第七章酶及其动力学.ppt

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1、定义定义：酶：酶是是生物细胞产生的、具有催化能力的生生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。物催化剂。酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。生物学意义生物学意义 能在体内十分温和的条件下高效率地起催化作用，能在体内十分温和的条件下高效率地起催化作用，并通过自我调节使生物体内各种物质处于不断的并通过自我调节使生物体内各种物质处于不断的有序的代谢之中。有序的代谢之中。一、酶的概念一、酶的概念第一节第一节 概述概述有关概念有关概念 酶促反应酶促反应 底物（底物（S）产物（产物（

2、P）途径途径 循环循环 原始底物原始底物 中间产物中间产物 最终产物最终产物表示方法表示方法SsP1E1p1PiE2s1piPnEisipnPEnsnpS PES PE酶酶具有一般催化剂的特征具有一般催化剂的特征 1.只能进行热力学上允许进行只能进行热力学上允许进行的反应；的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；反应的平衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。通过降低活化能加快化学反应速度。二、酶作用的特点二、酶作用的特点2.专一性：酶对底物具有严格的选择性。专一性：酶对底物具有严格的选择性。3.敏感性：对环境条件极为敏感，易

3、于失活。敏感性：对环境条件极为敏感，易于失活。4.可调性：酶活性的调节和酶合成速度的调节。可调性：酶活性的调节和酶合成速度的调节。酶的催化特点酶的催化特点 1.高效性：通常要高出非生物催化剂催化活性的高效性：通常要高出非生物催化剂催化活性的1061013倍。倍。2H2O22H2O +O21mol过氧化氢酶过氧化氢酶 5106molH2O21mol离子铁离子铁 610-4molH2O21、酶的化学本质、酶的化学本质蛋白质蛋白质1926年年J.B.Sumner首次从刀豆制备出脲酶结晶，证明其为首次从刀豆制备出脲酶结晶，证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点。蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质

4、的观点。酶是酶是蛋白质的证据：其组成、结构、性质与蛋白质一样蛋白质的证据：其组成、结构、性质与蛋白质一样三、酶的化学本质与组成三、酶的化学本质与组成 2、化学组成、化学组成酶酶单纯酶单纯酶结合酶结合酶（全酶）全酶）=酶蛋白酶蛋白+辅因子辅因子辅因子辅因子辅酶辅酶：与：与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。辅基辅基：与酶蛋白结合得紧密的小分子有机物。与酶蛋白结合得紧密的小分子有机物。金属激活剂金属激活剂：金属离子作为辅助因子。金属离子作为辅助因子。酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分，辅因子通常是酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分，辅因子通常是作为电子、原子或某些化

5、学基团的载体。作为电子、原子或某些化学基团的载体。3、单体酶、寡聚酶和多酶复合物、单体酶、寡聚酶和多酶复合物单体酶（单体酶（monomeric enzyme)：仅有一条具有活性部位的多仅有一条具有活性部位的多肽链，全部参与水解反应。肽链，全部参与水解反应。寡聚酶寡聚酶(oligomeric enzyme)：由几个或多个亚基组成，亚由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。共价键结合。多酶复合物多酶复合物(multienzyme system)：几个酶镶嵌而成的复合几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化

6、将底物转化为产物的一系列顺序反应。物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。例如例如丙酮酸脱氢酶系（丙酮酸脱氢酶系（E.coli）：）：丙酮酸脱氢酶（丙酮酸脱氢酶（E）、）、硫硫辛酰转乙酰酶（辛酰转乙酰酶（E）和二氢硫辛酰脱氢酶（和二氢硫辛酰脱氢酶（E）。）。EEE碱性碱性EEE+EE+脲脲1、酶的分类、酶的分类1961年国际酶学委员会（年国际酶学委员会（Enzyme Committee,EC）根据根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：大类：1.氧化还原酶类：氧化还原酶类：主要催化氢的转移或电子传递的氧化还主要催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应

