第八章__工业微生物代谢控制育种.ppt

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1、第第3 3个转折期：个转折期：以以19561956年谷氨酸发酵成功为标志，发酵工业进年谷氨酸发酵成功为标志，发酵工业进入第入第3 3个转折期个转折期代谢控制发酵时期。代谢控制发酵时期。大体过程大体过程：以以生物化学和遗传学生物化学和遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途径和代谢调节为基础，研究代谢产物的生物合成途径和代谢调节的机制，选择巧妙的技术路线，通过的机制，选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术遗传育种技术获得解除或绕过微生获得解除或绕过微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使有用产物选择性地大量合成和物正常代谢途径的突变株，从而人为地使有用产物选择性地大量合成和累积。累积。关键：关键：解

2、除微生物代谢调控机制，打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微解除微生物代谢调控机制，打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代谢。生物的代谢。代谢控制育种代谢控制育种和和发酵过程的代谢控制培养发酵过程的代谢控制培养是实现这一目标的两个手段，而是实现这一目标的两个手段，而其中前者是主要支柱技术。其中前者是主要支柱技术。与个学科密不可分：与个学科密不可分：生物化学、分子生物学和分子遗传学、过程控制方法生物化学、分子生物学和分子遗传学、过程控制方法第八章第八章 微生物代谢控制育种微生物代谢控制育种第八章第八章 微生物代谢控制育种微生物代谢控制育种第一节第一节 概论概论第二节第二节 初级代谢的调节

3、控制初级代谢的调节控制第三节第三节 次级代谢的调节控制次级代谢的调节控制第四节第四节 代谢调节控制育种代谢调节控制育种第一节第一节 概论概论1 1、初级代谢产物和初级代谢、初级代谢产物和初级代谢2 2、次级代谢产物和次级代谢、次级代谢产物和次级代谢3 3、初级代谢与次级代谢的关系、初级代谢与次级代谢的关系1.1.概念概念微生物产生的对自身生长和繁殖微生物产生的对自身生长和繁殖必须的必须的物质称为初级物质称为初级代谢产物代谢产物(可细分为中间产物和终产物可细分为中间产物和终产物)，产生这些物，产生这些物质的代谢体系称为初级代谢质的代谢体系称为初级代谢(primary metabolism)pri

4、mary metabolism)。2.2.初级代谢体系的组成初级代谢体系的组成分解代谢体系分解代谢体系生物合成体系生物合成体系素材性生物合成体系：小分子素材性生物合成体系：小分子结构性生物合成体系：大分子结构性生物合成体系：大分子1.1 1.1 初级代谢产物和初级代谢初级代谢产物和初级代谢次级代谢产物：次级代谢产物：对产生它们的生物体本身不对产生它们的生物体本身不需要的一种产物，也称为次生产物。需要的一种产物，也称为次生产物。次级代谢次级代谢(secondary metabolism)secondary metabolism)：以初级以初级代谢产物为前体，合成次生产物的代谢体系。代谢产物为前体

5、，合成次生产物的代谢体系。1.2 1.2 次级代谢产物和次级代谢次级代谢产物和次级代谢1.1.从菌体生化代谢角度分析从菌体生化代谢角度分析1.3 1.3 初级代谢与次级代谢的关系初级代谢与次级代谢的关系2.2.从遗传代谢角度分析从遗传代谢角度分析1.3 1.3 初级代谢与次级代谢的关系初级代谢与次级代谢的关系第二节第二节 初级代谢的调节控制初级代谢的调节控制1 1、酶合成的调节、酶合成的调节2 2、酶活性的调节、酶活性的调节3 3、反馈阻遏与反馈抑制、反馈阻遏与反馈抑制1.1.酶合成调节的类型酶合成调节的类型 (1)(1)诱导诱导 (induction)induction)根据酶的生成是否与环

6、境中存在的该酶底物或其有关根据酶的生成是否与环境中存在的该酶底物或其有关物的关系，可分为：物的关系，可分为：组成酶：组成酶：细胞固有的酶，相应基因控制合成，细胞固有的酶，相应基因控制合成，不受底物影响不受底物影响。诱导酶：诱导酶：适应外来物临时合成的酶，受底物影响。适应外来物临时合成的酶，受底物影响。2.1 2.1 酶合成的调节酶合成的调节 (2)(2)阻遏阻遏 (repression)repression)末端产物阻遏末端产物阻遏(end-product repression)end-product repression)：由某代谢途由某代谢途径末端产物过量累积而引起的阻遏。径末端产物过量累

7、积而引起的阻遏。对于直线式反应途径，情况较为简单对于直线式反应途径，情况较为简单对于分支代谢途径，情况较复杂：对于分支代谢途径，情况较复杂：每种末端产物仅每种末端产物仅专一地阻遏专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。合成它的那条分支途径的酶。代谢途径分支点以前的公共酶受到所有分支途径末端产物的阻遏，代谢途径分支点以前的公共酶受到所有分支途径末端产物的阻遏，称为称为多价阻遏作用多价阻遏作用。分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏(catabolitecatabolite repression)repression)：有两种碳源有两种碳源(或氮源或氮源)分解底物同时存在时，细胞利用快的那种分解分解底物同时存在

