2005年版药典三部部分附录.doc

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1、2005年版药典三部局部附录1无菌检查法修订2支原体检查法增修3病毒外源因子检查法修订4热原质检查法修订5细菌内毒素检查法修订6崩解时限检查法新增7融变时限检查法新增8最低装量检查法 新增9装量片重差异检查法新增10粒度检查法 新增11抗毒素Fab2测定法修订12絮状单位测定法新增13A群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖分子大小测定法增修14伤寒Vi多糖分子量大小测定法新增15乙醇残留量测定法康卫氏扩散皿法新增16蛋白质含量测定双缩脲法新增无菌检查法无菌检查法系指用微生物培养法检查生物制品是否无菌的一种方法。无菌检查应在洁净度为10000级环境中的局部洁净度100级、单向流空气区域内或无菌隔离系统中进行

2、，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及无菌隔离系统必须进行洁净度验证。各种生物制品的无菌检查，均应按照本附录的规定进行，有专门规定者除外。1 仪器1.1 取样用灭菌注射器，5、10ml(供直接接种法用)。m，膜直径约50mm 供薄膜过滤法用。1.3 普通显微镜细菌镜检用。2 培养基及其制备方法培养基应适合需氧菌、厌氧菌或真菌的生长，可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的干粉培养基。2.1 需氧菌、厌氧菌培养基1流体硫乙醇酸盐1，用于培养需氧菌、厌氧菌胰酪蛋白胨(或酪素胰酶消化液，以总氮计2000mg) 15g酵母浸出粉(或酵母透析液200ml) 5g

3、葡萄糖 5g硫乙醇酸钠(或硫乙醇酸) 0.5g0.3ml水 1000ml0.2。在供试品接种前，培养基氧化层的颜色红色不得超过培养基深度的1/3，否那么，须经水浴煮沸加热20分钟，迅速冷却。只限加热一次，并防止被污染。2.2 需氧菌、厌氧菌培养基2 (流体硫乙醇酸盐培养基2)按需氧菌、厌氧菌培养基1处方，删除琼脂，取其余成分，如法配制，即得。2.3改进马丁培养基用于培养需氧菌、真菌蛋白胨 5g 酵母浸出粉 (或酵母透析液200ml) 2g葡萄糖 20g 磷酸氢二钾 1g硫酸镁 (MgSO4 7H2O) 0.5g 水 1000 ml0.1%虎红 2 ml0.2。2.4 营养琼脂培养基蛋白胨 10

4、g牛肉浸粉 5g氯化钠 5g琼脂 14g水 1000ml0.2。上述培养基一般分别按10 ml、40 ml、100 ml或200 ml分装于试管或其他容器中，装量为试管或容器高度的2/5，均以115灭菌30分钟。细菌培养基经30-35培养3天，改进马丁培养基经20-25培养3-5天后，应无菌生长。合格的培养基使用期限不得超过一周。3 培养基灵敏度检查31 菌种 由国家药品检定机构分发。3.1.1 需氧菌 乙型溶血性链球菌(CMCC 32210株)，短芽孢杆菌(7316株)。3.1.2 厌氧菌 生孢子梭状芽孢杆菌(CMCC 64941株)。3.1.3 真菌、白色念珠菌ATCC 1023132 菌

5、液制备将乙型溶血性链球菌、生孢子梭状芽孢杆菌、短芽孢杆菌分别接种于被检的培养基，经3035培养一定时间 (乙型溶血性链球菌和生孢子梭状芽孢杆菌培养2448小时，短芽孢杆菌培养1820小时)后，将乙型溶血性链球菌和短芽孢杆菌分别刮入0.9%无菌氯化钠溶液内制成均匀菌液；生孢子梭状芽孢杆菌先将菌液吸入灭菌的试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀菌液；白色念珠菌接种在改进马丁培养基上，置2025培养2-3天后，刮入0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀菌液。再将以上菌液稀释至与标准比浊管由国家药品检定机构分发相同之浓度，然后用0.1%蛋白胨水作10倍系列稀释， 分别制成10-8乙型溶血性链球菌菌液，10-