7、。原反应。AH2+B（O2）A+BH2（H2O2，H2O）（1）脱氢酶类：）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应。催化直接从底物上脱氢的反应。AH2+BA+BH2（需（需辅酶辅酶或辅酶或辅酶）四、酶的分类与命名四、酶的分类与命名（2）氧化酶类）氧化酶类催化底物脱氢，氧化生成催化底物脱氢，氧化生成H2O2：AH2+O2A+H2O2（需（需FAD或或FMN）催化底物脱氢，氧化生成催化底物脱氢，氧化生成H2O：2AH2+O22A+2H2O（3）过氧化物酶）过氧化物酶ROO+H2O2RO+H2O+O2（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）O2+OHOHC=OC=OOHOH（顺，

8、顺顺，顺-已二烯二酸）已二烯二酸）RH+O2+还原型辅助因子还原型辅助因子ROH+H2O+氧化型辅助因子氧化型辅助因子（又称（又称羟化酶羟化酶）2.转移酶类：转移酶类：催化化合物中某些基团的转移。催化化合物中某些基团的转移。AX+BA+BX根据根据X分成分成8个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。3.水解酶类：水解酶类：催化加水分解作用。催化加水分解作用。AB+H2OAOH+BH4.裂解酶类：裂解酶类：催化非水解性地除去基团而形成双键的反应催化非水解性地除去基团而形成双键的反应或逆

9、反应。或逆反应。CH3C=OCOOHCC键键CH3C=OH+CO2CO键键CH2COOHHOCHCOOHHCCOOHHOOCCH+H2OCN键键COOHCHNH2CH2COOHCOOHCHHCCOOH+NH35.异构酶：异构酶：催化催化 各种异构体之间的互变。各种异构体之间的互变。AB常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。6.合成酶类：合成酶类：催化有催化有ATP参加的合成反应。参加的合成反应。A+B+ATPAB+ADP+Pi乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 EC 1.1.1.27第第1大类，氧化还原酶大类，氧化还原酶第第1亚类，氧化基团亚类，氧

10、化基团CHOH第第1亚亚类，亚亚类，H受体为受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号该酶在亚亚类中的流水编号编号编号EC：n1.n2.n3.n4EC 国际酶学委员会国际酶学委员会 n1 据反应性质分六大类据反应性质分六大类 n1=16 n2 n1下再分亚类下再分亚类 n2=1i n3 n2下再分亚亚类下再分亚亚类 n3=1i n4 在在亚亚类中的排行亚亚类中的排行 n4=1iEC：1.1.1.x催化的反应都是催化的反应都是 -C-OHNAD（P）-CO-HNAD（P）HH黄嘌呤氧化酶黄嘌呤氧化酶 EC：1.2.3.2 第第1大类，氧化还原酶大类，氧化还原酶第第2亚类，氧化基团亚类，氧化基团-CO

11、-第第3亚亚类，亚亚类，H受体为受体为O2该酶在亚亚类中的流水编号该酶在亚亚类中的流水编号2、酶的命名、酶的命名 有两种方法：有两种方法：系统名系统名、惯用名惯用名。系统名系统名：底物名称：底物名称反应类型酶：底物名称：底物名称反应类型酶乳酸乳酸+NAD+丙酮酸丙酮酸+NADH+H+乳酸：乳酸：NAD+氧化还原酶氧化还原酶惯用名：惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型，有的加来源。只取一个较重要的底物名称和反应类型，有的加来源。乳酸：乳酸：NAD+氧化还原酶氧化还原酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。蛋白

12、质水解酶蛋白质水解酶（胰、胃、木瓜）蛋白酶（胰、胃、木瓜）蛋白酶1、酶作用的专一性、酶作用的专一性酶酶作用的作用的专一性专一性结构专一性结构专一性立体异构专一性立体异构专一性族（基团）专一性族（基团）专一性绝对专一性绝对专一性相对专一性相对专一性五、酶作用的专一性五、酶作用的专一性族族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。RCOO-+R OH+H+酯酶：酯酶：RCOR+H2OOOCH2OHOHOHOH15-葡萄糖葡萄糖苷酶苷酶O R+H2OOCH2OHOHOHOHOH15+ROH绝对专一性：只能作用于某一底物。绝对专一性：只能作用于某一底物。脲

