棉酚对2型糖尿病大鼠糖、脂代谢和肝纤维化的影响及机制探讨.pdf

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1、温州医学院硕士学位论文棉酚对2型糖尿病大鼠糖、脂代谢和肝纤维化的影响及机制探讨姓名：王蓉蓉申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：陈国荣;杨开颜20070501温州I 医学院硕士学位论文缩略词表缩略词英文中文d l a b e t i cm e l l i t u ss t r e p t o z o t o z i nt o t a lt r i g l y c e r i d e st o t a lc h o l e s t e r 0 1h i g h-d e n s i t yl i p o p r o t e i n-c h o l e s t e r o ll o w

2、-d e n s i t yl i p o p r o t e i n-c h o l e s t e r o l1 1 B H S D l1 1 b e t a-h y d r o x y s t e r o i dd e h y d r o g e n a s et y p e1G RG CP E P C KG 6 P a s eT I M P 一1g l u c o c o r t i c o i dr e c e p t o rg l u c o c o r t i c o i dp h o s p h o e n o l p y r u v a t ec a x b o x y k

3、i n a s eg l u c o s e-6-p h o s p h a t a s et i s s u ei n h i b i t o r so f m e t a l l o p r o t e i n a s e s 一1T I M P 2t i s s u ei n h i b i t o r so f m e t a l l o p r o t e i n a s e s-2M M P 一2R P S l 6m R N A肘二P C RE L I S Am a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s-1r i b o s o m

4、ep r o t e i nS 1 6m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i dr e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o ne n z y m e l i n k e di m m t m o s o r b e n ta s s a y糖尿病链脲佐菌素总甘油三酯总胆固醇高密度脂蛋白胆固醇低密度脂蛋白胆固醇I 型1 1-b e t a 羟基类固醇脱氢酶糖皮质激素受体糖皮质激素磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶葡萄糖6 磷酸酶基质金属蛋白酶组织

5、抑制因子1基质金属蛋白酶组织抑制因子1基质金属蛋白酶一2核糖体蛋白S 1 6信使R N A逆转录多聚酶链反应酶联免疫吸附试验CC叫吼阿w吼吼温州医学院硕士学位论文R I Ad md d H 2 0P B SH EI H CL MT E MH AA I TA S TA L BN F r,Ba S M AT G F p Ir a d i oi m m u n o a s s a yd e o x y n u c l e o s i d et t i p h o s p h a t ed e i o n i z e dd i s t i l l e dw a t e rp h o p h a t e

6、b u f f e r e ds o l u t i o nh e m a t o x y l i n-e o s i ni m m u n o h i s t o c h e m i s t r yl i g h tm i c r o s c o p yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p yh y a l u r o n i ca c i da l a n i n ca m i n o t r a n s f e r a s ea l b n m i nn u c l e a rf a c t o rK a p p

7、a Ba-s m o o t hm u s c l ea c t i nt r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r9 1放射免疫法脱氧三磷酸核苷双蒸水磷酸缓冲液苏木素伊红免疫组织化学法光学显微镜透射电子显微镜透明质酸丙氨酸氨基移换酶门冬氨酸氨基移换酶白蛋白核因子x Bd 平滑肌肌动蛋白转化生长因子8 l温州医学院硕士学位论文实验一棉酚对2 型糖尿病大鼠糖、脂代谢的影响及机制探讨摘要目的：观察棉酚对2 型糖尿病大鼠血糖、血脂、血胰岛素水平的影响，探讨1 11 3-H S D l、G R、P E P C K、G 6 P a e s 在2 型糖尿病发病

8、机制中的作用及棉酚降血糖、降血脂、改善胰岛素抵抗的作用机制。方法：雄性S D 大鼠3 0 只分成三组：正常对照组1 0 只、2 型糖尿病对照组1 0 只、棉酚干预组1 0 只。后二组喂以高脂饲料(饲料组成：1 0 0 猪油，2 0 0 9 6 蔗糖，2 5 胆固醇，1 o 胆酸盐，6 6 5 常规饲料)一个月，诱发胰岛素抵抗。糖尿病组、棉酚干预组大鼠在禁食1 2 h 后按3 0 m g k g 腹腔注射链脲佐菌素(溶于0 1 m m o l L 枸椽酸缓冲液内，P H=4 O)，注射后l 周测空腹血糖，8 m m o l L 为模型成功。正常对照组腹腔注射等容积枸椽酸缓冲液。此后，棉酚干预组按