8、时，细胞利用快的那种分解底物时会阻遏利用慢的底物有关分解酶合成的现象。底物时会阻遏利用慢的底物有关分解酶合成的现象。2.1 2.1 酶合成的调节酶合成的调节1.1.酶合成调节的类型酶合成调节的类型1.1.酶合成调节的机制酶合成调节的机制(1)(1)诱导型操纵子负调控诱导型操纵子负调控2.1 2.1 酶合成的调节酶合成的调节 (2).(2).阻遏型操纵子正调控阻遏型操纵子正调控2.1 2.1 酶合成的调节酶合成的调节1.1.酶合成调节的机制酶合成调节的机制1.1.反馈抑制的类型反馈抑制的类型 (A)A)直线式代谢途径中的反馈抑制直线式代谢途径中的反馈抑制2.2 2.2 酶活性的调节酶活性的调节(

9、B)B)分支代谢途径中的反馈抑制分支代谢途径中的反馈抑制(1)(1)优先合成优先合成(2)(2)协同反馈抑制协同反馈抑制(concerted feedback concerted feedback inhibition)inhibition)2.2 2.2 酶活性的调节酶活性的调节(3)(3)合作反馈抑制合作反馈抑制(cooperative feedback inhibition)cooperative feedback inhibition)2.2 2.2 酶活性的调节酶活性的调节(B)B)分支代谢途径中的反馈抑制分支代谢途径中的反馈抑制(4)(4)累积反馈抑制累积反馈抑制(cumulati

10、ve feedback inhibition)cumulative feedback inhibition)2.2 2.2 酶活性的调节酶活性的调节(B)B)分支代谢途径中的反馈抑制分支代谢途径中的反馈抑制(5)(5)同工酶调节同工酶调节2.2 2.2 酶活性的调节酶活性的调节(B)B)分支代谢途径中的反馈抑制分支代谢途径中的反馈抑制(6)(6)顺序反馈抑制顺序反馈抑制2.2 2.2 酶活性的调节酶活性的调节(B).B).分支代谢途径中的反馈抑制分支代谢途径中的反馈抑制2.2.反馈抑制的机制反馈抑制的机制(1)(1)受反馈抑制的调节酶一般都是变构受反馈抑制的调节酶一般都是变构(alloster

11、icallosteric enzyme)enzyme)，酶活力调控的实质就是变构酶的酶活力调控的实质就是变构酶的变构调节变构调节。(2)(2)变构酶变构酶一般由两个以上亚基组成，有两个和低分子一般由两个以上亚基组成，有两个和低分子物质结合位点：物质结合位点：活性中心：与底物结合的催化中心活性中心：与底物结合的催化中心变构中心：与调节因子相结合的调节中心变构中心：与调节因子相结合的调节中心2.2 2.2 酶活性的调节酶活性的调节2.3 2.3 反馈阻遏与反馈抑制的比较反馈阻遏与反馈抑制的比较第三节第三节 次级代谢的调节控制次级代谢的调节控制抗生素的生物合成途径中，反馈调节作用抗生素的生物合成途径

12、中，反馈调节作用包括：包括：抗生素本身抗生素本身积累起着反馈调节作用积累起着反馈调节作用作为抗生素作为抗生素合成前体合成前体的初级代谢产物，当其受到反馈调节时，必然会影响抗生的初级代谢产物，当其受到反馈调节时，必然会影响抗生素的合成。素的合成。因此，这些代谢调节机制实质上是提高抗生素发酵单位的天然屏障，因此，这些代谢调节机制实质上是提高抗生素发酵单位的天然屏障，如果使调节机制脱敏，将有可能提高抗生素的产量。如果使调节机制脱敏，将有可能提高抗生素的产量。第三节第三节 次级代谢的调节控制次级代谢的调节控制1.次级代谢产物的诱导调节次级代谢产物的诱导调节2.次级代谢产物碳源分解调节次级代谢产物碳源分

13、解调节3.次级代谢产物氮源分解调节次级代谢产物氮源分解调节4.次级代谢次级代谢反馈反馈调节调节5.磷酸盐调节磷酸盐调节6.细胞膜透性的调节细胞膜透性的调节 1 1.两种可能的诱导机制两种可能的诱导机制诱导物诱导物刺激影响初级代谢，造成刺激影响初级代谢，造成代谢流代谢流的改变的改变大量生成次生代谢物大量生成次生代谢物诱导物诱导物次生代谢物次生代谢物合成酶合成酶的合成的合成大量生产次生大量生产次生代谢物代谢物2 2.实例实例色氨酸对麦角碱的作用色氨酸对麦角碱的作用蛋氨酸对头孢霉素蛋氨酸对头孢霉素C C的作用的作用3 3.大多数分解代谢酶属于诱导酶，大多数分解代谢酶属于诱导酶，可以通可以通过加入诱导

