日粮血浆蛋白_肠道免疫系统及肠黏膜的屏障功能.pdf

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1、在断奶仔猪日粮中添加喷雾干燥的血浆蛋白粉（S p r a y-d r i e d p l a s m a，S D P），能提高断奶仔猪的日增重、日采食量和饲料转化率，减轻腹泻(C o f f e y 等，2 0 0 1)。许多有关感染致病菌（埃里氏大肠杆菌，沙门氏菌，巴氏杆菌）、病毒（轮状病毒，冠状病毒，白斑综合症病毒）或原生动物（隐孢子虫）的研究发现：给动物饲喂猪血或牛血来源的血浆蛋白粉，可降低许多动物的死亡率和发病率，表明其可作为抗生素的替代品（Q u i g l e y 等，2 0 0 4；T o r r a l l a r d o n a 等，2 0 0 7）。加拿大某猪场的流行病学研

2、究发现：日粮添加血浆蛋白粉可降低由猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪型圆环病毒所引起的死亡率(D e w e y 等，2 0 0 6)。口服一种从牛血浆中分离出的约含有 5 0 的 I g G的蛋白组分，可改善儿童的病毒性胃肠炎（G u a r i n o等，1 9 9 4），并已用于治疗艾滋病患者由于角虫感染所引起的腹泻（G r e e n b e r g 和 C e l l o，1 9 9 6）。由此推断，I g G是 S D P发挥作用的主要原因(V a n D j i k 等，2 0 0 1)。然而，人的血浆中已被证实含有 2 5 0 多个肽(A n d e r s o n 等，2 0 0 2

3、)。S D P 中的许多蛋白质在经过喷雾干燥后仍显示生物学功能（B o r g 等，2 0 0 2）。尽管，I g G在 S D P中发挥主要作用这一推断合乎逻辑，但是，许多其他的血浆复合物在口服 S D P时的各种反应中可能也发挥作用。为了更好地了解 S D P在肠道免疫系统和肠道屏障功能中的作用，利用大鼠的轻度肠道炎症模型设计了一系列的实验。该模型基于大鼠感染金黄色葡萄球菌肠毒素 B（S E B），S E B是一种可激活肠黏膜免疫系统的肠毒素，对有结构的 G A L T和弥散G A L T都有影响。S E B还增加了肠黏膜的渗透性、增加了肠管中水的分泌、减少了小肠对葡萄糖的吸收。本文的主要

4、目的是为了更好地了解 S D P在黏膜水平上的作用机制以及 S D P在肠道炎症反应中的潜在调节机制。本文的第二个目的是比较 S D P和血浆蛋白成分（P P F）的不同作用，P P F是从血浆中分离出来的含有约 5 0 I g G的物质（除去血浆中大部分的纤维蛋白和白蛋白）。1肠道免疫系统肠道是机体最大的免疫器官，肠黏膜免疫系统与宿主和肠道菌群相互作用，在防止病原微生物的入侵中发挥重要的作用。肠黏膜免疫系统通过表面上皮的先天性免疫和获得性免疫来维持其稳态(K i y o n o 等，2 0 0 4)。8 0 的肠黏膜免疫系统是由肠道相关淋巴组织构成，肠道相关淋巴组织在肠道中以有结构的实体形式

5、分布，由派尔集合淋巴结、孤立淋巴滤泡和肠系膜淋巴结组成，或者以弥散的形式分布，则由沿着上皮和固有层(1 a m i n a p r o p r i a，L P)散在分布的淋巴细胞组成(G r a n g e r 等，2 0 0 6)。两种G A L T在调节系统中分别发挥不同的作用，其中有结构的 G A L T作为免疫反应的诱导部位，而弥散G A L T 作为免疫反应的效应部位。本综述的试验结果源自于 S E B诱导的大鼠轻度肠道炎症模型。对 3 0日龄和 3 3日龄的 Wi s-t a r-L e w i s 大鼠腹腔注射抗原 S E B，使之产生肠道炎症反应，使得辅助性 T淋巴细胞被激活，

6、许多参与炎症反应的细胞数量增加（P r e z-B o s q u e等，2 0 0 4，2 0 0 8 b）。在所有试验中，试验动物均在 2 1 日龄断奶后分配到不同的日粮处理组，饲喂到 3 5 日龄，然后将其杀死。S E B能诱导先天性免疫系统中的中性粒细胞增殖（P r e z-B o s q u e 等，2 0 0 4）和嗜酸性粒细胞增殖。日粮添加 S D P并未改善 S E B对中性粒细胞的诱导作用，但减少了嗜酸性粒细胞的数量和脱颗粒程度（图 1）。日粮添加 S D P 或 P P F 后，抑制了抗原S E B对集合淋巴结、固有层和上皮内的 C D4细胞（如 T h细胞）的诱导活化（P

7、 r e z-B o s q u e等，2 0 0 4，2 0 0 8 b；图 2）。这些结果表明：大鼠饲喂 S D P或 P P F，能够降低 S E B对辅助性 T淋巴细胞的诱导活化。活化的辅助性 T 淋巴细胞可释放一种细胞日粮血浆蛋白、肠道免疫系统及肠黏膜的屏障功能M.M o r e t 等著，公衍玲1译，朱翠2校（1.华南农业大学动物科学学院，广东 广州 5 1 0 6 4 2；2.广东省农业科学院畜牧研究所，广州 5 1 0 6 4 0）广东饲料 第 18 卷第 10 期2009 年 10 月国 外 科 技3 7?图 2在大鼠轻度肠道炎症模型中，日粮中添加 S D P和P P F，对

