HBVcccDNA及其意义.ppt

《HBVcccDNA及其意义.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《HBVcccDNA及其意义.ppt（50页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、HBVcccDNAHBVcccDNA及其意义及其意义贵州省人民医院感染科贵州省人民医院感染科汤正明汤正明2006-08-151 2006.08.15感感染染科科2006-08-152临床上我们常常遇到以下问题：临床上我们常常遇到以下问题：慢性乙肝难以治愈慢性乙肝难以治愈 抗病毒治疗过程中常常发生药物耐受抗病毒治疗过程中常常发生药物耐受 抗病毒治疗后容易复发抗病毒治疗后容易复发 分子生物学研究表明，分子生物学研究表明，HBVcccDNAHBVcccDNA在病毒持在病毒持 续感染、抗病毒治疗后的再度活跃复制以及药物续感染、抗病毒治疗后的再度活跃复制以及药物耐受方面起着至关重要的作用。耐受方面起着至

2、关重要的作用。现就现就 HBVcccDNAHBVcccDNA乙肝病毒共价闭合环状乙肝病毒共价闭合环状DNADNA的研究进展进行简单的阐述。这是我的学习汇报，的研究进展进行简单的阐述。这是我的学习汇报，希望各位专家批评指正。希望各位专家批评指正。感染科感染科为什么？为什么？2006-08-153一、HBV感染初期cccDNA的形成二、HBVcccDNA的稳定性三、核苷类似物不能阻止初始cccDNA的形成四、HBVcccDNA检测方法五、慢性乙肝患者cccDNA检测的意义六、如何清除HBVcccDNA？七、cccDNA在抗病毒治疗研究中的应用前景一、一、HBVHBV感染初期感染初期cccDNAcc

3、cDNA的形成的形成HBVcccDNAHBVcccDNA存在于肝细胞核内，是病毒成存在于肝细胞核内，是病毒成功感染肝细胞的标志，也是慢性乙型肝炎功感染肝细胞的标志，也是慢性乙型肝炎持久存在的关键。持久存在的关键。其形成过程包括：其形成过程包括：HBVHBV颗粒与肝细胞膜接触，被细胞以内吞作颗粒与肝细胞膜接触，被细胞以内吞作用摄入，病毒脱壳后核壳体向肝细胞核转移，用摄入，病毒脱壳后核壳体向肝细胞核转移，释放松弛的环状释放松弛的环状DNADNA（relaxe circular relaxe circular DNA,rcDNA)DNA,rcDNA)进入细胞核。进入细胞核。2006-08-154 感

4、染科感染科2006-08-155rcDNArcDNA的正链在的正链在DNADNA聚合酶作用下聚合酶作用下进一步延长形成全长的进一步延长形成全长的rcDNArcDNA，正，正负链末端各自连接并构象发生改负链末端各自连接并构象发生改变形成变形成cccDNAcccDNA，最后在核小体内，最后在核小体内组合形成非整合状态的微型染色组合形成非整合状态的微型染色体。体。感染科感染科2006-08-156细胞核细胞核内的内的cccDNAcccDNA作为复制模板作为复制模板转录前基因组转录前基因组RNARNA和其他基因的和其他基因的mRNAmRNA。前基因。前基因RNARNA被转运至胞浆，被转运至胞浆，与病毒

5、核心蛋白以及与病毒核心蛋白以及P P蛋白组装成蛋白组装成核壳体。病毒核壳体。病毒DNADNA聚合酶具有逆转聚合酶具有逆转录酶活性，以前基因组录酶活性，以前基因组RNARNA为模板为模板逆转录子代逆转录子代DNA DNA，核壳体成熟。，核壳体成熟。感染科感染科2006-08-157成熟的核壳体有两个去向：成熟的核壳体有两个去向：部分再进入细胞核重新形成部分再进入细胞核重新形成cccDNAcccDNA，不断补充核内不断补充核内cccDNAcccDNA池；池；部分进入内质网与病毒蛋白组装成病部分进入内质网与病毒蛋白组装成病毒颗粒向细胞外分泌，感染新的肝细毒颗粒向细胞外分泌，感染新的肝细胞。胞。病毒病

6、毒cccDNAcccDNA的产生也有两个途径，既的产生也有两个途径，既可由肝细胞内已有的病毒在复制周期可由肝细胞内已有的病毒在复制周期中产生，也可由新感染的肝细胞产生。中产生，也可由新感染的肝细胞产生。如图所示。如图所示。感染科感染科2006-08-158感染科感染科2006-08-159感染科感染科HBVHBV复制过程复制过程2006-08-1510 感染科感染科2006-08-1511v复制方式：复制方式：vHBV吸附吸附 cccDNA 转转v 2.1KbmRNA 外衣壳蛋白外衣壳蛋白v录录 内衣壳蛋白内衣壳蛋白v 3.5KbmRNA （前基因组前基因组）v 反转录反转录HBVDNA负链负