14、物使酶的产量提高。过加入诱导物使酶的产量提高。3.1 3.1 次级代谢产物的诱导调节次级代谢产物的诱导调节1.1.涉及对终产物阻遏涉及对终产物阻遏实例实例1 1：青霉素发酵青霉素发酵过程中，葡萄糖不利于青霉素合成，而乳糖虽利过程中，葡萄糖不利于青霉素合成，而乳糖虽利用缓慢，但能提高青霉素产量。用缓慢，但能提高青霉素产量。实例实例2 2：头孢霉素头孢霉素C C的生物合成的生物合成中，抗生素比产率递减顺序为：蔗糖中，抗生素比产率递减顺序为：蔗糖 半乳糖半乳糖 果糖果糖 麦芽糖麦芽糖 葡萄糖，其中蔗糖是葡萄糖的两倍多。葡萄糖，其中蔗糖是葡萄糖的两倍多。3.2 3.2 次级代谢产物碳源分解调节次级代谢

15、产物碳源分解调节2.2.抗生素受碳源分解调节的可能机制抗生素受碳源分解调节的可能机制(1)(1)可能与菌体生长速率控制抗生素合成有关可能与菌体生长速率控制抗生素合成有关。菌体生长最好的碳源能抑制抗生素合成，因此，菌体生长最好的碳源能抑制抗生素合成，因此，在低生长率的情况下在低生长率的情况下(例如青霉素合成中缓慢补加例如青霉素合成中缓慢补加葡萄糖葡萄糖)可减少葡萄糖的干扰作用。可减少葡萄糖的干扰作用。(2)(2)可能与分解代谢产物的堆积浓度有关。可能与分解代谢产物的堆积浓度有关。乳糖乳糖之所以比葡萄糖优越，是因为前者被水解为可利之所以比葡萄糖优越，是因为前者被水解为可利用单糖的速度正好符合青霉素

16、在生产期合成抗生用单糖的速度正好符合青霉素在生产期合成抗生素的需要，而不会有分解代谢产物如丙酮酸的堆素的需要，而不会有分解代谢产物如丙酮酸的堆积。积。3.2 3.2 次级代谢产物碳源分解调节次级代谢产物碳源分解调节1.1.定义：定义：氮源分解调节主要指含氮底物的酶氮源分解调节主要指含氮底物的酶(如如蛋白酶、硝酸还原酶、酰胺酶、组氨酸酶和脲酶蛋白酶、硝酸还原酶、酰胺酶、组氨酸酶和脲酶)的合成受快速利用的氮源，尤其是氨的阻遏。的合成受快速利用的氮源，尤其是氨的阻遏。3.3 3.3 次级代谢产物氮源分解调节次级代谢产物氮源分解调节NHNH4 4+影响：影响：(1(1）pHpH值质子梯度值质子梯度 改

17、变能量代谢改变能量代谢 细胞壁物质和细胞壁物质和 结构的功能；结构的功能；(2)(2)谷氨酰合成酶和谷氨酰合成酶和丙氨脱氢酶的合成丙氨脱氢酶的合成；(3)(3)高度磷酸化的核高度磷酸化的核苷苷，如，如ppGppppGpp和和pppGpppppGpp可能通过级可能通过级联机制调节次级代联机制调节次级代谢，而谢，而ppGppppGpp等受等受氨基酸过量的负控氨基酸过量的负控制调节。制调节。3.3 3.3 次级代谢产物氮源分解调节次级代谢产物氮源分解调节2.2.氮源分解调节的可能机制：氮源分解调节的可能机制：抗生素对自身产物抗生素对自身产物抑制的规律：抑制的规律：抑制特定产生菌合成抑制特定产生菌合成

18、抗生素所需浓度与生抗生素所需浓度与生产水平具有相关性，产水平具有相关性，产生菌产量高，对自产生菌产量高，对自身抗生素的耐受力强，身抗生素的耐受力强，反之则越敏感。反之则越敏感。实例：实例：氯霉素对芳基氨合氯霉素对芳基氨合成酶的成酶的 反馈调节反馈调节3.4 3.4 次级代谢反馈调节次级代谢反馈调节1.1.次级代谢自身产物的反馈调节次级代谢自身产物的反馈调节2.2.分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响次级途径和初级途径具有共同的分叉中间体，次级途径和初级途径具有共同的分叉中间体，由分叉中间体产生的初由分叉中间体产生的初级代谢产物的反馈调节可能影响次

