(精品)基因工程的基本操作程序3.ppt

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1、1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序补：原核细胞的基因结构补：原核细胞的基因结构非非编码区编码区非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子 RNARNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。并与其结合。转录开始后，转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动，并分子移动，并以以DNADNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNARNA。转录完毕后，转录完毕后，RNARNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧

2、接着RNARNA聚聚合酶也从合酶也从DNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构有有调控调控遗传信息表达的核遗传信息表达的核 苷酸苷酸序列序列，在该序列中，在该序列中，最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点。非非编码区编码区非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子

3、补：真核细胞的基因结构补：真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子：外显子：外显子：真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显外显子：能编码蛋白质的序列子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的

4、核苷酸序列，包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非非编码序列：编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由都由能够编码蛋白质的能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核

5、细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码四个步骤：四个步骤：1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个

6、以上的例子2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些?（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成请阅读请阅读请阅读请阅读P9P9P9P9第一和二两段第一和二两段第一和二两段第一和二两段基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序(一)从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。文库。1.1.基

7、因文库：基因文库：一、目的基因的获取一、目的基因的获取基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序含有一种生物的含有一种生物的含有一种生物的含有一种生物的全部全部全部全部基因基因基因基因基因组文库基因组文库:部分基因文库部分基因文库:（如（如:cDNAcDNA文库）文库）含有一种生物的含有一种生物的含有一种生物的含有一种生物的部分部分部分部分基因基因基因基因基因组基因组文库与文库与部分基部分基因文库因文库的关系的关系基因文库的构建模式图基因文库的构建模式图 通过通过对受体对受体菌的培菌的培养而养而储储存存基因。基因。2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法供体细胞中的供体细胞中的DNADN

8、A许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶限制酶与载体连接与载体连接载入载入受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离(一)从基因文库中获取目的基因一、目的基因的获取一、目的基因的获取基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序鸟鸟枪枪法法(直直直直接接接接分分分分离离离离法法法法)以目的基因以目的基因转录成的信使转录成的信使RNARNA为模板，反转录为模板，反转录成互补的单链成互补的单链DNADNA，然后在酶的作然后在酶的作用下合成双链用下合成双链DNADNA，从而获得所需从而获得所需的基因。的基因。目的基因的目的基因的mRNA

9、mRNA单链单链DNADNA反转录酶反转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA(目的基因目的基因)2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法(一)从基因文库中获取目的基因一、目的基因的获取一、目的基因的获取基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序反反转转录录法法根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 根据已知蛋白质的根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相氨基酸序列，推测出相应的信使应的信使RNARNA序列，然序列，然后按照碱基互补配对原后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷

10、过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成(一)从基因文库中获取目的基因一、目的基因的获取一、目的基因的获取基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点优点缺点缺点鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法根据已知氨基根据已知氨基酸合成酸合成DNADNA法法操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，工作量大，盲目，分离出来的有时并分离出来的

11、有时并非一个基因非一个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要很不稳定，要求的技术条件较高求的技术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸仅限于合成核苷酸对较少的简单基因对较少的简单基因依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：如：1 1、根据基因的核苷酸序列、根据基因的核苷酸序列 2 2、基因的功能基因在染色体上的位置、基因的功能基因在染色体上的位置 3 3、基因的转录产物、基因的转录产物mRNAmRNA 4 4、基因翻译产物蛋白质等特性。基因翻译产物蛋白质等特性。(一)从基因文库中获取目的基因一、目的基因的获取一、目的基因的获取基因工程

12、的基本操作程序基因工程的基本操作程序3、从基因文库中获取目的基因的方法：参考参考“完全解读完全解读”P6P6 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_（前提条件前提条件前提条件前提条件）、_、_ 、_._.原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指

13、数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(二二)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火退火（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的

14、作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链(二二)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取(二二)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取(三三)人工合成目的基因人工合成目的基因根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 反转录法反转录法1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，

15、使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。核心核心3.3.将切下的目的基因片段插将切下的目的基因片段插 入质粒的入质粒的_ _处，再加入适量处，再加入适量_，形成了一个重组形成了一个重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性

16、末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种4.4.过程过程:基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 核心核心二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建基因工程的核心基因工程的核心目的：目的：所需物质：所需物质：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。表达和发挥作用。它们各自它们各自的作用是的作用是什么什么?目的基因目的基因+启动子启动子

17、+终止子终止子+标记基因标记基因(三三)将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1 1）农杆菌介绍：）农杆菌介绍：

18、（2 2）原理及适用范围）原理及适用范围(三三)将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（2）程序：）程序：(三三)将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少（2）方法：）方法：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表

19、达载体与感受态表达载体与感受态细胞混合细胞混合 感受感受态态细胞吸收细胞吸收DNA分子分子(四四)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）抗原抗体杂交抗原抗体杂交DNADN

20、A分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。P P1515思考与探究思考与探究1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （）A、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中

21、唯一的运载体质粒是基因工程中唯一的运载体 C、基因控制的性状都能在后代表现出来基因控制的性状都能在后代表现出来 D、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接D D练习练习2）有关基因工程的叙述中，错误的是）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性

22、内切酶A A练习练习3）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 （）A、限制酶只在获得目的基因时才用限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体质粒都可作为运载体 D、蛋蛋白白质质的的结结构构可可为为合合成成目目的的基基因因提提供供资料资料D D练习练习4）基基因因工工程程是是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱基互补配对的步骤是碱基互补配对的步骤是 （）A、人工合成目的基因人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达C C练习练习