7、链v 复制复制+DNAv v 组装与释放组装与释放 感染科感染科2006-08-1512动物实验证实，处于稳定感染的动物实验证实，处于稳定感染的肝细胞内大约有肝细胞内大约有30-5030-50个个cccDNAcccDNA拷拷贝。对慢性乙型肝炎患者肝组织贝。对慢性乙型肝炎患者肝组织内内cccDNAcccDNA实时定量检测，平均每实时定量检测，平均每个感染细胞含有个感染细胞含有3333拷贝，与动物拷贝，与动物实验结果相符。实验结果相符。稳定感染的肝细胞核内稳定感染的肝细胞核内cccDNAcccDNA一一般维持在一定水平，既满足病毒般维持在一定水平，既满足病毒复制需要，又不对细胞产生毒性。复制需要，

8、又不对细胞产生毒性。感染科感染科2006-08-1513这这一调节机制通过病毒胞膜蛋白一调节机制通过病毒胞膜蛋白负反馈机制来实现，前负反馈机制来实现，前C C区蛋白发区蛋白发生变异可导致生变异可导致cccDNAcccDNA大量扩增，大量扩增，并引起细胞死亡并引起细胞死亡。cccDNAcccDNA的稳定对维持细胞的长期的稳定对维持细胞的长期感染状态起决定作用。感染状态起决定作用。感染科感染科2006-08-1514cccDNAcccDNA和和rcDNArcDNA在结构和理化特性在结构和理化特性上有上有3 3点不同：点不同：1.rcDNA1.rcDNA在正链与负链上均有缺口在正链与负链上均有缺口或

9、缺刻，只是部分区域互补才能或缺刻，只是部分区域互补才能形成环状结构，但非超螺旋结构，形成环状结构，但非超螺旋结构，而而cccDNAcccDNA两条链均是完整的，两两条链均是完整的，两者共价互补，形成超螺旋结构。者共价互补，形成超螺旋结构。感染科感染科2006-08-15152.rcDNA 2.rcDNA 能与蛋白共价结合，能与蛋白共价结合，cccDNAcccDNA则不能。则不能。3.3.由于缺口或缺刻的存在，由于缺口或缺刻的存在，rcDNA rcDNA 可以被一些核酸酶降解成核苷酸可以被一些核酸酶降解成核苷酸或单核苷酸，而或单核苷酸，而cccDNAcccDNA则由于是则由于是超螺旋且双链结构均

10、完整，一般超螺旋且双链结构均完整，一般不会被上述酶降解。不会被上述酶降解。感染科感染科二二、HBVcccDNAHBVcccDNA的稳定性的稳定性对对HBVcccDNAHBVcccDNA半衰期的认识来自动半衰期的认识来自动物实验。核苷类似物可以抑制胞物实验。核苷类似物可以抑制胞浆内病毒浆内病毒DNADNA的逆转录，从而阻断的逆转录，从而阻断胞浆内病毒胞浆内病毒DNADNA进入细胞核内再形进入细胞核内再形成成cccDNAcccDNA，使人们可以在动物实，使人们可以在动物实验模型中研究验模型中研究cccDNAcccDNA半衰期。半衰期。2006-08-1516 感染科感染科2006-08-1517A

11、ddissonAddisson研究发现，拉米夫定、研究发现，拉米夫定、双脱氧鸟苷前体联合抗病毒治疗双脱氧鸟苷前体联合抗病毒治疗能有效抑制能有效抑制DHBVDHBV的复制，的复制，1 1周后斑周后斑点杂交法检测表明，血清点杂交法检测表明，血清DHBVDNADHBVDNA下降至检测水平以下，肝组织中下降至检测水平以下，肝组织中cccDNAcccDNA呈指数下降，其半衰期为呈指数下降，其半衰期为35-5735-57天。天。感染科感染科2006-08-1518MoraledaMoraleda等通过土拨鼠原代细胞等通过土拨鼠原代细胞抗病毒研究结果显示，抗病毒研究结果显示，cccDNA cccDNA 的的

12、半衰期很长，其清除依赖于感染半衰期很长，其清除依赖于感染细胞的死亡。细胞的死亡。但是也有相反的报道。但是也有相反的报道。尽管用人的原代肝细胞感染尽管用人的原代肝细胞感染HBVHBV，可以观察到可以观察到cccDNAcccDNA的合成和缓慢的合成和缓慢增加，但到目前为止还没有原代增加，但到目前为止还没有原代人肝细胞中人肝细胞中cccDNAcccDNA的半衰期的报的半衰期的报道。道。感染科感染科三、核苷类似物不能阻止初始cccDNAcccDNA的形成DelmasDelmas等研究发现，阿德福韦能等研究发现，阿德福韦能降低培养细胞内降低培养细胞内DHBVDNA(DHBVDNA(包括包括cccDNA)