19、级代谢产物的形成。级代谢产物的反馈调节可能影响次级代谢产物的形成。3.4 3.4 次级代谢反馈调节次级代谢反馈调节实例实例1 1：赖氨酸对青赖氨酸对青霉素生物合成的反霉素生物合成的反馈调节馈调节3.4 3.4 次级代谢反馈调节次级代谢反馈调节2.2.分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响(1)(1)次级途径和初级途径次级途径和初级途径具有共同的分叉中间体具有共同的分叉中间体实例实例2 2：色氨酸对杀假：色氨酸对杀假丝菌素生物合成的丝菌素生物合成的反馈调节反馈调节3.4 3.4 次级代谢反馈调节次级代谢反馈调节2.2.分支代谢初级代谢分支代谢初级代谢

20、物反馈调节对次级代物反馈调节对次级代谢的影响谢的影响(1)(1)次级途径和初级途径次级途径和初级途径具有共同的分叉中间体具有共同的分叉中间体(2)初级代谢终产物作初级代谢终产物作为前体合成次生产物。为前体合成次生产物。实例：实例：缬氨酸缬氨酸对青霉对青霉素生物合成的反馈素生物合成的反馈调节调节3.4 3.4 次级代谢反馈调节次级代谢反馈调节2.2.分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响在在抗生素发酵中，抗生素发酵中，加入前体可显著加入前体可显著增产，但前体加增产，但前体加入超过一定限度，入超过一定限度，将产生毒性。将产生毒性。3.4 3.4 次级代

21、谢反馈调节次级代谢反馈调节2.2.分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响分支代谢初级代谢物反馈调节对次级代谢的影响(2)初级代谢终产物作为前体合成次生产物。初级代谢终产物作为前体合成次生产物。1.1.磷酸盐的亚适量磷酸盐的亚适量:已发现过量磷酸盐对四环素、氨基糖苷类和多烯大已发现过量磷酸盐对四环素、氨基糖苷类和多烯大环内酯类等环内酯类等3232种抗生素的生物合成产生阻抑作用。种抗生素的生物合成产生阻抑作用。所以，在工业生产中，磷酸盐常常被控制在适合菌所以，在工业生产中，磷酸盐常常被控制在适合菌体生长的浓度以下，即所谓的亚适量。体生长的浓度以下，即所谓的亚适量。2.2.磷酸盐调节抗生素的生物

22、合成的机制磷酸盐调节抗生素的生物合成的机制按效应来说，有直接作用和间接效应；按效应来说，有直接作用和间接效应；具体而言，磷酸盐能影响抗生素合成中磷酸酯酶具体而言，磷酸盐能影响抗生素合成中磷酸酯酶和前体形成过程中某种酶的活性；和前体形成过程中某种酶的活性；ATPATP直接影响直接影响某些抗生素合成和糖代谢中某些酶的活性。某些抗生素合成和糖代谢中某些酶的活性。3.5 3.5 磷酸盐调节磷酸盐调节如果细胞膜对某种物质不能运输或者运输功能如果细胞膜对某种物质不能运输或者运输功能发生障碍，其结果是：发生障碍，其结果是：一方面，细胞内合成代谢的产物不能分泌到胞外，一方面，细胞内合成代谢的产物不能分泌到胞外

23、，必然会产生反馈调节作用，影响发酵产物的生产量；必然会产生反馈调节作用，影响发酵产物的生产量；另一方面，细胞外的营养物质不能进入细胞内，从另一方面，细胞外的营养物质不能进入细胞内，从而影响产物的合成，造成产量下降。而影响产物的合成，造成产量下降。3.6 3.6 细胞膜透性的调节细胞膜透性的调节第四节第四节 代谢调节控制育种代谢调节控制育种 代谢调节控制育种通过特定突变型的选育，达到改变代代谢调节控制育种通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。及提高细胞

24、膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。抗反馈调节抗反馈调节突变株选育突变株选育1.1.概念：概念：指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻机制失灵，菌株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调节突变型。遏的调节突变型。调节基因突变，致使不能形成活性化的阻抑物；调节基因突变，致使不能形成活性化的阻抑物；操纵基因突变，丧失和阻抑物结合的亲和力。操纵基因突变，丧失和阻抑物结合的亲和力。因此，可以利用一些易同化碳源或价廉易得的碳源作因此，可以利用一些易同化碳源或价廉易得的碳源作为基质生产所需的诱导酶类。为基质生产所

25、需的诱导酶类。2.2.筛选方法及实例筛选方法及实例(1)(1)限量诱导物恒化培养限量诱导物恒化培养(2)(2)循环培养循环培养(3)(3)鉴别性培养基的利用鉴别性培养基的利用(4)(4)筛选筛选4.1 4.1 组成型突变株的选育组成型突变株的选育 (1)1)限量诱导物恒化培养限量诱导物恒化培养将野生型菌种经诱变后移接到低将野生型菌种经诱变后移接到低浓度诱导物的恒化器中连续培养浓度诱导物的恒化器中连续培养由于底物浓度低到对由于底物浓度低到对野生型不发生诱导作野生型不发生诱导作用，所以诱导型的野用，所以诱导型的野生菌不能生长生菌不能生长突变株由于不经诱导突变株由于不经诱导即可产生诱导酶而利即可产生