13、酶：脲酶：H2NCNH2+H2OO2NH3+CO2立体异构专一性立体异构专一性旋光异构专一性旋光异构专一性几何异构专一性几何异构专一性D-、L-；、顺、反顺、反2、专一性机理、专一性机理 锁钥学说锁钥学说 诱导契合学说诱导契合学说 见下章见下章1、酶活力的测定、酶活力的测定（1）活力）活力 酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。用在一定条件下所催化的某一化学反应的速度来表示。用在一定条件下所催化的某一化学反应的速度来表示。速度测定原则速度测定原则 测初速度测初速度 （S/S05%）S/P易测者，但以易测者，但以P为佳为佳 SE，条件最适，无抑制激活剂条件最适，

14、无抑制激活剂六、酶活力测定及分离纯化六、酶活力测定及分离纯化（2）酶（活力）单位）酶（活力）单位：（U，IU）在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。产物所需的酶量。国际单位国际单位 在最适的反应条件（在最适的反应条件（25）下，每分钟内）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即位，即 1IU=1mol/min卡达尔卡达尔 在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为为产物所需的酶量定为1kat单位，即单位

15、，即 1kat=1mol/s1kat=6107IU自定义自定义（3）比活力）比活力 单位酶制剂中的活力单位数单位酶制剂中的活力单位数 活力单位数活力单位数/毫克或摩尔酶制剂毫克或摩尔酶制剂（4）测定方法）测定方法求出速度，除以活力单位，即为单位数求出速度，除以活力单位，即为单位数速度测定常用方法速度测定常用方法 分光光度法分光光度法 荧光光度法荧光光度法 同位素标记法同位素标记法 电化学法电化学法最常用分光光度法最常用分光光度法 直接比色分析法直接比色分析法 化学偶联分析法化学偶联分析法 酶偶联分析法酶偶联分析法2、分离纯化、分离纯化工业上大多采用工业上大多采用微生物发酵微生物发酵的方法来获得

16、大量酶制剂。的方法来获得大量酶制剂。优点：不受气候、地理条件的限制，动、植物体内的酶大多优点：不受气候、地理条件的限制，动、植物体内的酶大多可从微生物体内找到，微生物繁殖快，产酶量丰富。还可以可从微生物体内找到，微生物繁殖快，产酶量丰富。还可以通过选育菌种来提高酶的产量和用廉价原料大量生产。通过选育菌种来提高酶的产量和用廉价原料大量生产。酶分离纯化的三个基本步骤：抽提，纯化，结晶或制剂。酶分离纯化的三个基本步骤：抽提，纯化，结晶或制剂。方法：方法：1.根据溶解度不同根据溶解度不同（盐析法、有机溶剂沉淀法、等（盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、选择性沉淀法）；电点沉淀法、选择性沉淀法）；2.

17、根据酶与杂蛋白分子大根据酶与杂蛋白分子大小的差别小的差别（凝胶过滤法、超离心法）；（凝胶过滤法、超离心法）；3.根据酶和杂蛋白根据酶和杂蛋白与吸附剂之间吸附与解吸附性质的不同与吸附剂之间吸附与解吸附性质的不同（吸附分离法）；（吸附分离法）；4.根据带电性质根据带电性质（离子交换层析法、电泳分离法、等电聚（离子交换层析法、电泳分离法、等电聚焦层析法）；焦层析法）；5.根据酶与杂蛋白的稳定性差别根据酶与杂蛋白的稳定性差别（选择性变（选择性变性法）；性法）；6.根据酶与底物、辅因子或抑制剂之间的专一性根据酶与底物、辅因子或抑制剂之间的专一性亲和作用亲和作用（亲和层析法）。（亲和层析法）。酶的纯化倍数

18、与产率计算酶的纯化倍数与产率计算：比活力比活力=活力单位数活力单位数/毫克蛋白（氮）毫克蛋白（氮）纯化倍数纯化倍数=每次比活力每次比活力第一次比活力第一次比活力产率产率%（回收率）（回收率）=100每次总活力每次总活力第一次总活力第一次总活力酶的纯化鉴定酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法等：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法等 酶的保存酶的保存：1、低温（、低温（04，-20）；）；2、高浓度较稳定；、高浓度较稳定；3、加入稳定剂；、加入稳定剂；4、固定化；、固定化；5、干燥。、干燥。1、核酶、核酶 具有催化功能的具有催化功能的RNA。2、抗体酶、抗体酶 具有催化功能的免疫球