6、7的短芽孢杆菌菌液、10-7生孢子梭状芽孢杆菌菌液及10-6白色念珠菌菌液。3.3 培养基接种将10-7的短芽孢杆菌、10-7生孢子梭状芽孢杆菌、10-8乙型溶血性链球菌和10-6 白色念珠菌菌液各1 ml分别接种到每管9 ml被检培养基中，(用于厌氧菌的培养基在试管中装量高度不得低于7cm)。每种菌液至少接种3管，并用未接种的培养基做对照，将接种乙型溶血性链球菌、生孢子梭状芽孢杆菌的培养基置3035培养3天，接种短芽孢杆菌的培养基置3035培养5天，接种白色念珠菌的培养基置2025培养5天，记录结果。3.4 结果判定接种后培养基管数有2/3以上呈现生长，那么判为该培养基的灵敏度合格。培养基灵

7、敏度：乙型溶血性链球菌(32210株)应到达10-8，短芽孢杆菌(7316株)和生孢子梭状芽孢杆菌(64941株)应到达10-7，白色念珠菌ATCC 10231 株应到达10-6。35 附注3.5.1 不应在同一洁净室内同时操作两个菌株。3.5.2 无菌检查用培养基应每批进行灵敏度检查，合格前方可使用。3.5.3 各生产单位的质量检定部门应定期抽检无菌检查用培养基的灵敏度。国家药品检定机构应定期抽检各生产单位的无菌检查用培养基。4 各种培养基的采用4.1 检查需氧性和厌氧性杂菌，应采用流体硫乙醇酸盐培养基。检查不含汞类防腐剂制品中的需氧性和厌氧性杂菌时，该培养基中可不加硫乙醇酸盐。4.2 检查

8、真菌和腐生菌时，应采用真菌培养基。4.3 检查混浊制品时，可采用不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。检查活疫苗时，可适当增加琼脂含量，做成斜面。5 抽样量及抽检瓶数5.1 原液及半成品除半成品除菌后需立即分装、留样作无菌检查的制品外，原液及半成品应每瓶罐分别进行无菌检查，其抽样量应至少为0.1%，但不得少于10ml。原液及半成品每开瓶一次，应如上法抽验。体外用诊断制品半成品每批取样至少3ml。5.2 成品每亚批均应进行无菌检查，供试品应随机抽取，应具有代表性(包括分装过程的前、中、后供试品或冻干过程不同层冻干柜中的供试品)。成品抽验量分出厂制品抽验量和上市制品监督抽验量两种。5.2.1 出厂制品抽验量

9、5.2.1.1 分装量在100支(瓶)或以下者抽检不少于5支，101500支(瓶)者抽检不少于10支(瓶)，50110000支(瓶)者抽检不少于20支(瓶)，10001支(瓶)以上者抽检40支(瓶)。5.2.1.2 每瓶装量在20ml以上的冻干血液制品，每柜冻干200瓶以下者抽检2瓶，200瓶及以上者抽检4瓶。每瓶装量620ml抽检数量加倍。5ml和5ml以下者按5.2.1.1项抽检。5.2.2 上市制品监督抽验量5.2.2.1 除血液制品外，其他生物制品每批抽检8支(瓶)。5.2.2.2 血液制品每瓶装量在50ml以下，抽检6瓶，50ml或50ml以上抽2瓶。表 每支(瓶)注射剂抽验量 每支

10、(瓶)制品装量 (ml) 0.5 V5 5V20 20V100 每支(瓶)抽验量 (ml) 全量 0.5 1.0 5.0 6 检查法无菌检查法包括直接接种法及薄膜过滤法。如供试品性状允许，可优先采用薄膜过滤法。61 直接接种法6.1.1 含防腐剂的制品，应先增菌。按5. 2项抽取的供试品按上表逐瓶取样，并按每20支安瓿混合后接种。应接种培养基瓶数依供试品混合量全部接种而定。接种量与培养基的比例：用苯酚或氯仿作防腐剂者至少为120，用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛、抗生素者至少为150。将混合供试品先按此比例接种于流体硫乙醇酸盐培养基1 内增菌，增菌培养基不得少于200ml扁瓶。于2025培养34