26、诱导酶而利用底物，因而得以生用底物，因而得以生长成为组成型菌株长成为组成型菌株4.1 4.1 组成型突变株的选育组成型突变株的选育2.2.筛选方法及实例筛选方法及实例(2)2)循环培养循环培养含有诱导物含有诱导物的培养基的培养基不含诱导物不含诱导物的培养基的培养基交交替替连连续续循循环环培培养养由于组成型突变株在两种培养基由于组成型突变株在两种培养基上都能产酶，生长逐渐占优势上都能产酶，生长逐渐占优势4.1 4.1 组成型突变株的选育组成型突变株的选育2.2.筛选方法及实例筛选方法及实例(3)(3)鉴别性培养基的利用鉴别性培养基的利用甘油作惟一甘油作惟一碳源碳源涂布诱涂布诱变孢子变孢子悬液悬液

27、喷上喷上O-O-硝基苯酚硝基苯酚-D-D-半乳糖苷半乳糖苷(ONPG)ONPG)组成型组成型诱导型诱导型4.1 4.1 组成型突变株的选育组成型突变株的选育2.2.筛选方法及实例筛选方法及实例 (4)4)筛选筛选经诱变剂处理后的菌体移接到含有诱导能力经诱变剂处理后的菌体移接到含有诱导能力低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基中低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养，突变体能良好生长，野生型不能生长。培养，突变体能良好生长，野生型不能生长。例如：利用苯例如：利用苯-半乳糖半乳糖(PG)PG)筛选筛选-半乳糖苷酶半乳糖苷酶组成型突变株。组成型突变株。4.1 4.1 组成型突变株的选育组成型突变株

28、的选育2.2.筛选方法及实例筛选方法及实例概念：概念：抗分解阻遏和抗分解抑制的突变株。抗分解阻遏和抗分解抑制的突变株。分解代谢阻遏现象：分解代谢阻遏现象：在初级或次级代谢中都存在初级或次级代谢中都存在，其含义是指代谢过程中酶的合成往往受高在，其含义是指代谢过程中酶的合成往往受高浓度的葡萄糖或其他易分解利用的碳源或氮源浓度的葡萄糖或其他易分解利用的碳源或氮源所抑制。所抑制。选育抗分解调节突变株选育抗分解调节突变株(如碳源、氮源或磷酸盐如碳源、氮源或磷酸盐分解调节分解调节)，其实就是筛选合成酶的产生不受碳、，其实就是筛选合成酶的产生不受碳、氮、磷的代谢阻遏或抑制的突变株，使抗生素氮、磷的代谢阻遏或

29、抑制的突变株，使抗生素提前到菌体生长期开始合成，延长产抗期以提提前到菌体生长期开始合成，延长产抗期以提高产量。高产量。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育 筛选此类突变株的目的筛选此类突变株的目的由于葡萄糖分解产物的积累，阻遏抗生素合成的关键由于葡萄糖分解产物的积累，阻遏抗生素合成的关键酶，从而抑制抗生素的合成。在实际生产中，采用流加酶，从而抑制抗生素的合成。在实际生产中，采用流加葡萄糖或应用混合碳源可以控制分解中间产物的累积来葡萄糖或应用混合碳源可以控制分解中间产物的累积来减少不利影响，但最根本的办法则是筛选抗碳源分解调减少不利影响，但最根本的办法则是筛选抗碳源分解调

30、节突变株，以解除上述调节机制，达到增产的目的。节突变株，以解除上述调节机制，达到增产的目的。筛选方法与实例筛选方法与实例(1)(1)循环培养法循环培养法(2)(2)鉴别性培养基鉴别性培养基(3)(3)特殊氮源特殊氮源(4)(4)葡萄糖结构类似物葡萄糖结构类似物4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育1.1.解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育(1)(1)循环培养法循环培养法快速利用的快速利用的碳源培养基碳源培养基慢速利用的慢速利用的碳源培养基碳源培养基交交替替培培养养突变型解除了阻遏现象，在乳糖突变型解除了阻遏现象，在乳糖的培养基上比野生型生长速度快，的培养基上

31、比野生型生长速度快，4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育1.1.解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育(2)(2)鉴别性培养基鉴别性培养基含有葡萄糖含有葡萄糖的琼脂平板的琼脂平板涂布诱涂布诱变后的变后的菌体菌体喷上喷上O-O-硝基苯酚硝基苯酚-D-D-半乳糖苷半乳糖苷(ONPG)ONPG)突变型突变型野生型野生型4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育1.1.解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育(3)(3)特殊氮源特殊氮源用葡萄糖为碳源，受阻遏酶的底物作为惟用葡萄糖为碳源，受阻遏酶的底物作为惟一氮源配制成培养基，连续移接诱变后的

