFLP(restriction fragment length RFLP(restriction fragment length polymorphisms)polymorphisms)技术和技术和RAPDRAPD技术的特点技术的特点;使用人工接头（使用人工接头（AdaptorAdaptor）与限制性

20、内切酶酶切的基因与限制性内切酶酶切的基因组组DNADNA片段连接并以此为片段连接并以此为DNADNA模板，合成系列模板，合成系列33末端末端随机变化数个碱基且与人工接头序列相互补的随机变化数个碱基且与人工接头序列相互补的PCRPCR引物，引物，来进行来进行PCRPCR特异条带扩增，经电泳检测后可获得特异条带扩增，经电泳检测后可获得DNADNA指指纹图谱纹图谱。此项技术优点此项技术优点（1）稳定，重复性好；）稳定，重复性好；（2）需用的）需用的DNA量少，适用于分析的量少，适用于分析的DNA大小范大小范围宽；围宽；（3）能产生更多的多态性标志，得到的条带也更密）能产生更多的多态性标志，得到的条带

21、也更密集，一般比集，一般比RFLP和和RAPD多多10100倍，便于比倍，便于比较分析；较分析；（4）操作易于标准化和自动化，适于大批量的样品）操作易于标准化和自动化，适于大批量的样品分析。分析。第七节第七节 基因工程的其它酶类基因工程的其它酶类一、一、DNADNA及及RNARNA的修饰酶的修饰酶（一）未端（脱氧核苷酸）转移酶（一）未端（脱氧核苷酸）转移酶（二）碱性磷酸酶（二）碱性磷酸酶(alkaline phosphatase(alkaline phosphatase）（三）多核苷酸激酶（三）多核苷酸激酶(polynucleotide kinase)二、单链核酸内切酶二、单链核酸内切酶（一）

22、一）S S1 1核酸酶核酸酶（二）二）Bal 31Bal 31核酸酶核酸酶 核酸外切酶核酸外切酶 底物底物 切割位点切割位点大肠杆菌核酸外切酶大肠杆菌核酸外切酶 ssDNA 5OH末端末端大肠杆菌核酸外切酶大肠杆菌核酸外切酶 dsDNA 3OH末端末端大肠杆菌核酸外切酶大肠杆菌核酸外切酶 DNA 3OH末端末端大肠杆菌核酸外切酶大肠杆菌核酸外切酶 ssDNA 3末端，末端，5P末端末端噬菌体噬菌体核酸外切酶核酸外切酶 dsDNA 5P末端末端T7噬菌体核酸外切酶噬菌体核酸外切酶 dsDNA 5P末端末端三、核酸外切酶三、核酸外切酶(exonucleases)本章复习要点本章复习要点限制性内切酶

23、限制性内切酶 三种类型酶及各自特征；三种类型酶及各自特征；II型酶的相关概念；酶切位点的型酶的相关概念；酶切位点的估算；酶切反应。估算；酶切反应。DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶I、Klenow酶、酶、T4DNA聚合酶、聚合酶、T7DNA聚合聚合酶、反转录酶及酶、反转录酶及Taq酶各自的作用特点及用途；酶各自的作用特点及用途；PCR的作用原的作用原理及几种延伸技术。理及几种延伸技术。DNA连接酶连接酶 T4DNA连接酶的作用特点；衔接体、人工接头及同聚物连接酶的作用特点；衔接体、人工接头及同聚物加尾三种技术的原理；加尾三种技术的原理；AFLP技术的原理。技术的原理。其它工具酶其它工具酶 末端转移酶、磷酸酶及末端转移酶、磷酸酶及T4多聚核苷酸激酶的特点及用途。多聚核苷酸激酶的特点及用途。