11、天后移种至流体硫乙醇酸盐培养基1、适宜的营养琼脂斜面、改进马丁培养基各2管，每管0.5 ml。将流体硫乙醇酸盐培养基1、适宜的营养琼脂斜面各1管置3035培养，其余各管置2025培养，增菌管及移种管培养时间全程不得少于14天。6.1.2 不含防腐剂制品，不经增菌。按5.2项及上表将每批或亚批抽检供试品逐瓶取样混合，装量在5.0ml以下者(包括5.0ml)每10瓶安瓿混合，装量在5.0ml以上者每7瓶安瓿混合，应接种培养基管数依供试品混合量全部接种而定。将混合后的供试品直接接种于流体硫乙醇酸盐培养基1及改进马丁培养基培养基，接种后的流体硫乙醇酸盐培养基总数的1/2置3035培养，其余置2025培

12、养，同时以0.9%无菌氯化钠溶液代替供试品，做阴性对照，培养时间不得少于14天。6.1.3 供试品混浊和接种后不能判定结果的制品，可按上表取规定量的供试品，接种于流体硫乙醇酸盐培养基2 (200ml)内进行增菌培养，34天后移种。培养基种类和管数、培养温度同6.1.1项，增菌管及移种管培养时间全程不得少于14天，然后判定结果。6.1.4 体外诊断制品只做半成品无菌检查。即半成品在加防腐剂之前，除菌过滤时留样做无菌检查，用直接接种法，培养8天，观察结果。如有菌生长，制品需经除菌处理后再做无菌检查，假设再有菌生长应废弃。如半成品已参加防腐剂后除菌，那么应留样按含防腐剂制品用直接接种法作无菌检查。6

13、2 薄膜过滤法m，膜直径约50mm。取规定抽检供试品数，如供试品少于10ml，那么先用100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液或无菌稀释液稀释，立即在无菌条件下导入无菌薄膜过滤器内，加压或减压过滤。含汞类防腐剂的供试品，在供试品过滤后，用0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的无菌溶剂冲洗滤膜3次，每次100ml。过滤后，两个滤器加流体硫乙醇酸盐培养基1 各100ml，另一个滤器加改进马丁培养基100ml。一个硫乙醇酸盐培养基的滤器置30-35培养，其余置20-25培养，同时以0.9%无菌氯化钠溶液代替供试品做阴性对照。培养时间不少于14天。6.3 结果判定6.31 无菌生长判为合格(有专门规定者除外)

14、。6.3.2 发现有菌生长，可复试。复试供试品量应加倍，无菌生长判为合格。假设复试仍有菌生长，该制品判为不合格。6.3.3 成品无菌检查不合格的亚批数占整批的30%以上时，由质量保证部门会同有关部门根据具体情况，全部或局部废弃。附注：冻干制品应按使用说明书或标签规定的溶解液重溶后进行无菌检查。修订说明：此附录在现行版无菌试验规程的根底上，参考?中国药典?无菌检查法及WHO相关规程进行了修订，并对全文进行了重新组合。原规程中支原体检查局部另写成为独立的附录。支原体检查本法系采用培养法和指示细胞法DNA染色法对主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查，上述两种方法

15、应同时进行。病毒类疫苗的病毒收获液、原液或成品的支原体检查采用培养法，必要时，亦可采用指示细胞法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。1 培养法1 1 仪器适宜规格的培养箱普通显微镜12 培养基种类及处方121 肺炎支原体肉汤培养基猪胃消化液 500ml牛肉浸液 500ml酵母浸粉 5 g葡萄糖 5g将上述成分混合溶解，于121高压灭菌15分钟。使用时，于80ml内参加：无支原体马血清 20ml122 精氨酸支原体肉汤培养基猪胃消化液 500ml牛肉浸液 500ml酵母浸粉 5 g葡萄糖 5gL-精氨酸 2g将上述成分混合溶解，于121高压灭菌15分钟。使用时，于80ml内参加