32、一氮源配制成培养基，连续移接诱变后的产气杆菌产气杆菌(AerobactersAerobacters aerogenesaerogenes)，可可以筛选出不受葡萄糖阻遏的组氨酸酶突变以筛选出不受葡萄糖阻遏的组氨酸酶突变株。株。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育1.1.解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育(4)(4)葡萄糖结构类似物葡萄糖结构类似物 特性：特性：2-2-dGdG和和3-3-mGmG既不被微生物代谢又具有分既不被微生物代谢又具有分解阻遏作用，因此可用来筛选抗分解阻遏的突变株。解阻遏作用，因此可用来筛选抗分解阻遏的突变株。2-dG3-mG4.2 4

33、.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育1.1.解除碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育 筛选方法筛选方法培养基要求含低浓度培养基要求含低浓度2-2-dGdG或或3-3-mGmG及及一种生长碳源，该一种生长碳源，该碳源必须经相应的诱导酶水解才能被微生物同化利用。碳源必须经相应的诱导酶水解才能被微生物同化利用。抗性突变株的性质抗性突变株的性质应用应用2-2-dGdG或或3-3-mGmG不仅可以定向选育分解阻遏脱敏突变不仅可以定向选育分解阻遏脱敏突变株，也可有效地分离到高产菌株。株，也可有效地分离到高产菌株。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育1.1.解除

34、碳源调节突变株的选育解除碳源调节突变株的选育(4)(4)葡萄糖结构类似物葡萄糖结构类似物2.2.解除氮源分解调节突变株的选育解除氮源分解调节突变株的选育氮源分解调节：氮源分解调节：指含氮产物的酶受快速利用的氮指含氮产物的酶受快速利用的氮源阻遏。源阻遏。类型：类型：细菌、酵母、霉菌等微生物对细菌、酵母、霉菌等微生物对初级代谢初级代谢产产物的氮降解物具有调节作用。物的氮降解物具有调节作用。次级代谢次级代谢的氮降解的氮降解物的阻遏主要指铵盐和其他快速利用的氮源对抗物的阻遏主要指铵盐和其他快速利用的氮源对抗生素生物合成具有分解调节作用。生素生物合成具有分解调节作用。实例：实例：筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌

35、株，是提高蛋筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌株，是提高蛋白酶产量的一种有效方法。白酶产量的一种有效方法。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育3.3.解除磷酸盐调节突变株的选育解除磷酸盐调节突变株的选育（A A）磷酸盐对次生产物的调节机制磷酸盐对次生产物的调节机制(1)(1)通过初级代谢的变化影响次级代谢通过初级代谢的变化影响次级代谢 加强初级代谢，推迟抗生素合成的起始；加强初级代谢，推迟抗生素合成的起始；改变糖类分解代谢途径，磷酸盐有利于糖改变糖类分解代谢途径，磷酸盐有利于糖酵解，从而降低戊糖途径的活力，导致某些以酵解，从而降低戊糖途径的活力，导致某些以戊糖途径为先导的抗生素合

36、成受抑制；戊糖途径为先导的抗生素合成受抑制；限制抗生素合成的诱导物；限制抗生素合成的诱导物；抑制或阻遏磷酸脂酶类的合成。抑制或阻遏磷酸脂酶类的合成。(2)(2)磷酸盐对磷酸盐对ATPATP调节：调节：磷酸盐可能通过调节细胞磷酸盐可能通过调节细胞内的效应物内的效应物cAMPcAMP、ATPATP等来控制抗生素的基因表达。等来控制抗生素的基因表达。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育（B B）发酵过程中对磷酸盐的控制发酵过程中对磷酸盐的控制其添加浓度要严格限制在亚适量的水平，但最主要的其添加浓度要严格限制在亚适量的水平，但最主要的目标是选育解除磷酸盐调节突变株。目标是选育解

37、除磷酸盐调节突变株。4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育3.3.解除磷酸盐调节突变株的选育解除磷酸盐调节突变株的选育 （C C）抗磷酸突抗磷酸突变株的筛选方法变株的筛选方法4.2 4.2 抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变株的选育3.3.解除磷酸解除磷酸 盐调节突变盐调节突变株的选育株的选育 营养缺陷型突变株的特性：营养缺陷型突变株的特性：（1）代谢障碍突变株，由结构基因突变引起合成代谢中一个）代谢障碍突变株，由结构基因突变引起合成代谢中一个酶失活，使某个生化反应发生遗传性障碍，使菌株丧失合成酶失活，使某个生化反应发生遗传性障碍，使菌株丧失合成某种物质的能力，导致该菌

38、株在培养基中不添加这种物质就某种物质的能力，导致该菌株在培养基中不添加这种物质就无法生长。无法生长。（2）营养缺陷型菌株常常会使发生障碍的前一步的中间代谢）营养缺陷型菌株常常会使发生障碍的前一步的中间代谢产物得到累积，这就成为利用营养缺陷型菌株进行工业发酵产物得到累积，这就成为利用营养缺陷型菌株进行工业发酵来来积累有用中间代谢产物积累有用中间代谢产物的依据。的依据。（3）营养缺陷型菌株由于生物合成途径中某一步发生障碍，）营养缺陷型菌株由于生物合成途径中某一步发生障碍，合成反应不能完成，从而合成反应不能完成，从而解除了终产物反馈阻抑解除了终产物反馈阻抑。外加限量。外加限量需要的营养物质，克服生长