19、蛋白（抗体）。具有催化功能的免疫球蛋白（抗体）。3、同工酶、同工酶 催化相同反应但组成、结构、调节、分布催化相同反应但组成、结构、调节、分布 等不同等不同的一组酶的一组酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶（LDH）MHMM MMM4HMMMM3HMMHHM2H2MHHHMH3HHHHH4七、核酶、抗体酶、同工酶七、核酶、抗体酶、同工酶酶工程酶工程研究酶的生产、纯化、固定化、修饰和改造以及在研究酶的生产、纯化、固定化、修饰和改造以及在工、农、医、科学等领域的应用的技术。工、农、医、科学等领域的应用的技术。1、化学酶工程、化学酶工程通过对酶的化学修饰、固定化处理，改善其性质以提高通过对酶的化学修饰、固定化处理，

20、改善其性质以提高酶效率和降低成本，甚至人工合成酶的技术。酶效率和降低成本，甚至人工合成酶的技术。天然酶天然酶 修饰酶修饰酶 固定化酶固定化酶人工模拟酶人工模拟酶提取、纯化的酶提取、纯化的酶 给酶加减基团后性能改变的酶给酶加减基团后性能改变的酶 不溶于水而保持活性的不溶于水而保持活性的酶酶 人工合成的有催化活性的有机分子。人工合成的有催化活性的有机分子。八、酶工程简介八、酶工程简介2、生物酶工程、生物酶工程用基因重组技术生产或对酶基因修饰或设计新基因，用基因重组技术生产或对酶基因修饰或设计新基因，从而生产性能稳定、具有新的生物活性及催化效率从而生产性能稳定、具有新的生物活性及催化效率更高的酶的技

21、术。更高的酶的技术。克隆酶克隆酶突变酶突变酶新酶新酶用基因重组技术由受体生物合成的酶用基因重组技术由受体生物合成的酶对酶基因修饰后导入受体生物合成的酶对酶基因修饰后导入受体生物合成的酶人工设计的基因导入受体生物合成的酶人工设计的基因导入受体生物合成的酶 工业上酶应用的优点：工业上酶应用的优点：1.酶的催化效率高，专一性强，不发生副作用。酶的催化效率高，专一性强，不发生副作用。2.酶作用条件温和。酶作用条件温和。3.酶及其反应产物大多无毒性。酶及其反应产物大多无毒性。九、酶的应用九、酶的应用酶的固定化就是把水溶性酶经酶的固定化就是把水溶性酶经物理（吸附法与包埋物理（吸附法与包埋法）法）或或化学方

22、法（共价偶联法与交联法）化学方法（共价偶联法与交联法）处理后，处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。于水的状态。吸附法吸附法：使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上。：使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上。包埋法包埋法：使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。：使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。偶联法偶联法：使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上。：使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上。交联法交联法：使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成：使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成“

23、网状网状”结构。结构。10 20 30 40 50 60 min产物生成量酶反应进程曲线1、酶促反应速度、酶促反应速度反应速度反应速度 单位时间内底物或产物的变化量单位时间内底物或产物的变化量单分子反应单分子反应 仅有一个底物分子参加的反应仅有一个底物分子参加的反应 v=dc/dt=dc/dt=kc 双分子反应双分子反应 有两个底物分子参加的反应有两个底物分子参加的反应 v=dc/dt=kc1c2第二节第二节 动力学有关概念动力学有关概念2、反应级数、反应级数一级反应一级反应 反应速率只与底物浓度的一次方成正比的反应反应速率只与底物浓度的一次方成正比的反应即单分子反应速度即单分子反应速度二级反