13、cccDNA)水平，说明病毒感染后起水平，说明病毒感染后起始的病毒基因组向始的病毒基因组向cccDNAcccDNA的转换的转换在阿德福韦存在的情况下仍能发在阿德福韦存在的情况下仍能发生，但扩增合成生，但扩增合成cccDNAcccDNA的过程被的过程被抑制。抑制。2006-08-1519 感染科感染科2006-08-1520KockKock等研究发现，阿德福韦、拉等研究发现，阿德福韦、拉米夫定都可以部分抑制病毒感染米夫定都可以部分抑制病毒感染后初始的后初始的cccDNA cccDNA 转换，前者作用转换，前者作用更强，但是，即使联合用药也不更强，但是，即使联合用药也不能完全抑制初始能完全抑制初始

14、cccDNA cccDNA 的转换。的转换。因此，说明抗病毒药物治疗期间因此，说明抗病毒药物治疗期间HBVHBV仍有能力感染新的肝细胞，给仍有能力感染新的肝细胞，给抗病毒治疗带来困难，因而对慢抗病毒治疗带来困难，因而对慢乙肝患者需要长期使用抗病毒药乙肝患者需要长期使用抗病毒药物治疗。物治疗。感染科感染科四、四、HBVcccDNAHBVcccDNA检测方法检测方法1.1.细胞内细胞内cccDNAcccDNA的抽提与纯化的抽提与纯化 最常用的抽提细胞内最常用的抽提细胞内cccDNAcccDNA的方法是蛋白质去污剂沉淀的方法是蛋白质去污剂沉淀法，其原理是基于法，其原理是基于rcDNArcDNA和和c

15、ccDNAcccDNA与蛋白质结合能力的差与蛋白质结合能力的差异。异。rcDNArcDNA能与蛋白质共价结合，与绝大多数细胞染色体能与蛋白质共价结合，与绝大多数细胞染色体DNADNA一起形成沉淀，而一起形成沉淀，而cccDNAcccDNA不能与蛋白质结合故游离于不能与蛋白质结合故游离于上清中，用酚氯仿抽提上清即可得到上清中，用酚氯仿抽提上清即可得到cccDNAcccDNA。根据。根据缪晓辉缪晓辉等等的经验，该方法的主要缺点是：抽提较为费时，一般需的经验，该方法的主要缺点是：抽提较为费时，一般需要要4-54-5小时；酚氯仿抽提环节多、得率不高；对于冻存的小时；酚氯仿抽提环节多、得率不高；对于冻存

16、的富集细胞（富集细胞（pelletpellet）难以充分裂解，单裂解这一步可能需）难以充分裂解，单裂解这一步可能需要要3-43-4小时甚至更长时间。此外，在上清中实际仍然含有小时甚至更长时间。此外，在上清中实际仍然含有少量的少量的rcDNArcDNA，而在沉淀中实际上也存在着一部分，而在沉淀中实际上也存在着一部分cccDNAcccDNA。2006-08-1521 感染科感染科2006-08-1522为进一步分离为进一步分离cccDNAcccDNA、rcDNArcDNA和单链和单链DNADNA，可以对抽提产物进行纯化。以酶切法最为可以对抽提产物进行纯化。以酶切法最为常用。外切核酸酶常用。外切核酸

17、酶是一种是一种3 355外切外切酶，对带有钝端、酶，对带有钝端、5 5突出端或有缺口的双突出端或有缺口的双链具有特异性，而不能降解带有链具有特异性，而不能降解带有3 3突出端突出端（至少（至少4 4个碱基）的双链个碱基）的双链DNADNA。绿豆核酸酶。绿豆核酸酶则以内切方式降解单链则以内切方式降解单链DNADNA或或RNARNA，而保持，而保持双链双链DNADNA的完整性（二者的比活性的完整性（二者的比活性10001000），），可用于选择性切除双链可用于选择性切除双链DNADNA的突出单链末端，的突出单链末端，以及切除单链以及切除单链DNADNA或或RNARNA。也可单用绿豆核。也可单用绿豆