16、：无支原体马血清 20ml12.3 支原体半固体培养基将2.1.1.1培养基中酚红去掉，参加3g琼脂即为半固体培养基。124 支原体琼脂培养基将2.1.1.1培养基中酚红去掉，参加13-15g琼脂即为支原体琼脂培养基。13 支原体检查用培养基灵敏度检查变色单位试验法131 菌种肺炎支原体(ATCC 1533株)，口腔支原体(ATCC 23714株)。由国家药品检定机构分发。132 培养基凡应用于检查支原体的培养基都应进行变色单位试验。133 操作凡操作支原体应在专门的无菌操作室内进行。将菌种接种于被检的支原体培养基，经3537培养至培养基变色，盲传两代后，将培养物接种到被试培养基中，作10倍系

17、列稀释，肺炎支原体稀释至10-710-9，接种在肺炎支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释到10-310-5 ，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内，每个稀释度3支试管，置3537培养714天观察培养基变色结果。13. 4 结果判定以接种稀释后培养基管数的2/3以上呈现生长变色的最高稀释度为变色单位判定标准。培养基的灵敏度：肺炎支原体(ATCC1533株)变色单位应到达10-8，口腔支原体(ATCC23714株)应到达10-4。附注：质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏度。14 供试品检查141 抽样量按“无菌检查法进行。应对半成品按亚批抽样检查，成品可不再做。1 4. 2 方法及步

18、骤供试品如在24小时以内进行支原体检查者可贮存于28；超过24小时才能接种者，供试品应在-20以下贮存。检查支原体采用支原体半流体和液体培养基。半流体培养基在使用前煮沸1015分钟，冷却至56左右，参加未灭活马血清或灭活小牛血清和酵母浸液(培养基血清酵母浸液为721)，并可酌情参加适量青霉素或醋酸铊，充分摇匀。液体培养除无需煮沸外亦应同样补加上述成分。将供试品0.51.0ml分别种入每支10ml半流体(已冷至3537)和10ml液体培养基中，每种培养基接种4支，置3537培养21天。于接种后的第7天取4支中的2支进行次代培养，每一培养基转种半流体及液体培养基各2支，置3537下培养21天，每隔

19、3天观察一次。1.4.3 结果判定在培养结束时，如已接种的培养基均无支原体生长，那么供试品为合格；如有支原体生长，可用两倍的接种量和培养基进行重试，如无支原体生长，供试品为合格，如仍有支原体生长，供试品判为不合格。2指示细胞培养法(DNA染色法)供试品接种于指示细胞(无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞)培养后，用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体，那么附在细胞外表的支原体DNA着色，在荧光显微镜下可判定。21 仪器适宜规格的荧光显微镜适宜规格的二氧化碳孵箱六孔细胞培养板或其他容器22培养基及指示细胞DMEM完全培养基DMEM无抗生素培养基指示细胞已证明无支原体污染的Ver

20、o细胞或其他传代细胞23 试剂2.3.1 二苯甲酰胺荧光染料Hoechst 33258浓缩液：称取5 mg二苯甲酰胺荧光染料参加100 ml 不含酚红和碳酸氢钠的 Hanks平衡盐溶液中，在室温下用磁力搅拌3040分钟，使完全溶解，避光-20保存。2.3.2 二苯甲酰胺荧光染料工作液取1 ml上述浓缩液，加至100ml无酚红和碳酸氢钠的Hanks溶液中。2.3.3 固定液乙酸:甲醇1:3溶液为细胞固定液。2.3.4 封片液以上三者混匀，调pH 至5.5。2. 4供试品检查2.4.1 供试品的处理2.4.1.1 细胞培养物：将待检细胞经无抗生素培养基传三代，然后取细胞已长满的且三天未换液的细胞培

21、养上清液，待检。2.4.1.2 毒种悬液：如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判定时，应用对支原体无抑制作用的特异抗血清中和病毒后或用不产生细胞病变的另一种指示细胞进行检查。2.4.1.3 其他供试品：应选用该供试品对细胞生长无影响的细胞作为指示细胞进行检查。2.4.2 指示细胞的制备取成片Vero细胞消化后，制成1 x105个/ml的细胞悬液，每孔0.5ml接种6孔细胞培养板或其他容器，每孔加无抗生素培养基3 ml，于5% 二氧化碳孵箱 37培养过夜。2. 4. 3 方法及步骤于指示细胞培养板中依次加供试品、阴性对照及阳性对照包括；阴性对照加无抗生素培养基2ml；阳性对照可选阳性的供试品标