39、的障碍，使终产物不至于积累到需要的营养物质，克服生长的障碍，使终产物不至于积累到引起反馈调节的浓度，从而有利于中间产物或另一途径的某引起反馈调节的浓度，从而有利于中间产物或另一途径的某种终产物的积累。种终产物的积累。4.3 4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用营养缺陷型在代谢调节育种中的应用1.1.在初级代谢调节育种中在初级代谢调节育种中 的应用的应用（1）直线式生物合成途径直线式生物合成途径4.3 4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用营养缺陷型在代谢调节育种中的应用 （2 2）分支式分支式生物合成途径生物合成途径 实例实例1 1：谷氨酸谷氨酸棒状杆菌的棒状杆菌的L-L-谷氨酸生物合谷

40、氨酸生物合成途径成途径生物素缺陷型生物素缺陷型硫胺素缺陷型硫胺素缺陷型4.3 4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用营养缺陷型在代谢调节育种中的应用1.1.在初级代谢调节育种中的应用在初级代谢调节育种中的应用实例实例2 2：谷氨酸棒状杆菌的腺核苷酸、鸟核苷酸的谷氨酸棒状杆菌的腺核苷酸、鸟核苷酸的合成代谢途径合成代谢途径腺嘌呤缺陷型腺嘌呤缺陷型协同反馈抑制协同反馈抑制实例实例3 3 高丝氨酸营养缺陷型菌株的赖氨酸合成途径高丝氨酸营养缺陷型菌株的赖氨酸合成途径高丝氨酸缺陷型高丝氨酸缺陷型协同反馈抑制协同反馈抑制2.2.在次级代谢调节育种中的应用在次级代谢调节育种中的应用（1 1）抗生素增产：）抗

41、生素增产：抗生素产生菌的营养缺陷株多数生抗生素产生菌的营养缺陷株多数生产能力是下降的。然而，在初级或次级代谢产物的分产能力是下降的。然而，在初级或次级代谢产物的分支代谢途径中，营养缺陷型切断初级代谢支路，有可支代谢途径中，营养缺陷型切断初级代谢支路，有可能使抗生素增产。能使抗生素增产。4.3 4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用营养缺陷型在代谢调节育种中的应用实例：四环素、制霉菌素产生菌的脂肪酸缺陷型实例：四环素、制霉菌素产生菌的脂肪酸缺陷型可增加抗生素。可增加抗生素。脂肪酸缺陷型脂肪酸缺陷型 （2 2）新产品）新产品 实例：实例：金霉素第六碳原子金霉素第六碳原子上甲基是由氮氨酸上甲基是由

42、氮氨酸供应的，如果获得供应的，如果获得蛋氨酸缺陷型，阻蛋氨酸缺陷型，阻断了蛋氨酸这一区断了蛋氨酸这一区段的合成，导致次段的合成，导致次级代谢中甲基供给级代谢中甲基供给受到限制，结果产受到限制，结果产生去甲基金霉素，生去甲基金霉素，而不产生金霉素。而不产生金霉素。4.3 4.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用营养缺陷型在代谢调节育种中的应用2.2.在次级代谢调节育种中的应用在次级代谢调节育种中的应用概念：概念：渗漏缺陷型渗漏缺陷型(leaky mutants)leaky mutants)是一种特殊的是一种特殊的营养缺陷型，是遗传性代谢障碍不完全的突变型。营养缺陷型，是遗传性代谢障碍不完全的突变

43、型。其特点是酶活力下降而不完全丧失，并能在基本其特点是酶活力下降而不完全丧失，并能在基本培养基上少量生长。培养基上少量生长。筛选的方法：筛选的方法：将大量营养缺陷型菌株接种到基本将大量营养缺陷型菌株接种到基本培养基平板上，挑选生长特别慢而菌落小的即可。培养基平板上，挑选生长特别慢而菌落小的即可。应用：应用：正是利用了渗漏缺陷型既能少量合成代谢正是利用了渗漏缺陷型既能少量合成代谢终产物，又不造成反馈抑制的特点。终产物，又不造成反馈抑制的特点。4.4 4.4 渗漏缺陷型在代谢调节育种中的应用渗漏缺陷型在代谢调节育种中的应用概念：概念：抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节抗反馈调节突变株是一种

44、解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。其特点是所需产物不断积累，不会因机制的突变型菌株。其特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产：其浓度超量而终止生产：如果由于如果由于结构基因突变结构基因突变而使变构酶成为不能和代谢终产物相结合的，而使变构酶成为不能和代谢终产物相结合的，便是失去了反馈抑制的突变，称为便是失去了反馈抑制的突变，称为“抗反馈突变型抗反馈突变型”；如果是由于如果是由于调节基因突变调节基因突变引起调节蛋白不能和代谢终产物相结合而引起调节蛋白不能和代谢终产物相结合而失去阻遏作用的，称为失去阻遏作用的，称为“抗阻遏突变型抗阻遏突变型”。一般而言，抗阻遏突变结果使胞内酶有可能成