24、应二级反应 反应速率与底物浓度二次方或两种底物浓度反应速率与底物浓度二次方或两种底物浓度 积成正比的反应积成正比的反应 即双分子反应速度即双分子反应速度 但有些双分子反应的级数是一级。但有些双分子反应的级数是一级。如水解反应，水是介质，参与反应的忽略。如水解反应，水是介质，参与反应的忽略。零级反应零级反应 反应速度与底物浓度的反应反应速度与底物浓度的反应3、影响酶促反应速度的因素、影响酶促反应速度的因素影响酶促反应速度的因素有酶浓度、底物浓度、影响酶促反应速度的因素有酶浓度、底物浓度、抑制剂、激活剂、温度、抑制剂、激活剂、温度、pH值值研究某一因素的条件同测定反应速度的条件研究某一因素的条件同

25、测定反应速度的条件 底物浓度对酶反应速度的影响底物浓度对酶反应速度的影响SvVmax一级反应一级反应 v=k S零级反应零级反应 v=k E第三节第三节 底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响1、中间产物学说中间产物学说 Henri和和Hurtz提出提出S +EESE+P当当底物浓度很低时，有多余的酶没与底物结合，随着底底物浓度很低时，有多余的酶没与底物结合，随着底物浓度的增加，中间络合物的浓度不断增高。物浓度的增加，中间络合物的浓度不断增高。当当底物浓度较高时，溶液中的酶全部与底物结合成中间产底物浓度较高时，溶液中的酶全部与底物结合成中间产物，虽增加底物浓度也不会有更多的中

26、间产物生成。物，虽增加底物浓度也不会有更多的中间产物生成。k1k32.米氏方程式（米氏方程式（Michaelis-Menten equation）设设 km=k2+k3k1v=Vmax Skm +S（kmS，v=kS；km S，v=Vmax）k2米切尔、曼顿米切尔、曼顿 平衡态米氏方程推导平衡态米氏方程推导S +EESE+Pk3设酶总浓度为设酶总浓度为E0，底物总浓度为底物总浓度为S，游离酶浓度为游离酶浓度为E=E0ES，剩余底物浓度为剩余底物浓度为S=SES=S v1=K1ES=K1（E0ES）S v2=K2ES v3=K3ES1913年年Michaelis-Menten认为反应认为反应1、

27、2迅速建立平衡，即迅速建立平衡，即 K1（E0ES）S=K2 ES整理得整理得 K2 K1=（E0ES）S ESk2k1定义定义K2/K1为为Ks，命名为中间产物解离常数，命名为中间产物解离常数即即Ks=（E0ES）S ES 解出解出ES得得ES=E0S Ks S 反应速度反应速度v=K3 ES v=K3 E0S Ks S K3 E0=Vmax v=Vmax S Ks SS +EESE+P伯瑞格斯、哈尔丹伯瑞格斯、哈尔丹 稳态米氏方程推导稳态米氏方程推导k3设酶总浓度为设酶总浓度为E0，底物总浓度为底物总浓度为S，游离酶浓度为游离酶浓度为E=E0ES，剩余底物浓度为剩余底物浓度为S=SES=S

28、 v1=k1ES=K1（E0ES）S v2=K2 ES v3=K3 ES1925年年Briggs-Haldane认为反应中认为反应中ES不变，不变，即稳态即稳态 K2K3 K1=（E0ES）S ESK1（E0ES）S=K2 ES K3 ES整理得整理得 k2k1定义定义K2K3/K1为为Km，命名为米氏常数，命名为米氏常数即即Km=（E0ES）S ES 解出解出ES得得ES=E0S Km S 反应速度反应速度v=K3 ES v=K3 E0S Km S K3 E0=Vmax v=Vmax S Km S 米氏方程是双曲线的推导米氏方程是双曲线的推导 v=Vmax S Km S 上式变换为上式变换为

29、vKmvS=VmaxS 两边各加两边各加 Vmax Km 得得 v KmvSVmax Km=VmaxSVmax Km v KmvSVmax KmVmaxS=Vmax Km v（KmS）Vmax（KmS）=Vmax Km （v Vmax）（）（SKm）=Vmax Km（xa）（）（yb）=c3.米氏常数的意义米氏常数的意义 v=Vmax/2，则：则：km=S Km=(Vmax/v-1)S 意义意义：（1 1）k km m是酶的一个基本的特征常数。是酶的一个基本的特征常数。其大小与酶的浓度无关，其大小与酶的浓度无关，而与具体的底物有关，且随着温度、而与具体的底物有关，且随着温度、pH和离子强度而改

