51DNA粗提取和鉴定.ppt

《51DNA粗提取和鉴定.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《51DNA粗提取和鉴定.ppt（26页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、课题课题1 DNA的提取与鉴定的提取与鉴定一、DNA的粗提取与鉴定的原理1、DNA粗提取的方法和原理（1）提取思路利用利用DNADNA与与RNARNA、蛋白质和脂质等在物理、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取和化学性质方面的差异，提取DNADNA，去，去除其他成分。除其他成分。（2）DNA与蛋白质的性质差异DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。溶液中溶解度不同。DNA在NaClNaCl溶液中的溶解度曲线图溶液中的溶解度曲线图当NaCl浓度低于0.14mol/L时，DNA的溶解度随着NaCl的浓度增加而降低；当高于0.14mol/

2、L时，DNA的溶解度随着NaCl的浓度增加而增加。蛋蛋白白质质溶溶解解度度NaCl浓度蛋白质溶解度随蛋白质溶解度随着着NaCl的浓度增的浓度增加先增加后降低，加先增加后降低，在浓度较高时溶在浓度较高时溶解度较低，蛋白解度较低，蛋白质会析出。质会析出。蛋白质的溶解度与蛋白质的溶解度与NaCl浓度之间的关系浓度之间的关系例如：当NaCl浓度为mol/L时，DNA溶解，而蛋白质部分发生盐析沉淀；而当浓度为0.14mol/L时，DNA析出，而蛋白质溶解。故选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离的目的。DNADNA不溶于酒精溶液，蛋白不溶于酒精溶液，蛋白质则质则溶于酒精

3、，溶于酒精，DNADNA析出，除去溶于酒精的蛋白析出，除去溶于酒精的蛋白质质。DNADNA与蛋白质对酶、高温和洗涤剂的耐受性与蛋白质对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。不同。如：蛋白酶能水解蛋白质，对如：蛋白酶能水解蛋白质，对DNADNA没有影响；大多数蛋白没有影响；大多数蛋白质不能忍受质不能忍受60608080的高温，而的高温，而DNADNA在在8080以上才会变性；以上才会变性；洗涤剂能瓦解细胞膜，但对洗涤剂能瓦解细胞膜，但对DNADNA没有影响。没有影响。2、鉴定原理、鉴定原理在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。DNA+二苯胺二苯胺 蓝色蓝色沸

4、水浴沸水浴二、二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计的粗提取与鉴定的实验设计1、实验材料的选取、实验材料的选取从理论上讲，凡是含DNA的组织都可以作为提取DNA的原材料，但选用含量较高的材料，实验的成功率高。目前通常用鸡血作为实验材料。注意：（1）哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和细胞器，不含DNA，不适合作实验材料。（2）选择鸡血的原因DNA含量丰富，价格便宜，材料易得。鸡血细胞极易吸水涨破（3）若选用其它动物或植物细胞，则必须充分研磨。2 2、实验步骤、实验步骤（1 1）.制鸡血细胞液制鸡血细胞液0.1g/mL柠檬酸檬酸钠100mL活活鸡鲜血鸡鲜血180mL500mL烧杯中，玻棒烧杯中，玻棒搅拌搅

5、拌，离心或静置沉淀。离心或静置沉淀。血浆血浆血细胞血细胞9注意：加柠檬酸钠的目的：抗凝。用玻璃棒缓慢搅拌，使混匀血液与柠檬酸钠溶液，防止血液凝固。静置、离心的目的使血细胞与血浆分离。（2）破碎细胞，获取含DNA的滤液操作：向鸡血中加入20mL的蒸馏水。目的：促进细胞吸水破裂，释放出核物质。操作要求及目的：搅拌（单向、快速、5min），加速血细胞的破裂过滤（12层纱布），除去颗粒较大的杂质（如：细胞膜、核膜等残片），获取含DNA的滤液（3）溶解细胞核内的DNA方案一：操作：向滤液中加入2mol/L的NaCl溶液40mL。目的：溶解DNA（去除杂质）操作要求及目的：搅拌：单向、缓慢、1min；促进

6、DNA的溶解方案二：滤液中加入嫩肉粉方案三：滤液放在温度为6075保温1015min。（4）析出含DNA的黏稠物操作：加蒸馏水至黏稠物不再增加为止。目的：降低NaCl溶液的浓度，析出DNA操作要求及目的：搅拌：单向、轻缓；混匀溶液，促进析出完整的DNA分子。（5）获取含DNA的黏稠物操作：过滤（34层纱布）目的：获取含DNA的黏稠物，滤液不要。（去除溶于0.14mol/LNaCl溶液的杂质。）（6）将DNA的黏稠物再溶解操作：加入2mol/L的NaCl溶液20ml。目的：再次溶解DNA操作要求及目的：搅拌：单向；使黏稠物尽可能多的溶解在溶液中。（7）过滤含有DNA的NaCl溶液操作：过滤（34

