整合素和粘着斑激酶在JWA基因抑制诱导的人肺动脉平滑肌细胞迁移调控中的作用.doc

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1、整合素和粘着斑激酶在JWA基因抑制诱导的人肺动脉平滑肌细胞迁移调控中的作用第3,1卷第期第l3贝2005年10月华中科技大学(医学版)maMed1.nivScilechnolHuazhongVo1.34NO.5I.513()n.2005博士后制度实施二十周年纪念专栏整合素和粘着斑激酶在JWA基因抑制诱导的人肺动脉平滑肌细胞迁移调控中的作用陆俊羽张珍祥徐永健邹晖倪望陈士新华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸内科.武汉430030*摘要目的探讨整合素和荇斑激酶是否在JWA基因抑制诱导的人肺动脉平滑肌细胞(PAsMCs)迁移调控中起作用.方法前期实验将Jw.,核鸸基因构建到逆转录病毒载体plXSN

2、上,转染人体外培养的人PASMCs内,并证实转染的JWA特异性核酶基凶能抑制PASMCs内JwA基因的表达.该研究应用改进Boyden小室法测定细胞迁移情况.半定RTICR(sqRTICR)法测定细胞内整合素av,整合素B粘着斑激酶的mRNA表达量.Westernblot法检测细胞内整合素m,整合素B,粘着斑激酶的蛋白表达量.结果与空载体转染细胞(PplXSN组)及未转染细胞(PAsMcs组)比拟.转染JWA核酶基因的细胞(PJwARz组)迁移率显着增加,细胞内整合素,整合素B粘着斑激酶的mRNA及蛋白表达量均显着增加.结论整合素,粘着斑激酶信号通路可能在JWA基因抑制诱导的人肺动脉平滑肌细胞

3、迁移中起调控作用.关键词肌,平滑;整合素;粘着斑激酶中图法分类号R322.7RoleofIntegrinandFocalAdhesionKinaseintheRegulationofHumanPulmonaryArterySmoothMuscleCellsMigrationInducedbyInhibitionofJWAGeneinvitroIuJunyu,ZhangZhenxiang,XuYongjianetalDepartmentOJRespiratoryDiseases-TongjiHospital,TongJiMedicalCollege,HuazhongUniversity0/S(i

4、emeandTe.hnology,Wuhan430030AbstractObjectiveToinvestigatetheroleOfintegrinandfocaladhesionkinase(FAK)intheregulationOfhumanpulmonaryarterysmoothmusclecellsmigrationinducedbyinhibitionOfJWAgene17lvitro.MethodsJWAribozymegenewassubclonedintotheretroviralvectorplXSNandtherecombinantretrovira1vectorwas

5、transfectedintotheculturedPASMCs.ThetransfectedJWAspecificribozymewasconfirmedtOinhibittheexpressionOfJWAgeneinthePASMCs.CellmigrationwasmeasuredbyusingmodifiedBoydenchamber.ThemRNAexpressionOfintegrina,integrin8andFAKincellswasdetectedbysemiquantitativeRTPCRandtheproteinexpressionOfintegrina,integr

6、inB3andFAKbyWesternblot.ResultsIncontrasttOnormalPASMCsgroupandPASMCstransfectedonlywithpIXSNvector(PplXSNgroup),thenumberOfmigratingcellsinthecellstransfectedwithJWAribozymegene(PJWARZgroup)wasincreasedsignificantly.Meanwhile.themRNAandproteinexpressionOfintegrina,integrin良andFAKinthesecellswasalso

7、increasedsignificantly.ConclusionIntegrinandFAKsignalpathwaymayplayaroleinmigrationregulationOfhumanPASMCsinducedbyinhibitionOfJWAgeneexpressionillvitro.Keywordsmuscle,smooth;integrin;focaladhesionkinase肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)由收缩型向合成型转化,并从中膜迁移至内膜是缺氧PASMCs增殖的前提条件.血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移与肌动蛋白细胞骨架的结构变化有关,且整个过程受着细胞内多

8、种生长因子,生物活性物质及多国家自然科学基金资助工程(No.30300l19):【l国博士后科学基金资助工程(No.2005037677)陆俊羽.女.1972年生.博士后条信号转导通路的精密调控,整合素(integrin),粘着斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)是其中重要的信号转导分子.我们在前期实验中,通过将JWA核酶基因逆转录病毒载体转染人体外培养的人PASMCs内,证实该JWA核酶基因能有效抑制JWA基因的表达,可使PASMCs分化为合成表型,并促进细胞迁移.本研究将探讨整合素a,整合素p.和FAK是否在JwA基因抑制诱导的人?514?华中科技大学(医学版)2005