30、变。和离子强度而改变。（2 2）从）从k km m可判断酶的专一性和天然底物可判断酶的专一性和天然底物。Km最小的底物，通常最小的底物，通常就是该酶的最适底物，也就是天然底物。就是该酶的最适底物，也就是天然底物。（3）当当k k2 2k k3 3时，时，k km m的的大小可以表示酶与底物的亲和性。大小可以表示酶与底物的亲和性。km=（k2+k3)/k1Km k2/k1S +EESE+P km可以看作可以看作ES的解离常数的解离常数ks：km=ks=SEES当当km大，说明大，说明ES容易解离，酶与底物结合的亲和力小。容易解离，酶与底物结合的亲和力小。（4）从从k km m的大小，可以知道正确

31、测定酶活力时所需的底物浓度。的大小，可以知道正确测定酶活力时所需的底物浓度。也可以算出某一底物浓度时达最大反应速度的倍数也可以算出某一底物浓度时达最大反应速度的倍数Sv1000km0.999V100km0.99V10km0.91V3km0.75V1km0.50V0.33km0.25V0.10km0.091V从从米氏方程中求得：米氏方程中求得：当反应速度达到最大反应速度的当反应速度达到最大反应速度的90%，则，则90%V=100%VS/(km+S)v=Vmax Skm +S即即 S=9km在在进行酶活力测定时，通常用进行酶活力测定时，通常用4km的底物浓度即可。的底物浓度即可。反应速度达最大反应

32、速度的百分率也近似地表示反应速度达最大反应速度的百分率也近似地表示酶被底物饱和的百分率酶被底物饱和的百分率 v=K3 ES Vmax=K3 E v/Vmax=ES/E（5）km还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径。丙酮酸丙酮酸乳酸乳酸乙酰乙酰CoA乙醛乙醛乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶（1.710-5）丙酮酸脱氢酶（丙酮酸脱氢酶（1.310-3）丙酮酸脱羧酶丙酮酸脱羧酶（1.010-3）当当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于km最小的酶。最小的酶。4、Vmax的意义的意义是一个基本常数。是一个基本常数。在一定在一定酶浓

33、度下，与具体的底物有关，酶浓度下，与具体的底物有关，且随着温度、且随着温度、pH和离子强度而改变。和离子强度而改变。5、K3的意义的意义当底物浓度很大时，当底物浓度很大时，v=K3ES=K3E=Vmax K3即为转换数，用即为转换数，用Kcat表示。表示。转换数转换数 一定条件下，每秒钟每个酶分子（一定条件下，每秒钟每个酶分子（mol、mol）转化底物的分子（转化底物的分子（mol、mol）数。数。它表示酶的催化效率它表示酶的催化效率6、Kcat/Km的意义的意义 单位亲合力的转换数，也表示催化效率。单位亲合力的转换数，也表示催化效率。常用来比较不同酶的效率高低。常用来比较不同酶的效率高低。7

34、、Km和和Vmax的求法的求法米氏常数可根据实验数据作图法直接求得：先测定不同底物浓米氏常数可根据实验数据作图法直接求得：先测定不同底物浓度的反应初速度，从度的反应初速度，从v与与S的关系曲线求得的关系曲线求得V，然后再从然后再从1/2V求求得相应的得相应的S即为即为km（近似值近似值）。）。（1 1）（）（LineweaverLineweaver-Burk-Burk）双倒数作图法双倒数作图法1v=kmV S1+V1（y=ax+b）斜率斜率=km/Vmax1/S1/v1/Vmax-1/km（2 2）Eadie-HofsteeEadie-Hofstee作图法作图法 v=Vmax S Km Sv

35、Kmv S=Vmax S v S=Vmax S v Km v=Vmax Km v/Sy=ax bvv/SVmaxVmax Km （3 3）Hanes-Hanes-WoolfWoolf作图法作图法 v=Vmax S Km S双倒后同乘双倒后同乘SS v=S Vmax Km Vmaxy=axbS vS Km Km Vmax（4 4）EisenthalEisenthal和和Cornish-BowdenCornish-Bowden直接线性作图法直接线性作图法把（把（2）所得方程）所得方程 v=Vmax Km v/S移相得移相得Vmax=v Km v/S 可见无论底物浓度和速度如何可见无论底物浓度和速度