18、核酸酶酶切酸酶酶切rcDNArcDNA，或先用外切核酸酶，或先用外切核酸酶将将rcDNArcDNA降解成单链，然后再用绿豆核酸酶酶降解成单链，然后再用绿豆核酸酶酶切。切。感染科感染科2006-08-1523该方法也有其缺点：如抽提产物被稀该方法也有其缺点：如抽提产物被稀释，降低了检测敏感度；绿豆核酸酶释，降低了检测敏感度；绿豆核酸酶的反应缓冲液对的反应缓冲液对PCRPCR反应有抑制作用反应有抑制作用等。等。缪晓辉等缪晓辉等尝试用小量质粒抽提试剂盒尝试用小量质粒抽提试剂盒抽提去抽提抽提去抽提HepG2.2.15HepG2.2.15细胞内的细胞内的cccDNAcccDNA，结果发现得率比上述所用方

19、，结果发现得率比上述所用方法均要高，操作也简便，所有操作在法均要高，操作也简便，所有操作在3030分钟内就可完成。分钟内就可完成。感染科感染科2006-08-15242.cccDNA2.cccDNA的定性检测的定性检测 既往绝大多数文献报道的是用既往绝大多数文献报道的是用Southern blotSouthern blot对对cccDNAcccDNA进行定性检测，进行定性检测，该方法是分子生物学的经典方法，但该方法是分子生物学的经典方法，但技术要求较高，敏感度低。技术要求较高，敏感度低。感染科感染科2006-08-1525近年来，也有较多文献报道用近年来，也有较多文献报道用PCRPCR技术对技

20、术对cccDNAcccDNA进行检测。但是，由于进行检测。但是，由于PCRPCR技术灵敏度极高，技术灵敏度极高，rcDNArcDNA和和cccDNAcccDNA的序列又具有高度的同源性，因的序列又具有高度的同源性，因此在用此在用PCRPCR技术检测技术检测cccDNAcccDNA时，必须确保只能扩时，必须确保只能扩增增cccDNAcccDNA而而rcDNArcDNA不被扩增。目前利用不被扩增。目前利用rcDNArcDNA和和cccDNAcccDNA结构上的差异可以解决这一问题。由于结构上的差异可以解决这一问题。由于rcDNArcDNA的正链和负链上均存在缺口，故可以设计的正链和负链上均存在缺口

21、，故可以设计跨越两个缺口的引物，使跨越两个缺口的引物，使rcDNArcDNA不会被扩增，而不会被扩增，而cccDNAcccDNA由于是完整的双链结构则可以被选择性扩由于是完整的双链结构则可以被选择性扩增。同时可设计另一对不跨越缺口的引物或只跨增。同时可设计另一对不跨越缺口的引物或只跨越一条链的缺口的引物同时检测越一条链的缺口的引物同时检测cccDNAcccDNA和和rcDNArcDNA 图图11。KockKock等成功地用这种选择性等成功地用这种选择性PCRPCR的方法在的方法在检测感染细胞内的检测感染细胞内的cccDNAcccDNA和和rcDNArcDNA。感染科感染科2006-08-152

22、6此外，为进一步提高检测的灵敏度，此外，为进一步提高检测的灵敏度，可用套式可用套式PCR(nested PCR)PCR(nested PCR)的方法。的方法。感染科感染科2006-08-1527 感染科感染科 2006-08-1528但是有报道认为跨缺口引物对两种但是有报道认为跨缺口引物对两种DNADNA的选择性不是绝对的，在的选择性不是绝对的，在PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA时，起始模板量不能过高，否时，起始模板量不能过高，否则则rcDNArcDNA也有可能被扩增，也有可能被扩增，KockKock等发现等发现每个每个PCRPCR反应管中反应管中HBV DNAHBV DNA的量在

23、的量在1 1 pgpg（约（约6 6105105拷贝）时能达到最佳的拷贝）时能达到最佳的灵敏度与选择性，因此在分析前应估灵敏度与选择性，因此在分析前应估计标本中计标本中HBV DNAHBV DNA的量。虽然套式的量。虽然套式PCRPCR更为灵敏，但由于需取更为灵敏，但由于需取PCRPCR产物进行再产物进行再次扩增，因此在操作中要注意防止次扩增，因此在操作中要注意防止PCRPCR产物污染，避免假阳性。产物污染，避免假阳性。感染科感染科2006-08-15293.cccDNA3.cccDNA的定量检测的定量检测在定性检测的基础上，可以进一步对在定性检测的基础上，可以进一步对cccDNAcccDNA

24、进行定量检测。仍以进行定量检测。仍以PCRPCR定量分析技定量分析技术中，尤其是竞争术中，尤其是竞争PCRPCR技术的敏感性和精确技术的敏感性和精确度高。方法是在度高。方法是在PCRPCR反应管中加入一种已知反应管中加入一种已知量的、能与野生模板等效扩增的内参照，量的、能与野生模板等效扩增的内参照，内参照是经过突变处理的，其两端尤其是内参照是经过突变处理的，其两端尤其是引物退火区的序列与野生模板相同。引物退火区的序列与野生模板相同。PCRPCR扩扩增后通过一定的方法将野生片段与突变片增后通过一定的方法将野生片段与突变片段区分开，分别计算其绝对量，或求出其段区分开，分别计算其绝对量，或求出其相对