22、准菌株；待检细胞培养上清液2ml；或毒种或其他供试品至少1ml。5% 二氧化碳孵箱 37培养35天。指示细胞培养物至少传代1次；末次传代培养用含盖玻片的6孔培养板培养35天。取出培养板，吸出培养孔中的培养液，参加固定液5ml，放置5分钟。吸出固定液，再加5ml固定液固定10分钟。吸出固定液，使盖玻片在空气中枯燥。加 Hoechst 33258 染料或其他DNA染料工作液5ml，加盖，室温下放置30分钟。吸出染液，每孔加5 ml 蒸馏水，洗3次。吸出蒸馏水，盖玻片于空气中枯燥。取洁净载玻片加封片液一滴，分别将盖玻片面向下盖在封片液上制成封片。用荧光显微镜观察。2. 4. 4 结果判定2.4.4.

23、1 阴性结果：仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。2.4.4.2 阳性结果：荧光显微镜下细胞外可见大小不等、不规那么的荧光着色颗粒。当阴性及阳性对照结果均成立时，试验有效。如未证明供试品有支原体存在，那么供试品为合格；如发现供试品为阳性或可疑时，应进行重试；如仍阳性时，供试品判为不合格。修订说明：此附录在现行版无菌试验规程的根底上，参考WHO相关规程进行了修订，并对全文进行了重新组合，并成为独立附录。病毒外源因子检查法病毒类制品在毒种选育和生产过程中，经常使用动物或细胞培养基质，所以，有可能造成外源因子特别是外源病毒因子的污染。为了保证产品质量，需要对毒种和细胞进行外源因子的检测。A. 病毒种

24、子批外源因子检查对病毒主种子批或工作种子批，应取样进行病毒外因子检测，其取样量应足够检测试验的需要。在试验前应用非人和非猴源的特异性抗体，中和本病毒。所用抗体应用与生产疫苗或制品不同种的无外源因子污染的细胞或动物制备的免疫原生产的抗血清或单克隆抗体。如果病毒曾在禽类组织或细胞中繁殖过，那么抗体不能用禽类来制备。假设用鸡胚，应来自SPF鸡群。1. 动物试验法1.1小鼠。取1520g小鼠至少10只，用经中和后的病毒悬液，每只脑内接种0.03ml，腹腔接种0.5ml。至少观察21天。解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠，为了检查病毒感染的证据，直接肉眼观察其病理改变，并将有病变的相应的组织

25、悬液通过脑内和腹腔接种另外至少5只小鼠并观察21天。如果没有小鼠表现出病毒感染现象，那么病毒种子批符合要求。在观察期内至少有80%最初接种的小鼠存活试验才有效。1.2乳鼠。出生后24小时以内的乳鼠，至少10只，用经中和后的病毒悬液，脑内接种0.01ml，腹腔接种至少0.1ml。每天观察，至少14天。解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠，直接肉眼观察其病理改变，并取有病变的相应的组织和脑、脾制备成悬液脑内和腹腔接种另外至少5只小鼠并每天观察，观察14天。如果没有小鼠表现出有病毒感染现象，该种子批通过试验。在观察期内至少有80%最初接种的小鼠存活试验才有效。2. 细胞培养法中和后的病毒悬

26、液，还应分别接种于人源、猴源和生产用的同种不同批的细胞。如果是利用人二倍体细胞生产的，还应接种另外一株人二倍体细胞。每种细胞最少接种6瓶，每瓶病毒悬液接种量不少于培养液总量的25%。于361培养，观察二周，或最后一次收获病毒液时间检查是否有CPE出现。未见CPE为阴性。于第68天和第14天，每种细胞分别各取出2瓶进行血吸附病毒检查。用0.2%0.5%豚鼠红细胞悬液覆盖于细胞外表，一瓶放28，一瓶放2025，30分钟后显微镜下观察，未见血球吸附现象为阴性。在禽类组织或细胞中繁殖过的病毒种子需用鸡胚检查禽类病毒的污染。选用911和57日龄SPF鸡胚最少每组5只，分别于尿囊腔和卵黄囊途径接种每胚0.