9、1 5 m g k g-I d 1 剂量棉酚灌胃4 周，从第5 周起，按1 5 m g k g 剂量棉酚每周给予维持剂量一次至第1 2 周末。正常对照组与糖尿病对照组给予等容积的2 羧甲基纤维素灌胃，灌胃次数及时间同棉酚干预组。治疗结束，禁食1 2 小时后处死大鼠，观测以下指标：(1)生化检测血糖、T c、T G、L D L c、H D L-c、N a+、K 冰平。(2)E L I S A法检测血皮质酮水平，放免法检测血胰岛素水平。(3)制作肝组织匀浆，提取总R N A，用半定量R T P C R 方法观察大鼠肝脏1 1B-H S D l、G R、P E P C K、G 6 P a s e 基

10、因的表达。(4)免疫组化方法测定1 1B-H S D l、G R 的蛋白表达水平。结果：1、血糖、血脂、血胰岛素、血皮质酮、N a 、K+水平：糖尿病组血糖、血胰岛素、血皮质酮、T C、T G 显著升高(P 0 0 1)，L D L c 升高(P O 0 5)，H D L c 下降(P 0 0 5)。经棉酚干预后，血糖、血胰岛素、血皮质酮水平较糖尿病组明显降低(P(0 0 1)，T C、T G、L D L c 水平较糖尿病组降低(P(0 0 5)，H D L c 水平较糖尿病组有升高趋势，但无显著性差异。正常组、糖尿病组、棉酚干预组三组N a+、K+水平无显著差异。2、肝组织的1 1p H S

11、 D l、G R、P E P C K、G 6 P a s e 基因m R N A 表达水平：糖尿病组G R m R N A 表达显著升高(P 0 0 1)，1 1B H S D l 基因m R N A 表达无明显变化，P E P C K、G 6 P a s e 基因m R N A 表达有升高趋势。经棉酚干预后，G R m R N A 表达降低(P o 0 5)，1 1B H S D l、P E P C K、G 6 P a s e 基因m R N A 表达显著降低(P o 0 1)。3、肝组织1 1B H S D I、G R 蛋白表达：糖尿病组1 1B H S D I、G R 蛋白表达明显增强。

12、经棉酚干预后，1 1O H S D l、G R 蛋白表达明显减弱。4温州医学院硕士学位论文结论1、棉酚可降低2 型糖尿病大鼠的血糖和胰岛素水平，增加胰岛素敏感性，并能改善2 型糖尿病大鼠的脂代谢异常。2、2 型糖尿病大鼠肝脏内1 1B H S D I、G R、P E P C K、G 6 P a s e 表达升高，这可能是2 型糖尿病的发病机制之一。3、棉酚可降低2 型糖尿病大鼠肝脏G R、l11 3-H S D l、P E P C K、G 6 P a s em R N A 表达水平，降低肝脏G R、1 16 一H S D l 蛋白表达水平，这可能是其降血糖、降血脂、改善胰岛素抵抗的部分机制。关

13、键词糖尿病，实验性；棉酚；肝脏；l l b e t a 羟基类固醇脱氢酶I 型；糖皮质激素受体；磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；葡萄糖6 磷酸酶；基因表达温州医学院硕士学位论文P a r tO n eT h eE f f e c ta n dM e c h a n i s mo fG o s s y p o lo nM e t a b o l i s mo fG l u c o s ea n dL i p i di nT y p e2D i a b e t i cR a t sA b s t r a c to b j e c t i v e s：T oo b s e r v et h ee f f e

14、 c to fg o s s y p o lo nt h el e v e lo f b l o o dg l u c o s e 1 i p i da n ds e r u l ni n s u l i nf r o mt y p e2d i a b e t i cr a t s T oe x p l o r et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ne x p r e s s i o no f111 3 H S D l，G R,P E P C K,G 6 P a s ea n dp a t h o g e n e s i so ft y p e2d