25、比值，就可以推算相对比值，就可以推算PCRPCR扩增以前野生模扩增以前野生模板的量。板的量。感染科感染科2006-08-1530HeHe等建立了实时荧光定量等建立了实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA的方法。的方法。他们将他们将Taqman MGBTaqman MGB探针设计在负链缺刻的下游，探针设计在负链缺刻的下游，与负链互补结合。对与负链互补结合。对cccDNAcccDNA，在上游引物的引导，在上游引物的引导下，下，TaqTaq酶到达酶到达Taqman MGBTaqman MGB探针所结合的位点，探针所结合的位点，利用其利用其5 533外切活性将探针切断，外切活性将探针

26、切断，3 3端的端的淬灭基团失去对淬灭基团失去对5 5端的发光基团的抑制作用，端的发光基团的抑制作用，从而产生荧光信号。每扩增一个从而产生荧光信号。每扩增一个cccDNAcccDNA分子，就分子，就会产生一个荧光信号，会产生一个荧光信号，PCRPCR仪可对产生的信号进仪可对产生的信号进行实时监测，根据荧光信号的强弱对行实时监测，根据荧光信号的强弱对cccDNAcccDNA进行进行定量。对定量。对rcDNArcDNA，由于上游引物引发的链延伸不，由于上游引物引发的链延伸不能通过负链缺刻，故不能使能通过负链缺刻，故不能使Taqman MGBTaqman MGB探针被探针被TaqTaq酶切断产生荧光

27、信号。该方法的特异性比选酶切断产生荧光信号。该方法的特异性比选择性择性PCRPCR进一步提高，可以消除高进一步提高，可以消除高rcDNArcDNA背景可能背景可能产生的非特异性扩增。该方法的检测低限可达产生的非特异性扩增。该方法的检测低限可达100100个拷贝，灵敏度比目前应用的任何一种其它个拷贝，灵敏度比目前应用的任何一种其它方法都高。所有检测在方法都高。所有检测在2 2小时内可完成。小时内可完成。感染科感染科2006-08-1531还有其他一些更为敏感的检测方法，还有其他一些更为敏感的检测方法，如如ShaoShao等报告的两步法对等报告的两步法对cccDNAcccDNA进行进行实时荧光定量

28、。其设计与实时荧光定量。其设计与HeHe等的方法等的方法有异曲同工之处，即都是利用有异曲同工之处，即都是利用rcDNArcDNA与与cccDNAcccDNA分子结构上是否完整来有效地分子结构上是否完整来有效地将二者区分开来，实现对将二者区分开来，实现对cccDNAcccDNA的特的特异性检测。异性检测。感染科感染科2006-08-1532该方法在荧光探针位置的选择上更符该方法在荧光探针位置的选择上更符合荧光合荧光PCRPCR的要求，即探针越靠近引物的要求，即探针越靠近引物效果越好，这样检测到的荧光信号质效果越好，这样检测到的荧光信号质量和实时扩增曲线形状可能更佳，而量和实时扩增曲线形状可能更佳

29、，而在在HeHe等的方法中探针与上游引物点之等的方法中探针与上游引物点之间的距离则至少需要在间的距离则至少需要在230230个碱基以上。个碱基以上。但是，该方法存在与套式但是，该方法存在与套式PCRPCR类似的缺类似的缺点，即需要分两步操作，单链延伸反点，即需要分两步操作，单链延伸反应管开盖后极有可能造成产物污染。应管开盖后极有可能造成产物污染。感染科感染科五、慢性乙肝患者五、慢性乙肝患者cccDNAcccDNA检测的意义检测的意义第一，第一，cccDNAcccDNA可作为评价抗乙肝病毒可作为评价抗乙肝病毒药物的新指标。药物的新指标。目前临床上评价干扰素、核苷类似物目前临床上评价干扰素、核苷类

30、似物这些抗乙肝病毒药物时存在一个很大这些抗乙肝病毒药物时存在一个很大的问题。的问题。即其评价指标主要是患者肝功能的改即其评价指标主要是患者肝功能的改善与否、血清乙肝病毒善与否、血清乙肝病毒DNADNA水平的变化水平的变化以及肝组织的病理学改变等。以及肝组织的病理学改变等。2006-08-1533 感染科感染科2006-08-1534诚然，这些指标对临床医师判断诚然，这些指标对临床医师判断患者病情而言非常重要和实用，患者病情而言非常重要和实用，也是临床医师选用抗乙肝病毒药也是临床医师选用抗乙肝病毒药物时的依据。物时的依据。然而对于何时停用抗病毒药物、然而对于何时停用抗病毒药物、停用抗病毒药物后乙