27、5ml经过中和后的病毒悬液。孵育7日后，取尿囊液用豚鼠和鸡红细胞做血球凝集试验应为阴性。被接种的鸡胚至少80%存活7天试验有效。B. 生产用对照细胞外源因子检查每批生产用细胞应留取5%不少于500ml，分种于假设干培养瓶中，参加与疫苗生产相同的细胞维持液，在与疫苗生产相同的条件下培养，观察14天，在显微镜下观察，是否有CPE出现，无CPE出现者为阴性。在观察期末至少要80%的对照细胞培养物存活试验成立。对照细胞在观察期末，收取上清液混合后取适量接种于猴源和人源的细胞培养物，如果疫苗病毒在非猴或非人源其他细胞系上生产，还应接种于同种不同批细胞。接种量应不少于总量的25%。每种细胞至少检查5ml上

28、清混合液。在361培养，如生产的细胞培养条件不是361，那么应选用与生产相同的培养条件进行。并连续观察14天，或最后到收获液的时间仍无CPE者为阴性。对1.1、1.2细胞培养物在观察期末取至少25%的细胞培养瓶进行血吸附病毒检查。方法见A.2.2项修订说明：此规程根据欧洲药典2000版修订。热原质检查法本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。1 供试用家兔 1.1 供试用的家兔应健康合格，体重1.72.5kg, 雌兔应无孕。1.2 预测体温前7日即应用同一饲料饲养，在此期间内，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不

29、得有异常现象。的家兔,方可供热原质试验用。1.4 凡热原质试验用过的家兔，假设供试品判为符合规定，家兔至少休息48小时后可重复使用。对血液制品、抗毒素和其他同一过敏原的供试品在5天内可重复使用。2 试验前准备 2.1 试验用的注射器、针头及一切与供试品接触的器皿，应置烘箱中用250加热30分钟或用180加热2小时，也可用其他适宜方法除热原质。2.2 测温探头的精密度应为。探头插入肛门的深度和时间各兔应相同，深度一般约6cm，时间不得少于2分钟。2.3 热原质试验前12日，供试验用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室和饲养室的温度相差不得大于5，实验室温度应在1725，试验全过程室温变化不得

30、大于3，并应保持安静，防止强光照射，防止引起动物骚动包括噪声干扰。空气中氨含量应低于20mg/L。3 试验3.1 供试品供试品或稀释供试品的无热原质注射液，在注射前应预热至38。供试品的注射剂量见各制品规程的规定。但家兔每1kg体重注射体积不得少于0.5ml，不得大于10ml。3.2 每批供试品初试用3只家兔，复试用5只家兔。的笵围内,同组兔间正常体温之差不得大于1。3.4 测定其正常体温后15分钟以内，自耳静脉缓缓注入规定剂量并预热至38的供试品溶液，然后每隔30分钟测量其体温一次，连测6次。4 结果判定每只兔的正常体温与注射供试品后最高升温之差，为该兔的应答。出现负值以零计算。4.1 初试

31、结果判定4.1.1 符合以下情况者，判为合格：。4.1.2 有以下情况之一者，复试一次：。4.2 复试结果判定4.2.1 符合以下情况者，判为合格：。4.2.2 有以下情况之一者，判为不合格：。热原质检查法修订说明参考?中国药典?二部附录 D?热原检查法?对?生物制品热原质试验规程?做如下修订：1、题目修订?生物制品热原质试验规程?热原质检查法?同?中国药典?二部；1、试验用的家兔1.1项 试验用家兔的体重未变：1.72.5 kg；1.3项 予检温时间：13日37日同?中国药典?二部；1.3项 检温间隔时间：60分钟，共测4次体温30分钟，共测8次体温同?中国药典?二部；1.3项 各兔最高与最