15、 i a b e t e s，a n dt oi n v e s t i g a t et h em e c h a n i s m so fg o s s y p o l st h e r a p e u t i ce f f e c tO nm e t a b o l i ca b n o r m a l i t yo fg l u c o s ea n dl i p i di nt y p e2d i a b e t i cr a t s M e t h o d s：T h i r t ym a l eS p r a g u e-D a u l e yr a t sw e r ed i

16、v i d e dr a n d o m l yi n t ot h r e eg r o u p s：n o r m a lc o n t r o lg r o u p(n 2 1 0)，t y p e2d i a b e t i cg r o u p(r l-1 0)a n dg o s s y p o lt r e a t e dg r o u p(n _ 1 0)T oi n d u c ei n s u l i nr e s i s t a n c e，t h el a t e rt w og r o u p sw e r ef e dO nt h ed i e t，w h i c

17、hi sc o m p o s e do f1 0 l a r d，2 0 s u g a r,2 5 c h o l e s t e r o l，1 0 b i l es a l ta n d6 6 5 r e g u l a rd i e tf o rO D em o n t h T h el a t e rt w og r o u p sw e r ei n j e e t e di n t r a p e r i t o n e a U yw i t l ls t r e p o z o t o c i na tt h ed o s a g eo f3 0 m g k gt oi n

18、d u c et y p e2d i a b e t e s T h eg o s s y p o lt r e a t e dg r o u pw a sg i v e ng o s s y p o la tt h ed o s a g eo f1 5 m g k g o n c ep e rd a yf o r4w e e k sb yg a v a r g e A n ds i n c e5 t hw e e k，t h et i m e so fg a v a g e sh a db e e nc h a n g e di n t oo n c ep e rw e e ka tt h

19、es a m ed o s a g ea n dl a s t e dt o1 2 t hw e e kW h i l et h ec o n t r o la n dd i a b e t i cg r o u p sw e r eg a v a r g e dw i t h2 C M Cs o l u t i o no f e q u a lv o l u m ea tt h es a m et i m e T h er a t sw e r es a c r i f i c e da f t e rf a s t i n gf o r1 2h o u r sa n dt h ec o n

20、 c e n 订a t i o no fb l o o dg l o c u s e，c h o l e s t e r o l(T C)，t r i g l y c e r i d e s(1 G)，l o w-d e n s i t yl i p o p r o t e i n-c h o l e s t e r o l(L D L c)，h i g h-d e n s i t yl i p o p r o t e i n-c h o l e s t e r o l(H D L-c)，p o t a s s i u ma n ds o d i u mw e r em e a s u r e

21、 db yb i o c h e m i c a l l y T h el e v e l so fc o r t i c o s t e r o n em a di n s u l i nw e r ed e t e c t e db yE L I S A(e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y)a n dR I A(r a d i oi m m u n o a s s a y)r e s p e c t i v e l y A d d i t i o n a l l y,t h em R N Ae x p r e

22、s s i o no f1 1 1 3 一H S D l，G R，P E P C K，G 6 P a s ef r o mr a t sl i v e r sW e r ea s s a y e db ys e m i q u a n t i t yR T-P C R T h ep r o t e i ne x p r e s s i o no f111 3 一H S D l，G Rf r o mt h el i v e r sw e r ed e t e r m i n e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y R e s u l t s：1

23、 T h ec o n c e n t r a t i o no ft h eb l o o dg l u c o s e(P O 0 1)，s e r u mi n s u l i n(P 0 0 1)，c o r t i c o s t e r o n e(P O 0 1)，T C(P 0 0 1)，T G(P 0 0 1)，L D L-c(P o 0 5)r o s es i g n i f i c a n t l yw h i l et h ec o n c e n t r a t i o no fH D L-cd e c l i n e df P o 0 5)i nt y p e2d

24、 i a b e t i cg r o u pc o m p a r e dw i m6温州医学院硕士学位论文n o r m a lc o n t r o lg r o u p A f t e rt h eU e a t m e n to fg o s s y p o l，t h ec o n c e n t r a t i o no fb l o o dg l u c o s e(P 0 0 1)，s e r u n li n s u l i n(P O 0 1)，c o r t i c o s t e r o n e(P 0 0 1)，T C(P o 0 5)，T G(P 0 0 5)，L