31、肝病毒是否停用抗病毒药物后乙肝病毒是否会重新复制活跃导致乙肝复发，会重新复制活跃导致乙肝复发，则缺乏客观而有效的指标。则缺乏客观而有效的指标。感染科感染科2006-08-1535开展肝细胞内乙肝病毒开展肝细胞内乙肝病毒cccDNAcccDNA的动态的动态定量监测可以部分解决这个问题。定量监测可以部分解决这个问题。治疗前后肝细胞内乙肝病毒治疗前后肝细胞内乙肝病毒cccDNAcccDNA含含量的变化应该纳入到抗乙肝病毒药物量的变化应该纳入到抗乙肝病毒药物评价的指标体系中来，从一定意义上评价的指标体系中来，从一定意义上说，只有能够彻底清除乙肝病毒说，只有能够彻底清除乙肝病毒cccDNAcccDNA的

32、药物，才能算是真正的药物，才能算是真正“有效有效”的抗病毒药物。的抗病毒药物。感染科感染科2006-08-1536第二，检测乙肝病毒第二，检测乙肝病毒cccDNAcccDNA可作为评价乙可作为评价乙肝病毒是否能感染肝外组织的客观指标之肝病毒是否能感染肝外组织的客观指标之一。乙肝病毒不仅仅是一种嗜肝病毒，一一。乙肝病毒不仅仅是一种嗜肝病毒，一些肝外组织中也可检测到乙肝病毒些肝外组织中也可检测到乙肝病毒DNADNA，如，如肾脏、胰腺以及外周血单个核细胞肾脏、胰腺以及外周血单个核细胞(PBMC)(PBMC)等。等。早就有人发现乙肝病毒可以感染白细胞早就有人发现乙肝病毒可以感染白细胞,而这种免疫细胞的

33、感染似乎而这种免疫细胞的感染似乎有利于病毒逃避免疫反应，从而导致机体清除乙肝病毒的能力下降。有利于病毒逃避免疫反应，从而导致机体清除乙肝病毒的能力下降。关于关于PBMCPBMC能否被乙肝病毒感染的问题目前仍有争议，其中一个重要能否被乙肝病毒感染的问题目前仍有争议，其中一个重要的原因是没有确立的原因是没有确立PBMCPBMC被感染的标准。被感染的标准。我们认为把我们认为把PBMCPBMC细胞内是否存在细胞内是否存在cccDNAcccDNA作为判断感染的标准是最可作为判断感染的标准是最可靠的。靠的。cccDNAcccDNA的形成是乙肝病毒的侵入细胞后在细胞内进行复制的起始步的形成是乙肝病毒的侵入细

34、胞后在细胞内进行复制的起始步骤，也是转录合成前基因组骤，也是转录合成前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)RNA(pregenomic RNA,pgRNA)的前体，是的前体，是建立病毒感染状态的最重要标志，没有建立病毒感染状态的最重要标志，没有cccDNAcccDNA的形成也就没有其后的形成也就没有其后的一系列过程。的一系列过程。感染科感染科2006-08-1537KockKock等用乙肝病毒去感染体外培养的等用乙肝病毒去感染体外培养的PBMCsPBMCs时，发现不能在细胞内检测到时，发现不能在细胞内检测到cccDNAcccDNA，相反，如果转染的是肝细胞，相反，如果转染的

35、是肝细胞，则非常容易检测到则非常容易检测到cccDNAcccDNA。此外，在。此外，在乙肝患者的肝组织内，能检测到乙肝患者的肝组织内，能检测到cccDNAcccDNA和和rcDNArcDNA，而在其，而在其PBMCPBMC中，则只中，则只能检测到能检测到rcDNArcDNA。感染科感染科2006-08-1538认为乙肝病毒是不能感染认为乙肝病毒是不能感染PBMCPBMC，即使，即使PBMCPBMC中检测到乙肝病毒，也只是血液中检测到乙肝病毒，也只是血液的病毒的病毒DNADNA与与PBMCPBMC表面牢固结合，不易表面牢固结合，不易被被PBSPBS等洗涤下来，抽提细胞所得到的等洗涤下来，抽提细胞