32、低温度差异：38.039.8 38.039.6 ；1.3项 “最高与最低体温差不超过0.5 “；2、试验前准备2.2项 增加“探头插入肛门的深度和时间各兔应相同，深度一般约6cm，时间不得少于1分钟。 同?中国药典?二部；2.3项 增加“实验室和饲养室的温度相差不得大于52.3项 “防止噪声干扰“防止引起动物骚动包括噪声干扰参考欧洲药典；3、试验3.3项 “家兔在试验前2小时以上开始停止给食“家兔在试验前至少2小时开始停止给食 ；3.3项 检温“间隔3060分钟“间隔30分钟；3.3项 增加“的笵围内, 的要求同?中国药典?二部。4、结果判定维持生物制品规程的表达方式。温度的有效数字位数与?中

33、国药典?二部一致：小数点后一位。5、保存生物制品热原质试验的特色和我们的经验，如家兔使用次数，注射供试品的体积限制，实验室的温度等。表：生物制品热原质试验规程修订情况 ?中国药典?二部 生物制品规程 ?中国药典?三部 修订理由 1.1家兔体重kg 中年兔 注射量问题1.72.5 kg的家兔为青年兔；敏感； 试验前37日 试验前13日 试验前37日 2周内无变化，与中国药典二部一致。 30分钟，共测8次体温 60分钟，共测4次体温 30分钟，共测8次体温 试验更精细，与中国药典二部一致 38.039.6 38.039.8 38.039.6 与中国药典二部一致 不超过0.4 不超过0.5 不超过0

34、.4 家兔体温波动小，家兔稳定 。 各兔应相同，深度一般约6cm，时间不得少于1分钟。 无要求 各兔应相同，深度一般约6cm，时间不得少于1分钟。 应该有要求，与中国药典二部一致。 不得大于5 无要求 不得大于5 严格试验条件，与中国药典二部一致。 1728 1525 1525 室温超过28家兔不长体重；USP规定：2023； 防止噪音干扰 噪声干扰 防止引起动物骚动包括噪声干扰 参考欧洲药典，此种表达方式更合理。 30分钟 3060分钟 30分钟 可行并与中国药典二部一致 未提及 虽然在1.3项有要求，但此处在写明更严紧，也与中国药典二部一致。 4结果判定 初、复试结果合格积极不合格合并描述

35、 初、复试结果合格积极不合格分开描述 初、复试结果合格积极不合格分开描述 无原那么差异，保存以往习惯 4有效数字 小数点后一位 小数点后两位 小数点后一位 体温计精度要求，结果要求小数点后两位不合理。修改后与中国药典二部一致 细菌内毒素检查法本法系利用从鲎的变形细胞中提取的试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素。以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查有两种方法：凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用细菌内毒素在与鲎试剂形成凝胶过程中具有相关的浊度变化和两者反响过程中产生的凝固酶能使特殊底物显色的原理，从而定量测定细菌内毒素的方法。可使用

36、其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除有专门说明外，以凝胶法结果为准。细菌内毒素的量用内毒素单位EU表示。细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的各种阳性对照。细菌内毒素工作标准品中每1ng细菌内毒素的效价应不小于2EU，不大于50EU。1条件下24小时不产生凝集反响的灭菌注射用水。用于细菌内毒素定量测定用的细菌内毒素检查用水，内毒素的含量应小于0.005EU/ml。试验准备 试验所用器皿需经处理，除去可能存

37、在的外源性内毒素，常用的方法是250干烤至少1小时，也可用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。如果要使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头，要使用标明无内毒素并且对试验不干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。注：在本章中，“管的意思包括其他任何反响容器，如微孔板中的孔。供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液或其稀释液的pH值，一般要求供试品溶液的pH值在6.08.0的范围内。可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适当的缓冲剂来调节pH值。酸或碱溶液要用检查用水在除去内毒素的容器中进行配制。缓冲剂必