25、 D L c(P 0 o s)d e c l i n e dw h i l eH D L ct e n d e dt or i s eb u tn os i g n i f i c a n c ec o m p a r e dw i t ht y 7 p e2d i a b e t i cg r o u p T h e r ei sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nl e v e l so fs e r u m p o t a s s i u ma n ds o d i u ma m o n gt h r e eg r o u p s

26、2 T h em R N Ae x p r e s s i o no f111 3 一H S D l，G R P E P C K,0 6 P a s ei nl i v e r：T h em R N Ae x p r e s s i o no fG Rg e n ei nd i a b e t i cg r o u pw a sh i g h e rt h a nn o r m a lc o n t r o lg r o u p(P 0 0 1)a n dt h em R N Ae x p r e s s i o no fP E P C Kg e n e，G 6 P a s eg e n ew

27、 e r ei n c r e a s e db u tt h e r ei sn os i g n i f i c a n c e T h em R N Ae x p r e s s i o no f1 1 1 3 一H S D lg e n er e m a i n e du n c h a n g e di nd i a b e t i cg r o u pc o m p a r e dw i t hn o r m a lc o n t r o lg r o u p A f t e rt h et r e a t m e n to fg o s s y p 0 1 t h em R N

28、Ae x p r e s s i o no f1 1 1 3 一H S D l 口 0 0 1)，P E P C K(P 0 0 0，G 6 P a s e(P o 0 1)，O R(P 0 0 5)d e c l i n e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dw i t ht y p e2d i a b e t i cg r o u p 3 T h ep r o t e i ne x p r e s s i o no f1 1 1 3-H S D l，G Ri nl i v e r s：l m m u n o h i s t o c h e m

29、 i s t r ya n a l y s i ss h o w e dt h a tp r o t e i ne x p r e s s i o no f1 1 1 3 一H S D l，G Rw a si n c r e a s e do b v i o u s l yi nd i a b e t i cg r o u pc o m p a r e dw i t ht h en o r m a lc o n t r o lg r o u p T h e ya l lr e d u c e da f t e rt h et r e a t m e n to f g o s s y p 0 1

30、 C o n c l u s i o n：1 G o s s y p o lm a yd e c r e a s et h el e v e l so fb l o o dg l u c o s ea n dS e l u n li n s u l i nf r o m2t y p ed i a b e t i cr a t s A l s o，i tC a ni m p r o v ei n s u l i ns e n s i b i l i t,a n dc o r r e c td i s t u r b a n c eo fl i p i dm e t a b o l i s mc

31、a u s e db yt y p e 2d i a b e t e si nr a t 2 T h ee x p r e s s i o no fG RP E P C K，G 6 P a s e，1 1 1 3 H S D lW a si n c r e a s e di nl i v e rf r o md i a b e t i cr a t s，w h i c hm a yp l a yar o l ei nt h ep a t h o g e n e s i so f t y p e2d i a b e t e s 3 O o s s y p o lm a yd e c r e a

32、s et h ee x p r e s s i o nl e v e lo f11 1 3-H S D l，G R，P E P C K,G 6 P a s ei nl i v e ro ft y p e2d i a b e t i cr a t s，w h i c hm a yb er e l a t e dt ot h ed e c r e a s eo fb l o o dl i p i d，b l o o dg l u c o s ea n di m p r o v e m e n to f i n s u l i nr e s i s t a n c e K e yw o r d s：

33、d i a b e t e sm e l l i t u s，e x p e r i m e n t a l；g o s s y p o l；l i v e r；1 1 1 3 一H S D l；G R；P E P C K；G 6 P a s e；g e n ee x p r e s s i o n7温州医学院硕士学位论文实验一棉酚对2 型糖尿病大鼠糖、脂代谢的影响及机制探讨“一刖罱2 型糖尿病是一种全世界范围内发病率都在持续升高的疾病“。目前全球大约有I 9 亿2 型糖尿病患者，预计至2 0 2 5 年将增加至3 3 亿，至2 0 3 0 年发展至3 6 6亿，其中发展中国家发病率预计约占7