45、倍增长，一般而言，抗阻遏突变结果使胞内酶有可能成倍增长，而抗反馈突变的胞内酶量没有什么变化。但从作用效果上而抗反馈突变的胞内酶量没有什么变化。但从作用效果上讲，均造成终产物大量积累，而且往往两种突变同时发生，讲，均造成终产物大量积累，而且往往两种突变同时发生，难以区别。通常就统称为难以区别。通常就统称为“抗反馈调节突变型抗反馈调节突变型”。4.5 4.5 抗反馈调节突变株的选育抗反馈调节突变株的选育在在实际应用实际应用中，抗反馈调节突变株的选育可中，抗反馈调节突变株的选育可以通过以下几个方面：以通过以下几个方面：从遗传上解除反馈调节从遗传上解除反馈调节 (如各种抗性和耐性育种、如各种抗性和耐性

46、育种、回复突变子的应用等回复突变子的应用等)截流或减少终产物堆积截流或减少终产物堆积 (如借助营养缺陷型或采如借助营养缺陷型或采用渗漏缺陷型等用渗漏缺陷型等)移去终产物移去终产物 (借助膜透性的突变等借助膜透性的突变等)4.5 4.5 抗反馈调节突变株的选育抗反馈调节突变株的选育1.1.回复突变引起的抗反馈调节突变株回复突变引起的抗反馈调节突变株2.2.耐自身产物突变株选育耐自身产物突变株选育3.3.抗终产物结构类似物突变株的选育抗终产物结构类似物突变株的选育4.4.累积前体和耐前体突变株的选育累积前体和耐前体突变株的选育4.5 4.5 抗反馈调节突变株的选育抗反馈调节突变株的选育1.1.概念

47、：概念：一种可逆性突变，即具有突变型基因的个体通过再一种可逆性突变，即具有突变型基因的个体通过再突变又成为野生型表型的过程。突变又成为野生型表型的过程。2.2.产生的原因产生的原因(1)(1)原有基因的回复突变原有基因的回复突变：指基因内部位点突变引起的逆向突变现象，：指基因内部位点突变引起的逆向突变现象，分以下两种情况：分以下两种情况：同一基因内的同一个或几个碱基的突变引起的回复，消除了原同一基因内的同一个或几个碱基的突变引起的回复，消除了原有突变效应，完全恢复野生基因型及其功能，即真正的回复突变；有突变效应，完全恢复野生基因型及其功能，即真正的回复突变；在同一基因内，但不同的位点碱基的变化

48、，改变了基因的核苷在同一基因内，但不同的位点碱基的变化，改变了基因的核苷酸序列，补偿了原有突变点已失去的功能，使其出现野生表型，称酸序列，补偿了原有突变点已失去的功能，使其出现野生表型，称为基因内抑制突变。为基因内抑制突变。4.5.1 4.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株回复突变引起的抗反馈调节突变株(2)(2)非非原有基因的回复突变原有基因的回复突变概念：在概念：在DNADNA分子链上的一个基因突变成为突变分子链上的一个基因突变成为突变型，随后在邻近的基因某位点碱基发生突变，抑型，随后在邻近的基因某位点碱基发生突变，抑制了前一个突变基因的效应，重新出现野生型的制了前一个突变基因的效应，

49、重新出现野生型的表型，又称为表型，又称为抑制基因突变抑制基因突变。4.5.1 4.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株回复突变引起的抗反馈调节突变株2.2.产生的原因产生的原因 区别基因回复突变和抑制基因突变的方法区别基因回复突变和抑制基因突变的方法将回复突变菌株和野生型菌株进行回交试验或杂将回复突变菌株和野生型菌株进行回交试验或杂交重组试验，观察它们的子代是否有突变型出现：交重组试验，观察它们的子代是否有突变型出现：有同样的突变型重新出现，说明回复突变和原来有同样的突变型重新出现，说明回复突变和原来突变型不在同一位置而是分开的，属于抑制基因回复突变型不在同一位置而是分开的，属于抑制基因回复

50、突变株；突变株；如果杂交后代没有产生突变型，表明回复突变的如果杂交后代没有产生突变型，表明回复突变的位置与原突变型位点相同，是真正的回复突变。位置与原突变型位点相同，是真正的回复突变。4.5.1 4.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株回复突变引起的抗反馈调节突变株3.3.回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选 (1)(1)初级代谢途径障碍性回复突变型初级代谢途径障碍性回复突变型采用回复突变方法来筛选抗反馈调节突变株是根据采用回复突变方法来筛选抗反馈调节突变株是根据“原养型原养型营缺型营缺型原养型原养型”选育途径进行的。二次突选育途径进行的。二次突变后的情况