36、所得到的病毒病毒DNADNA其实并不存在于细胞内；或病其实并不存在于细胞内；或病毒仅仅是被毒仅仅是被PBMCPBMC所所“吸收吸收”(absorption)(absorption)，并没有建立真正意，并没有建立真正意义上的感染状态。义上的感染状态。这一实验结果给我们很多启发，也加这一实验结果给我们很多启发，也加深了对乙肝病毒感染的认识。深了对乙肝病毒感染的认识。感染科感染科2006-08-1539第三，检测乙肝病毒第三，检测乙肝病毒cccDNAcccDNA可评价可评价乙肝患者病情。缪晓辉等用选择性荧乙肝患者病情。缪晓辉等用选择性荧光定量光定量PCRPCR对对9393例乙肝患者血清作回例乙肝患者

37、血清作回顾性分析时，发现顾性分析时，发现2424例患者血清例患者血清HBVcccDNAHBVcccDNA呈阳性，其中慢性乙肝中呈阳性，其中慢性乙肝中度以上的病例占度以上的病例占70%70%以上。以上。感染科感染科2006-08-1540缪晓辉等缪晓辉等用选择性荧光定量用选择性荧光定量PCRPCR对对9393例乙肝患者例乙肝患者血清作回顾性分析时，发现血清作回顾性分析时，发现2424例患者血清例患者血清cccDNAcccDNA呈阳性，其中急性乙肝呈阳性，其中急性乙肝1 1例，慢性乙肝（轻度）例，慢性乙肝（轻度）6 6例，慢性乙肝（中度）例，慢性乙肝（中度）6 6例，慢性乙肝（重度）例，慢性乙肝（

38、重度）3 3例，肝炎肝硬化例，肝炎肝硬化2 2例，慢性乙肝（重型）例，慢性乙肝（重型）6 6例，其例，其中慢性乙肝（中度）以上的病例占中慢性乙肝（中度）以上的病例占70%70%以上。虽以上。虽然经过统计学分析还不能看出显著差异，样本量然经过统计学分析还不能看出显著差异，样本量还不够大，血清还不够大，血清cccDNAcccDNA阳性与病情的轻重是否存阳性与病情的轻重是否存在某种关系还有待于进一步的深入研究。但是，在某种关系还有待于进一步的深入研究。但是，从理论上推测，既然存在于肝细胞胞质和线粒体从理论上推测，既然存在于肝细胞胞质和线粒体中的转氨酶等酶类在肝细胞被破坏时能释放到血中的转氨酶等酶类在

39、肝细胞被破坏时能释放到血液中，那么存在于肝细胞核内的液中，那么存在于肝细胞核内的cccDNAcccDNA分子在肝分子在肝细胞变性、坏死时应该也可以释放到血液中，而细胞变性、坏死时应该也可以释放到血液中，而且病情越严重，变性坏死的细胞越多，对于同一且病情越严重，变性坏死的细胞越多，对于同一个患者而言，在某一时间段内，其血液中的个患者而言，在某一时间段内，其血液中的cccDNAcccDNA水平应该也相应地越高，对判断病情有意水平应该也相应地越高，对判断病情有意义。义。感染科感染科2006-08-1541虽然经过统计学分析还不看出显著差虽然经过统计学分析还不看出显著差异，样本量还不够大，血清异，样本

40、量还不够大，血清HBVcccDNAHBVcccDNA阳性与病情的轻重是否存在某种关系阳性与病情的轻重是否存在某种关系还有待于进一步的深入研究。还有待于进一步的深入研究。目前通过肝活检来监测乙肝患者肝组织中的目前通过肝活检来监测乙肝患者肝组织中的cccDNAcccDNA水平变化存在着一定困难，因而监测血液水平变化存在着一定困难，因而监测血液中的中的cccDNAcccDNA的动态变化也许更具有现实意义。当的动态变化也许更具有现实意义。当然，其中还存在一些问题有待研究和解决，比如然，其中还存在一些问题有待研究和解决，比如血液中的血液中的cccDNAcccDNA水平远远低于肝组织中的水平远远低于肝组织

41、中的cccDNAcccDNA水平，也远远低于血液中的的水平，也远远低于血液中的的rcDNArcDNA水平，因此水平，因此必须进一步提高必须进一步提高cccDNAcccDNA定量检测的灵敏度。定量检测的灵敏度。感染科感染科2006-08-1542但是，从理论上推测，既然存在但是，从理论上推测，既然存在于肝细胞胞质和线粒体中的转氨于肝细胞胞质和线粒体中的转氨酶等酶类在肝细胞被破坏时能释酶等酶类在肝细胞被破坏时能释放到血液中，那么存在于肝细胞放到血液中，那么存在于肝细胞核内的核内的cccDNAcccDNA分子在肝细胞变性、分子在肝细胞变性、坏死时应该也可以释放到血液中，坏死时应该也可以释放到血液中，