34、 7 6“1。在亚洲，2 型糖尿病的发病率一直呈上升趋势，没有丝毫减弱的迹象呦。2 型糖尿病在儿童中的发病率也达到流行的程度嘲。而糖尿病在中国的严峻形势更是发人深省。截止2 0 0 3 年，中国已经成为糖尿病第二大国，拥有2 3 8 0 万糖尿病患者，仅次于印度。1。预计到2 0 3 0 年，中国糖尿病患者人数将突破4 3 2 0 万“1。2 型糖尿病是一种慢性内分泌紊乱的代谢性疾病，以高血糖为主要表现，常可导致糖尿病肾病、肝病、心血管疾病、视网膜病变、外周神经病变、顽固性溃疡等多种并发症以及高脂血症、高胰岛素血症等。临床上治疗2 型糖尿病的降糖药物很多，但是，有些药物价格较为昂贵，长期使用除

35、了加重患者的经济负担外，其出现的副作用，如低血糖、肝毒性作用等常引起人们的关注和担忧。1。因此，寻求一种价格合理、作用温和、用药方便、能够综合治疗2 型糖尿病的多种病征的药物成了医学界竟相研究的热点。2 型糖尿病发病机制复杂，总得来说，可以归结为胰岛素分泌不足伴或胰岛素抵抗蜘。糖皮质激素(G c)是胰岛素的反调节激素，长期以来，人们怀疑G c 参与糖尿病的病理生理过程。G c 可以拮抗胰岛素的效应，并在多个水平调节葡萄糖一胰岛素之间的平衡，如抵抗胰岛素的外周作用、抑制胰岛素的释放、刺激糖异生”1。尤其是糖皮质激素可以促进多种葡萄糖代谢酶如糖异生关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶P E P C K 的

36、表达“1。糖皮质激素受体的药物阻断剂减轻动物模型和柯兴综合征病人与糖皮质激素有关的高血糖和胰岛素抵抗慨“”3。突出了糖皮质与其受体的相互作用在发展为2 型糖尿病和肥胖之间的重要地位“”1。然而，糖皮质激素对靶组织，如肝、脂肪组织的作用，实际上并不依赖于循环的糖皮质激素的水平而是依赖于I I l 3-H S D I 调节的受体前的代谢“”。1 1 1 3-H S D I 是低亲和力的N A D P(H)依赖的脱氢氧化还原酶，在基本完整的细胞和组织内主要将非活性的可的松还原为有活性的糖皮质激素受体的配体一皮质醇，因而放大局部糖皮质激素的效应 1 5,1 6 。用i l B H S D I 基因在小

37、鼠脂肪组织转基因专一过表达后，1 1 p H S D I 转基因小鼠发生了代谢综合征：胰岛素抵抗、高糖血症、脂肪肝、高血压和肥胖 1 7 o 相反，1 1 6 一H S D I 基因敲除小鼠表明，由于体内失去了i 卜去氢皮质酮转换成皮质酮的作用而减弱了肝P E P C K、G 6 P a s e 的活性“”。这些小鼠即使给予高脂饮食，亦无代谢综合征的发生“”。1 I p-H S l)l 基因敲除很少有副反应，相反记忆力提高。”。在肥温州医学院硕士学位论文胖的糖尿病动物模型与人类身上都观察到组织特异性的1 1 B H S D I 表达的失调。S t u l n i g 等推测，1 l B H S

38、 D I 不但能作为内脏器官脂肪分化进行性发展的标志，而且能作为胰岛素敏感性降低和2 型糖尿病胰岛素分泌缺陷的标志瞄1。尽管体内1 1 D H S D I 与疾病的关系不很清楚，但肝内I I p H S m 活性的异常增高可能是胰岛素抵抗综合征包括2 型糖尿病的一个重要致病因素，其活性的增加，可促进糖异生而抑制胰岛素的敏感性“”。A n d e r w s 等实验表明1 1 B H S D I 的非选择性抑制剂生胃酮可以降低肝脏内皮质醇的浓度，增加胰岛素的敏感性1，对健康志愿者却无降低血糖的作用1。但生胃酮同时抑制1 1 1 3 一H S D 2，产生副作用，比如低血钾、高血压。因此，选择性地