9、年10月第3,1卷第5期肺动脉平滑肌细胞迁移中起调控作用.1材料和方法1.1实验分组及材料我们在前期实验中,构建了JWA核酶基因逆转录病毒载体,转染人体外培养的人PASMCs内(命名为PJWARZ组),同时转染pIXSN空载体人人PASMCs内(命名为PpIXSN组),PpIXSN组和正常人PASMCs细胞(PASMCs组)作为对照组.转染表达的JWA特异性核酶经证实能有效抑制人PASMCs内JWA的表达.RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公可,MMIV逆转录酶购自Promega公司,改进Boyden小室购自江苏海门麒麟医用仪器厂.小鼠抗人FAK单克隆抗体购自美国SantaCr

10、uz公司,兔抗人integrin0【v抗体,兔抗人integrin&抗体购自武汉博士德生物公司,辣根酶标记山羊抗小鼠IgG二抗,辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥生物公司.SuperSignalwestPico化学发光检测底物,蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitorcocktail,PIC)购自美国Pierce公司.1.2细胞迁移的测定用改进Boyden小室法.上下小室间为硝酸纤维素滤膜(8m孔径),下室为平滑肌细胞生长培养基,上室参加D-Hank液制成的细胞悬液(610/m1).在细胞培养箱内(5CO.,37C)静置培养6h,取出滤膜,用棉签将滤膜上室面的细胞擦去

11、,置95乙醇中固定10min,苏木精染色510min,在光镜下计数迁移到滤膜下室面的平滑肌细胞数.每组5张膜,每张膜随机计数5个高倍镜视野的细胞数.1.3sqRT-PCR法检测细胞内integrin及FAKmRNA表达用Trizol提取对数生长期的单层培养细胞的总RNA,RT-PCR检测细胞内integrin.【v,integrin及FAKmRNA表达,以pIactin为内参照.根据人l?-actin基因序列(BCO13835),人integrin叭.基因序列(NM002210),人integrinG基因序列(NM000212),人FAK基因序列(Il36l6),用PRIMER5.0软件设计引

12、物序列.Gactin引物:上游5r_CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC一3;下游5一AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC一3;扩增产物为587bp.integrin0【v基因引物:上游5一GATGGACCAATGAACTGCACT一3,下游5一ACAGCCAGTAGCAACAATCCT一3,扩增产物为491bp.integrinG3基因引物:上游5-ACTGCCGTGACGAGATTGAGF一3,下游5-TCGTGGATGGTGATGAGGAGT一3,扩增产物为268bp.FAK基因引物:上游5一(CT(TGACA(TACAA0GA一3,下游5一(TCACCCAG

13、GTCAGA1vrCA_3,扩增产物为3llbp.PCR采用94C预变性3min;94变性40S,56C退火50S,72C延伸90s,35个循环;7OC10min.PCR产物电泳,紫外灯下观察并照相.照片扫描后,测定各条带积分吸光度值(以灰度表示).以同一管中ihtegrin或FAK和Gactin产物条带积分吸光度值之比(A/A)作数据分析,以此反映integrin或FAKmRNA的表达程度.1.4Westernblot法检测细胞内integrin及FAK蛋白表达收集各组细胞用19-Hank液洗涤3次后,将细胞重悬于细胞裂解液(1NP40,15Ommol/INaC1,2Ommol/IM()PS

14、,1去氧胆酸钠,1mmol/IEDTA,1SDS,101/ml蛋白酶抑制剂)中,冰浴10rain,使细胞充分裂解,12000r/min,4离心2Omin,收集上清,用改进I.owry法进行蛋白定量.取10g蛋白,参加上样缓冲液,100C变性3min后进行SDSPAGE别离,电印迹至硝酸纤维素(NC)膜上.进行封闭,用1:1000的一抗进行杂交,再与1:2000辣根过氧化物酶标记的IgG二抗共同孵育,最后用增强的化学发光试剂显色,X胶片曝光.X胶片扫描后,用英国UVP公司GDS8000型凝胶成像分析系统测定各条带积分吸光度(A)值,以此反映integrin或FAK蛋白的表达程度.1.5统计学分析