42、而且病情越严重，变性坏死的细胞越而且病情越严重，变性坏死的细胞越多，对于同一例患者而言，在某一时多，对于同一例患者而言，在某一时间段内，其血液中的间段内，其血液中的cccDNAcccDNA水平应该水平应该也相应地越高，对判断病情有意义。也相应地越高，对判断病情有意义。感染科感染科2006-08-1543目前通过肝活检来监测乙肝患者目前通过肝活检来监测乙肝患者肝组织中的肝组织中的cccDNAcccDNA水平变化存在水平变化存在着一定困难，因而监测血液中着一定困难，因而监测血液中cccDNAcccDNA的动态变化也许更具有现的动态变化也许更具有现实意义。实意义。感染科感染科2006-08-1544

43、当然，目前还存在一些问题有待当然，目前还存在一些问题有待研究和解决，例如血液中研究和解决，例如血液中HBVcccDNAHBVcccDNA的水平远远低于肝组织的水平远远低于肝组织中的水平，也远远低于血液中的中的水平，也远远低于血液中的松弛环状松弛环状DNA(rcDNA)DNA(rcDNA)水平，因此水平，因此必须进一步提高必须进一步提高cccDNAcccDNA定量检测定量检测的灵敏度的灵敏度。感染科感染科 六、如何清除六、如何清除HBVcccDNAHBVcccDNA？目前认为有两种策略：目前认为有两种策略：通过有效的、长疗程抗通过有效的、长疗程抗HBVHBV药物药物治疗，可长期、明显抑制治疗，可

44、长期、明显抑制HBVHBV外源外源性感染性感染(HBV(HBV不断感染肝细胞不断感染肝细胞)和内和内源性复制源性复制(HBV(HBV在细胞内不断复制在细胞内不断复制)，可持续减少和阻断对，可持续减少和阻断对HBV HBV cccDNAcccDNA库的补充，最后达到耗竭库的补充，最后达到耗竭的目的。的目的。2006-08-1545感染科感染科2006-08-1546打破免疫耐受，消除免疫耐打破免疫耐受，消除免疫耐受，提高人体免疫功能，尤其受，提高人体免疫功能，尤其是特异性细胞免疫功能，通过是特异性细胞免疫功能，通过细胞溶解机制和非细胞溶解机细胞溶解机制和非细胞溶解机制，消除细胞内、外的制，消除细

45、胞内、外的HBVHBV，包，包括括HBV cccDNAHBV cccDNA，这是根治，这是根治HBVHBV十十分重要的治疗措施。分重要的治疗措施。感染科感染科 2006-08-1547但由于免疫耐受的机制迄今尚不但由于免疫耐受的机制迄今尚不清楚，目前尚无有效治疗方法。清楚，目前尚无有效治疗方法。而免疫耐受的机制和程度，个体而免疫耐受的机制和程度，个体差异很大，治疗效果亦不同。差异很大，治疗效果亦不同。到目前为止，尚无针对免疫耐受到目前为止，尚无针对免疫耐受有效的特异性免疫治疗，各种治有效的特异性免疫治疗，各种治疗性疫苗尚在研究中。疗性疫苗尚在研究中。研究研究HBVHBV感染的免疫耐受机制，虽感

46、染的免疫耐受机制，虽然难度很大，但这是治疗然难度很大，但这是治疗HBVHBV感染感染的根本措施，应加强研究。的根本措施，应加强研究。感染科感染科七、七、cccDNAcccDNA在抗病毒治疗在抗病毒治疗研究中的应用前景研究中的应用前景乙型肝炎患者肝组织中乙型肝炎患者肝组织中cccDNAcccDNA是观察是观察抗病毒疗效的重要指标。抗病毒疗效的重要指标。目前肝组织中目前肝组织中cccDNAcccDNA定量检测还没有定量检测还没有成为常规检查手段，但是在开展新的成为常规检查手段，但是在开展新的抗病毒药物或抗病毒药物新的组合临抗病毒药物或抗病毒药物新的组合临床实验中，可以根据肝组织中床实验中，可以根据

47、肝组织中cccDNAcccDNA定量来确定治疗终点。定量来确定治疗终点。2006-08-1548 感染科感染科2006-08-1549上述临床实验不但可以帮助制定上述临床实验不但可以帮助制定抗病毒疗程，还有助于认识病毒抗病毒疗程，还有助于认识病毒的清除或病毒产生耐药的机制。的清除或病毒产生耐药的机制。血清血清cccDNAcccDNA定量检测、定量检测、HBsAgHBsAg的定的定量检查是否可以作为一种非创伤量检查是否可以作为一种非创伤性的检查来替代肝组织中性的检查来替代肝组织中cccDNAcccDNA定量检测还有待于进一步的验证。定量检测还有待于进一步的验证。感染科感染科2006-08-1550 感染科感染科