38、须经过认证无内毒素和无干扰因子。内毒素限值的建立 药品、生物制品的细菌内毒素限值L一般按以下公式确定：L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml，EU/mg或EU/U活性单位表示；K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kgh表示。注射剂，K=5EU/kgh，其中放射性药品注射剂，kgh，鞘内用注射剂，kgh；M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml/kgh、mg/kgh或U活性单位/kgh表示，人均体重按60kg计算，注射时间不小于1小时，按1小时计算。确定最大有效稀释倍数MVD最大有效稀释倍数是供试品被允许的最大稀释倍数，在此稀释倍数下可进行内

39、毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD：MVD=CL/式中 L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，那么C等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/u表示时，C的单位需为mg/ml或u/ml。为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度EU/ml，或是在光度检测中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。方法一：凝胶法 凝胶法是通过鲎试剂可与内毒素产生凝集反响的原理来检测或定量内毒素。在标准环境中，能够使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度就是鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。为了保证试验的精确性和有效性，要先复核鲎试剂的灵敏度和完成干扰试验。鲎试剂灵敏度复核 当使用新一批鲎

40、试剂或试验环境中发生了可能会影响检验结果的改变时，须进行鲎试剂灵敏度复核试验。根据鲎试剂灵敏度的标示值、75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿，等体积参加内毒素标准溶液。每一个浓度平行做4管，同时在2管中参加0.1ml细菌内毒素检查用水做为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入371适宜恒温器中，保温60分钟2分钟。将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为+；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为-。保温和拿取试管过程应防止受到振动造成假阴性结果。管均为阴性，阴性对照管为阴性时，试验方为有效。按下式计算反响终点

41、浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值c。c=lg-1X/4式中X为反响终点浓度的对数值lg。反响终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个为阳性结果的浓度。当时，方可用于细菌内毒素检查，并以为该批鲎试剂的灵敏度。干扰试验 按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为无可检验出的内毒素且不超过最大有效稀释倍数MVD的溶液，操作按鲎试剂灵敏度复核项下。表1.凝胶法干扰试验溶液的制备 溶液 内毒素浓度/参加内毒素的溶液 稀释用液 稀释倍数 所含内毒素的浓度 平行管数 A 无/供试品溶液 - - - 4 B 2/供试品溶液 供试品溶液 1 2 4 2 1 4 4 0.5 4 8 0.25

42、4 C 2/检查用水 检查用水 1 2 2 2 1 2 4 0.5 2 8 0.25 2 D 无/检查用水 - - - 2 溶液A：准备进行检查并且未检出内毒素的供试品溶液溶液B：干扰试验系列溶液C：鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液D：检查用水做的阴性对照只有当溶液A和D的所有平行管都为阴性，并且溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算溶液C的反响终点浓度的几何平均值Es和用供试品溶液制成的内毒素溶液B的反响终点浓度的几何平均值Et。Es= lg-1Xs/4Et= lg-1Xt/4式中Xs、Xt分别为C溶液和B溶液的反响终点浓度的对数值lg。时，且当Et在0.5Es和2.

43、0Es包括0.5Es和2.0Es时，那么认为供试品在该浓度下不干扰试验。如果供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，将供试品溶液进行不超过MVD的进一步的稀释后，再重复干扰试验。使用更高灵敏度的鲎试剂并对供试品进行更大倍数的稀释有可能排除干扰。干扰也可通过其他适当的方法排除，如过滤、中和、透析或加热处理等。为确保所选择的处理方法可以有效的排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺有变或当试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。凝胶法检查法1凝胶限量试验 按表2制备溶液A、B、C、D。表2凝胶限量试验溶液的制备 溶液 内毒素浓度/添加了内毒素的溶液 平行管数 A 无/供试品溶液 2 B 2/供试品溶液 2 C 2/检查用水 2 D 无/检查用水 2 溶液A：供试品溶液溶液B：供试品阳性对照溶液C：阳性对照溶液D：检查用水做的阴性对照使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品液来制备溶液A和B。溶液B和C含有相当于2浓度的标准内毒素。溶液D为检查用水。结果判断 保温60分钟2分钟后观察结果。只有当供试品阳性对照溶液B和阳性对照溶液C的平行管都为阳性，阴性对照溶液D的平行管为阴性时，试验方为有效。