15、应用SPSS12.0软件进行数据处理.所有数据均采用(-+-)表示.组问差异用方差分析和(,检验进行比拟.2结果2.1细胞迁移变化经计数,PASMCs组与PpIXSN组之间迁移细胞数无显着差异(P>0,05),而与PASMCs组和PpIXSN组相舒啦光慢眦Ul如fP/XSM(I口【XSN组(均【I.0I).丧丧0JwA梭酶基匿转鞋lJIPASM(,s内integrin和bAK蛋自表达的嚣响PASMCs大量增5直是肺血管结构重建的主要囚索之一.JJ前研究已iI=I=实,PAsM【s收缩型向台成型转化,诈从巾帻迁移至内膜是低氧PASM(s增殖的前提条件此.探讨PASMCs迁移渊控机制.是研究

16、低氧性忡动脉高压,慢月-源性心脏病技其他n管疾病发:l制的重要方向.f【1】制PASMt7s迁移比抑制PASM.增殖或i秀导问亡巫早一个环.可成为治疗低氧性肺动脉高的重要思路研究证实管平滑肌细胞迁移与肌动蛋白细胞骨架的结构变化有关l1肌动蛋白细胞骨架I肌功蛋白丝(F1in)和特抖性的叭动蛋白结合蛋白成.Fattin调过牯巷斑(focaladhesion.FA垫台素与细胞外基质cECM)连接.VSMCs的迁移过程小.FA形成,肌功置白细胞骨架绢装以受档台索在FA处的族集均具有高度动态性,悭个细胞迁移的过程受着细胞内多种生因子生物活性物质受多条信号转通路的精密嗣掩.较艇杂.其fl整台素,FAK缩号

17、通蹄起着重荽作用整台一?516?华中科技大学(医学版)2005年1O月第34卷第5期素不仅作为结构蛋白起黏附,锚定细胞并提供细胞运动牵引力的作用,而且在细胞迁移的信号转导过程中起关键作用.VSMCs主要表达.,.整合素以及各种a整合素亚基口.研究证明,由G蛋白偶联受体,整合素,生长因子受体介导的信号转导在FAK处发生会聚,因此,FAK作为调节细胞基质黏附,细胞运动和细胞形态的信号转导通路的枢纽点,在VSMCs迁移的信号转导中具有举足轻重的作用.JWA基因是从培养的原代人气管,支气管上皮细胞中别离到的受维甲酸(RA)诱导的细胞骨架样基因,该基因eDNA全长2.1kb,开放阅读框序列()RF)位于

18、近5端,共564个核苷酸,编码含188个氨基酸的蛋白质,分子量为21.5kDl6(1kD一0.9921ku).研究提示,在JWA基因的启动子序列中有完整的佛波酯(TPA)反响元件(TRE),JWA蛋白可能是蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)的作用底物_l,在细胞增殖,分化,细胞内通讯,细胞骨架的改变和核运输等方面起重要作用.最近研究发现:JWA蛋白是一种新的微管相关蛋白,与微管蛋白分布根本平行,在绝大多数情况下伴随微管动力学改变(聚合或解聚)而同步发生变化,并且可能参与了细胞有丝分裂的过程l.我们前期实验通过构建JWA核酶基因逆转录病毒载体转染人体外培养的人PASMCs内,证实

19、该JWA核酶基因能有效抑制JWA基因的表达,可使PASMCs分化为合成表型,并促进细胞迁移.本研究发现,与P-pIXSN组及PASMCs组比拟,?期刊文摘?PJWARZ组细胞迁移率显着增加的同时,细胞内整合素a,整合素&,FAK的mRNA及蛋白表达量均显着增加,提示整合素,FAK信号通路可能参与JWA基因抑制而诱导人肺动脉平滑肌细胞迁移的调控.但参与该条信号通路的信号分子较多,且血管平滑肌细胞迁移又不只受这一条信号通路调控,因此,具体作用机制尚需进一步研究.参考文献过氧化物酶体增殖物激活受体对小鼠原代肝细胞即时反响基因和细胞周期蛋白D表达的影响陈德烽?张万广.陈孝平.中华实验外科杂5-,2005,22(8):9lO912为探讨转染小鼠pSG5一过氧化物酶体增殖物激活受体a(pSG5一mPPARa)质粒对小鼠原代肝细胞细胞周期调节基因表达的影响,在小鼠原代肝细胞培养中转染pSG5一mPPARa质粒及参加PPARa配体(wY一14643)后,检测即时反响基因(1EG)如los癌基因(clos1234567891