7、层纱布）目的：过滤掉杂质，收集含有DNA的滤液（去除不溶于2mol/LNaCl溶液的杂质。）到此为止一共经历了几次过滤？能不能总结过滤前加入了什么？纱布上留下什么？（8）提取杂质较少的DNA操作：加入冷却的与滤液体积相等的、体积分数为95%的酒精溶液，静置23min目的：让部分杂质溶于酒精，析出含杂质较少的DNA。操作要求及目的：搅拌：单向；促进杂质溶解、DNA的析出用玻璃棒卷起丝状物，用滤纸吸水；获得DNA（白色丝状物）（9）DNA的鉴定操作：向2支试管中各加入2mol/L的NaCl溶液5mL，将丝状物（自变量）放入其中一直试管中。各加入4mL二苯胺试剂。目的：设置对照操作要求及目的：搅拌：

8、促进DNA的溶解沸水浴5min，冷却后观察颜色，丝状物所在试管中溶液变蓝色。盛放鸡血细胞的容器最好是塑料容器（鸡血细胞破碎后释放的DNA，容易被玻璃容器吸附，造成提取过程中DNA的损失）加蒸馏水或加入酒精用玻棒搅拌时,动作要轻缓且朝一个方向。保证DNA分子的完整性。使用时注意玻璃棒不要碰到烧杯底。19注意事项注意事项粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白质和脂质沉淀DNA时必须用冷酒精。体积分数为95%的冷酒精可抑制核算水解酶活性，防止DNA降解，使DNA易形成沉淀析出，低温还有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。实验中出现的丝状物是DNA，实际上每一根丝都是由许多DNA分子聚集在一起的，所以丝

9、状物的直径大小并不表示一个DNA分子直径的大小。三、三、DNA的粗提取与鉴定的实验操作分析的粗提取与鉴定的实验操作分析1、实验中两次加入蒸馏水的目的第一次加入是在步骤“破碎细胞，获取含DNA的滤液”中，加入的目的是使鸡血细胞吸水涨破，加水后必须充分搅拌，且搅拌时间不应少于5min。第二次加入是在步骤“析出含DNA的黏稠物”中，加入目的是稀释NaCl溶液，使DNA逐渐析出。2、实验中有3次加入2mol/L的NaCl溶液，作用均为溶解DNA。第一次过滤第一次过滤第二次过滤第二次过滤第三次过滤第三次过滤溶液中含DNA的核物质溶于0.14mol/LNaCl溶液的杂质DNA纱布上细胞膜、核膜等残片DNA

10、不溶于2mol/LNaCl溶液的杂质过滤前加入的物质蒸馏水蒸馏水NaCl溶液过滤目的去除细胞膜、核膜等杂质去除溶于NaCl溶液的杂质去除不溶于NaCl溶液的杂质3、实验中共有三次过滤、实验中共有三次过滤4、实验中六次搅拌第一次：搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液，加速细胞破裂。第二次：搅拌含DNA的高浓度NaCl溶液，加速DNA的溶解。第三次：搅拌加蒸馏水的NaCl溶液，均匀稀释以析出更多DNA。第四次：搅拌含DNA的高浓度NaCl溶液，加速DNA的溶解。第五次：搅拌含DNA的酒精溶液，提取含杂质较少的DNA。第六次：搅拌含白色丝状物（DNA）的NaCl溶液，加速DNA的溶解。下图为下图为“DNADNA

11、粗提取和鉴定粗提取和鉴定”实验的相关操作。这些操作目的正确实验的相关操作。这些操作目的正确的是的是（）A.A.是洗涤血细胞，去除血细胞表面的杂质是洗涤血细胞，去除血细胞表面的杂质B.B.是溶解是溶解DNADNA，去除不溶于酒精的杂质，去除不溶于酒精的杂质C.C.是溶解是溶解DNADNA，去除不溶于，去除不溶于2 mol/L NaCl2 mol/L NaCl溶液的杂质溶液的杂质D.D.是稀释是稀释NaClNaCl溶液，去除不溶于低浓度溶液，去除不溶于低浓度NaClNaCl溶液的杂质溶液的杂质 是释放核物质是释放核物质是提纯是提纯DNADNA，去除溶于酒，去除溶于酒精的杂质，精的杂质，稀释稀释Na

12、ClNaCl溶液，析出溶液，析出DNADNA。C242 2：下列图示中能反映：下列图示中能反映DNADNA溶解度溶解度与与NaClNaCl溶液溶液浓度浓度(mol/L)(mol/L)之间的关系的是（之间的关系的是（）C C0.140.14DNADNA溶溶解解度度0.140.140.140.140.140.14DNADNA溶溶解解度度DNADNA溶溶解解度度DNADNA溶溶解解度度A AB BC CD DNaClNaCl浓度浓度NaClNaCl浓度浓度NaClNaCl浓度浓度NaClNaCl浓度浓度25C0.14DNA析析出出量量0.140.140.14DNA析析出出量量DNA析析出出量量DNA析析出出量量ABDNaCl浓度浓度NaCl浓度浓度NaCl浓度浓度NaCl浓度浓度3：下列图示中能反映：下列图示中能反映DNA析出量与析出量与NaCl溶液浓度溶液浓度(mol/L)之间的关系的是之间的关系的是 （）B溶解度与析出量的关系是溶解度与析出量的关系是相反相反26