39、抑制或下调1 1 1 3 一H S D I 的活性，降低肝内和脂肪组织内皮质醇的浓度，减少肝糖异生，提高组织对胰岛素的敏感性，成为糖尿病和代谢综合症治疗的一个新的靶点。棉酚是从M a l v a c e a e(锦葵科)棉树(棉属)和热带树(桐棉)中提取的一种黄色的复合物汹一。和其它沉积在棉花色素腺体的倍半萜(烯)化合物一起，棉酚使棉树抵抗病菌和害虫，起着自然抵抗害虫的危害作用瞄，。棉酚的名称是指起源于棉属，具有酚的特性。“4 1。对棉酚药理作用的兴致首先起源于它的抗生育作用。在本世纪5 0 年代，我国学者首先报导了粗制棉籽油的避孕作用。6 0 年代在山东、山西、河北、湖南、湖北、江苏等省进行

40、了大规模的调查，确实发现使用粗制棉籽油作为食用油的人群中，男子不育的发生率高。进一步研究其抗生育并开发了实用价值的男用口服避孕药，抗生育率达9 9 以上。陆续的研究发现棉酚是一种具有大量生物活性的多功能的分子，至少在体外，棉酚能治疗一些现有的医疗条件无法冶愈的疾病，比如抗肿瘤，H I V，疟疾和皮肤增生性疾病1。因为没有现有的化疗药物严重的副作用而被提出作为一系列新的抗肿瘤药物中的一种主要的药物。”。棉酚作为一种潜在的抗牛皮癣的药，已获专利”。J a n e r oa n dB u r g h a r d t 和S h e r i f f 等发现棉酚能拮抗体内的脂质过氧化反应。9 0年代，R

41、e n s h a n gG e 等发现棉酚能抑制睾丸1 I p-H S D l。棉酚抑制肾脏l I I)一H S D S，可能是其副作用低血钾的机制所在啪1。但是，最近一项多中心的国际间的研究发现，棉酚的副作用与剂量呈依赖关系。棉酚导致副作用所需的剂量远比棉酚所起疗效所需的剂量高得多m 1。本研究应用S D 大鼠，采用高脂饮食加小剂量S T Z 诱导的2 型糖尿病模型，以期了解2 型糖尿病大鼠肝脏1 1 1 3 一H S D I 的表达情况，1 1 B H S D I 介导的局部糖皮质激素的改变是否可引起2 型糖尿病，分析1 1 D H S D I、P E P C K、G R、G 6 P a

42、 s em R N A 表达改变之间的联系，并在分子水平探讨其对糖、脂代谢的影响机制。并且给2 型糖尿病大鼠棉酚进行干预，观察肝脏1 l D H S D I、P E P C K、G R、G 6 P a s e m R N A 表达的情况，并在分子水平探讨其降低血糖、降血脂、改善胰岛素抵抗的机制。9温州医学院硕士学位论文材料和方法1 材料1 1 实验动物由温州医学院实验动物中心提供S P F 级S p r a g u e D a u l e y(s D)雄性大鼠共3 0 只，体重1 4 0 1 8 0 9 1 2 药品和试剂棉酚2 羧甲基纤维素皮质酮检测试剂盒胰岛素检测试剂盒链脲佐菌素固相R n

43、 a s e 清除剂M-M L V 逆转录酶R n a s ei n h i b i t o rR a n d o mp r i m e rd N T P SE T a q 酶R P S l 6 引物1 1B H S D l 引物G R 引物P E P C K 弓l 物G 6 P a s e 引物G o l dv i e w 核酸染料B i o w e s tA g a r o s eT r i z o lP C RM a r k e r(1 0 0 b pD N Al a d d e r)G RA n t i b o d yT h eP o p u l a t i o nC o u n c

44、i l，R o c k e f e l l e rU n i v e r s i t y,N e w Y o r k 葛仁山教授惠赠国药集团化学试剂有限公司C a y m a nC h e m i c a lC o m p a n y北京中国原子能研究所厦门星隆达化学试剂有限公司绵阳高新区天泽基因工程有限公司P r o m e g a 公司P r o m e g a 公司P r o m e g a 公司杭卅l 吴天生物技术有限公司大连宝生物(T a K a R a)工程公司合成上海生工(S A N G O N)生物工程公司合成I n v i t r o g e n 公司杭州办事处I n v i