36、如何变化，变化，Vmax 是一个常数，在是一个常数，在v对对S图上是一个点。把图上是一个点。把S标标在横轴负侧，在横轴负侧，v 标在纵轴上，各标在纵轴上，各直线交叉点为直线交叉点为Km和和Vmax的坐标。的坐标。v SVmax Km 多底物的酶促反应动力学多底物的酶促反应动力学1、酶促反应按底物数分类、酶促反应按底物数分类 单底物单底物 异构酶异构酶 单向单底物单向单底物 裂合酶裂合酶 假单底物假单底物 水解酶水解酶 双底物双底物 氧化还原酶氧化还原酶 转移酶转移酶 三底物三底物 连接酶连接酶2、双底物反应按动力学机制分类、双底物反应按动力学机制分类（1 1）序列反应或单）序列反应或单-置换反

37、应置换反应a、有序：有序：EA EA B EAB EPQ EQP E Q b、无序：无序：EA/B EA/B B/A EAB EPQ EQ/PP/Q E Q/P（2 2）乒乓反应或双）乒乓反应或双-置换反应置换反应EA EA EP EPBEB EQ EQ与酶结合使酶活力降低甚至丧失的物质，称为抑制剂（与酶结合使酶活力降低甚至丧失的物质，称为抑制剂（I）。）。抑制剂使酶活性降低或丧失的作用，称为抑制作用。抑制剂使酶活性降低或丧失的作用，称为抑制作用。不可逆抑制剂不可逆抑制剂可逆抑制剂可逆抑制剂与酶必需基团共价结合与酶必需基团共价结合不能被透析或滤掉。不能被透析或滤掉。酶活性不能自己恢复酶活性不能

38、自己恢复与酶必需基团非共价结合与酶必需基团非共价结合可被透析或滤掉可被透析或滤掉酶活性能自己恢复酶活性能自己恢复专一专一 与一种酶结合与一种酶结合 不专一不专一 与一类酶结合与一类酶结合竞争性竞争性非竞争性非竞争性反竞争性反竞争性与结合部位结合与结合部位结合 与非结合部位结合与非结合部位结合与与ES结合结合一、抑制作用的类型一、抑制作用的类型第三节第三节 酶的抑制作用酶的抑制作用 1 抑抑制制剂剂分分类类2、可、不可的鉴别、可、不可的鉴别透析、过滤、测速度曲线透析、过滤、测速度曲线Ev1231.反应体系中不加反应体系中不加I。2.反应体系中加入一定反应体系中加入一定量的不可逆抑制剂。量的不可逆

39、抑制剂。3.反应体系中加入一定反应体系中加入一定量的可逆抑制剂。量的可逆抑制剂。Ev不可逆抑制剂的作用不可逆抑制剂的作用Ev 可逆抑制剂的作用可逆抑制剂的作用I I 二、抑制作用二、抑制作用1.不可逆抑制作用不可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合（共价键）是不可逆的。：抑制剂与酶的结合（共价键）是不可逆的。S +EESE+P+IEIESH+ICH2COOH ESCH2COOH+HI 2、可逆抑制作用、可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合是可逆的。：抑制剂与酶的结合是可逆的。抑制程度是由酶与抑制剂之间的亲和力大小、抑制剂的浓抑制程度是由酶与抑制剂之间的亲和力大小、抑制剂的浓度以及底物的浓度决定。度以及底物的

40、浓度决定。竞争性抑制作用竞争性抑制作用：抑制剂和底物竞争与酶结合。抑制剂和底物竞争与酶结合。特点特点：1）抑制剂和底物竞争酶的结合部位）抑制剂和底物竞争酶的结合部位S +EESE+P+IEIv=VSkm(1+I/ki)+Ski=EI/EISvV/2km2）抑制程度取决于）抑制程度取决于I和和S的浓度以及与酶结合的的浓度以及与酶结合的亲和力大小。亲和力大小。km无无 I有有 I3）竞争性抑制剂的结构）竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似。与底物结构十分相似。Vmax不变不变Km变大变大非非竞争性抑制作用竞争性抑制作用：底物和抑制剂同时底物和抑制剂同时与酶结合，但形成的与酶结合，但形成的EIS不能