45、 t r o g e n 公司杭州办事处I n v i t r o g e n 公司杭州办事处I n v i t r o g e n 公司杭卅I 办事处S B Sg e n e t e c hc oL t dG e n eT c c h(s h a n gh a i)c o m p a n yl i m i t e dI n v i t r o g e nl i f et e c h n o l o g i e s杭州吉诺生物医药技术有限公司S a n t ac r u zb i o t e c h n o l o g y,I n c 1 0温州医学院硕士学位论文1lB H S D lA n

46、t i b o d y兔二抗1 3 主要仪器E p p e n d o r f5 4 1 5 R 超速低温离心机制冰机全自动酶标读数仪紫外分光光度计大型生化分析仪D Y H Y R A D 型电泳仪B i o R A D q u a n t i t yo n e4 6 凝胶成像系统P H 0 7 0 A 型培养箱干燥箱超低温冰箱M i l l i Q 纯水制备机梯度P C R 扩增仪X W 一8 0 A 型旋涡混合器2 方法2 1 实验动物分组及处理T h eP o p u l a t i o nC o u n c i l，R o c k e f e l l e rU n i v e r s

47、i t y,N e w Y o r k 葛仁山教授惠赠北京中杉金桥生物试剂公司德国e p p e n d o r f 公司A F l 0 0，S C O T S M A N，I T A I，Y西班牙d i a g n o s t i cg r i f oB e c k m a n 公司日立7 6 0 0北京市六一仪器厂B i o R A D 公司上海一恒科技有限公司F o r m aS c i e n t i f i cI n c，U S AM i l l i p o r e 公司B i o-R A D上海医大仪器厂雄性s D 大鼠3 0 只分成三组：正常对照组1 0 只、糖尿病对照组1 0

48、只、棉酚干预组1 0 只。后二组喂以高脂饲料(饲料组成：1 0 o 猪油，2 0 0 9 6 蔗糖，2 5 胆固醇，1 o 胆酸盐，6 6 5 常规饲料)一个月，诱发胰岛素抵抗，糖尿病和棉酚干预组大鼠在禁食1 2 h 后按3 0 m g k g 腹腔注射链脲佐菌素(溶于O 1 m m o l L 枸椽酸缓冲液内，p H=4 O)，注射后1 周测空腹血糖，8 m m o l L 为模型成功。正常对照组腹腔注射等容积枸椽酸缓冲液。此后，棉酚干预组予以棉酚灌胃。因棉酚难溶于水，故予棉酚+2 羧甲基纤维素+蒸馏水混合制成棉酚混悬液，按1 5 m g k g-1 d-剂量棉酚灌胃4 周，从第5 周起，按

49、1 5 m g 虹。剂量棉酚每周给予维持剂量一次至第1 2 周末。正常对照组与糖尿病对照组给予等容积的2 羧甲基纤维素灌胃，灌胃次数及时间同棉酚干预组。实验期间，糖尿病组与棉酚干预组继续给予高脂饮食，正常对照组给予普通饮食，三组动物自由进食、饮水。实验结束后，禁食1 2 小时后，处死动物。温州医学院硕士学位论文2 2 血液指标检测2 2 1 血清的制备分别取上述三组大鼠，股动脉放血处死大鼠，取血1 0 m l，2 2 0 0 r r a i n 离心1 0 r a i n，取上清，2 0 1 2 冰箱保存。用日立7 6 0 0 大型生化分析仪检测血糖、T C、T G、L D L c 和H D

50、L-c。2 2 2 酶联免疫吸附试验(E L I S A)钡t 定血清皮质酮2 2 2 1 测定原理采用反向竞争E L I S A 法。抗兔的鼠单抗包被于酶标板上，加入二抗兔抗鼠抗体后，兔抗起到桥接作用，一方面，兔抗鼠抗体与酶标板上的鼠单抗结合，另一方面，乙酰胆碱酯酶与皮质酮的共轭体与大鼠标体中的皮质酮同时竞争与兔抗结合，形成免疫复合物，加入显色试剂E l l m a n sR e a g e n t 后，由于该试剂含有与乙酰胆碱酯酶结合的底物，故能与共轭体上的乙酰胆碱酯酶结合，使与大鼠皮质酮竞争结合二抗的乙酰胆碱酯酶与皮质酮的共轭体显色，在全自动酶标上检测O D 值，所测O D 值与乙酰胆碱