41、进一步转变为产物。不能进一步转变为产物。v=V1+I/ki Skm+SSv无无 IV/2km有有 I()Vmax变小变小Km不变不变S +EESE+P+IEI+IEIS+SE+P反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用：抑制剂必须在酶与底物抑制剂必须在酶与底物结合后才能进一步形成结合后才能进一步形成ESI复合物。复合物。v=V1+I ki Skm1+Iki+SSvkmkmVmax变小变小Km变小变小VmaxVmaxS +EESE+P+IESIE+P看图辨类型看图辨类型1v 1S无无I有有I1v 1S无无I有有I1v 1S无无I有有I竞争性抑制剂竞争性抑制剂非竞争性抑制剂非竞争性抑制剂反竞争性抑制剂反竞

42、争性抑制剂三、重要抑制剂举例三、重要抑制剂举例1、不可逆抑制剂、不可逆抑制剂（1 1）非专一）非专一有机磷化合物有机磷化合物 有机汞化合物有机汞化合物重金属、烷化剂、氰化物、重金属、烷化剂、氰化物、CO、青霉素等青霉素等（2 2）专一性）专一性Ks型型 亲和标记试剂亲和标记试剂 如如 对甲苯磺酰对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮是胰蛋白酶的赖氨酰氯甲酮是胰蛋白酶的Kcat型型 自杀性底物自杀性底物 如如 别嘌呤醇是黄嘌呤氧化酶的别嘌呤醇是黄嘌呤氧化酶的 卤代卤代-D-丙氨酸是细菌丙氨酸消旋酶的丙氨酸是细菌丙氨酸消旋酶的2、可逆抑制剂、可逆抑制剂竞争性竞争性 抗代谢物或代谢类似物抗代谢物或代谢类似物

43、如如 5-氟脲嘧啶等抗癌氟脲嘧啶等抗癌 磺胺类药杀菌磺胺类药杀菌COOHH2NSO3HRHN叶酸合成酶叶酸合成酶抑制作用的机制：抑制作用的机制：1.抑制剂与酶结合成极稳定的络合物，从而减低或破坏酶抑制剂与酶结合成极稳定的络合物，从而减低或破坏酶的活性。的活性。2.破坏酶或辅基的活性基团或改变活性位的构象。（如重破坏酶或辅基的活性基团或改变活性位的构象。（如重金属（金属（Ag+、Hg2+）和类金属（和类金属（As3+）破坏破坏SH）3.夺取酶与底物结合的机会，从而减少酶的作用。（竞争夺取酶与底物结合的机会，从而减少酶的作用。（竞争性抑制剂）性抑制剂）4.阻抑阻抑 S +EESE+P反应的顺利进行

44、反应的顺利进行（反馈抑制）反馈抑制）1、温度对酶作用的影响、温度对酶作用的影响两种不同影响：两种不同影响：1.温度升高，反应速度加快；温度升高，反应速度加快；原因是分子热运动原因是分子热运动2.温度升高，反应速度降低；温度升高，反应速度降低；原因是热变性原因是热变性Tv最适温度最适温度第五节第五节 温度、温度、pH值、激活剂值、激活剂 对酶促反应的影响对酶促反应的影响2、pH对酶作用的影响对酶作用的影响pHv最适最适pH1.最适最适pH 2.pH稳定性稳定性表现出酶最大活力的表现出酶最大活力的pH值值在在一定的一定的pH范围内酶是范围内酶是稳定的稳定的pH对酶作用的影响机制对酶作用的影响机制：1.环境过酸、过碱使酶变性失活；环境过酸、过碱使酶变性失活；2.影响酶活性基团的解离；影响酶活性基团的解离；3.影响底物的解离。影响底物的解离。3、激活剂对酶作用的影响、激活剂对酶作用的影响凡凡能能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。提高酶活力的物质都是酶的激活剂。如如Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。是唾液淀粉酶的激活剂。v激活剂激活剂 返回返回近似值近似值