8、派尔集合淋巴结（P P，图 A）和固有层（L P，图 B）中活化T 淋巴细胞和细胞毒性T 细胞数量的影响。C D2 5（活化的 T 淋巴细胞），C D2 5/C D4（活化的辅助性 T 淋巴细胞），C D2 5/C D8（活化的抑制性或细胞毒性 T 细胞），自然杀伤（N K）细胞和 型 T 细胞（表达 型 T 细胞受体的 T 淋巴细胞）均为免疫细胞，图 A表示派尔集合淋巴结中不同免疫细胞占淋巴细胞总数的比例，图 B表示固有层内每平方毫米的免疫细胞数。图 1 在大鼠轻度肠道炎症模型中，日粮补充来源于猪血的浓缩血浆（血浆蛋白粉，S D P）和血浆蛋白组分（P P F）对固有层嗜酸性粒细胞的影响。图

9、 A表示对嗜酸性粒细胞数量的影响，图 B表示对嗜酸性粒细胞的活化作用，用颗粒脱落程度来表示。*号表示与对照组相比差异显著（P0.0 5）；号表示与S E B组相比差异显著（P0.0 5）。以下同。因子，进而放大先天性免疫系统和获得性免疫系统（M o w a t，2 0 0 3）。型 T细胞亚群通过增加肠黏膜表面的淋巴细胞和单核细胞数量流量来调节炎症反应（S o l t y s 和 Q u i n n，1 9 9 9）。大鼠感染金黄色葡萄球菌肠毒素 B后，增加了派尔集合淋巴结和固有层中的 型 T淋巴细胞和以及上皮内的淋巴细胞。血浆蛋白可减少派尔集合淋巴结和固有层中 型T细胞的数量，由此，证实了日

10、粮中添加的 S D P可调节免疫反应的假说。但是，在日粮中添加 P P F 只能够抑制 S E B对固有层的作用（P r e z-B o s q u e 等，2 0 0 4，2 0 0 8 b）。N o f r a r a s 等报道（2 0 0 6）在猪的研究中了报道了类似的结果，日粮添加的 S D P减少了回盲淋巴结中的 型 T 细胞，减少了白细胞在肠黏膜上的渗透。这些结果与 J i a n g 等（2 0 0 0）日粮添加的S D P降低了肠绒毛内固有层的细胞密度相一致。N o f r a r i a s 等（2 0 0 6）研究表明添加 S D P对未受感染的断奶仔猪的 G A L T

11、作用也十分明显。社会、环境和营养物质等因素的改变对仔猪造成的应激（P l u s k e 等，1 9 9 7 年），肠道炎症反应和全身性炎症反应与这些应激有关（M c C r a c k e n 等，1 9 9 9）。当机体受到感染时，炎性细胞因子的分泌上调。这些炎性细胞因子作为化学诱导剂，可诱导黏附分子的表达，黏附分子从而辅助应对感染的免疫细胞定植。此外，细胞因子还可刺激免疫细胞的功能成熟，进而对病原体作出应答（或识别）。一组抗炎细胞因子为了平衡炎性细胞因子，可抑制免疫反应，从而防止自身的免疫系统伤害到宿主本身（L i p p o l i s，2 0 0 8）。在大鼠的适度肠道炎症模型中，S

12、 E B感染导致空肠黏膜中的肿瘤坏死因子 （T N F-）和干扰素 （I F N-）释放增加(M o r e t 等，2 0 0 8)。S D P 和P P F都能抑制 S E B对炎性细胞因子的诱导释放作用，表明日粮中添加的血浆参与炎症状态下黏膜细胞因子平衡的改变。B o s i 等（2 0 0 4）也指出，S D P可降低感染大肠杆菌 K 8 8 的早期断奶仔猪肠道炎性细胞因子的表达。二者一致认为：S D P通过抑制细胞因子表达来调节免疫反应。调节性 T 细胞（T-r e g 淋巴细胞）也具有免疫抑制功能，其产生的细胞因子（如转化生长因子-和 I L-1 0）不同于 T h1细胞和 T h

13、2细胞。受到抗原刺激后，T-r e g 淋巴细胞能够特异性地抑制辅助性 T细胞的免疫反应（I i j i m a 等，2 0 0 1；J a n e w a y，2 0 0 1）。我们实验室最近的研究结果表明，日粮中添加的S D P 可增加感染 S E B大鼠肠道水平（P P结和肠黏膜）及系统水平的 I L-1 0的分泌（M o r e t 等，2 0 0 8）。这此结果证实了以下观点：S D P 通过调节炎性细胞因子和抗炎细胞因子的平衡来调节机体对毒素和其他病原体的免疫反应。?广东饲料 第 18 卷第 10 期2009 年 10 月国 外 科 技3 8图 4 在大鼠轻度肠道炎症模型中，日粮中

14、补充 S D P 和P P F 对空肠通透性的影响。利用分子量为 4 k D a（F D）的荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖在整个肠壁上的跨膜流量情况来估测肠道的通透性。图 3 在大鼠轻度肠道炎症模型中，日粮补充 S D P 和 P P F对粪便中水分含量（表示湿重百分比）的影响。2屏障功能肠上皮的主要功能是作为一种选择性的屏障允许营养物质的摄取，而阻碍毒素和微生物的入侵。然而，肠上皮对肠腔中的内容物并不是完全不渗透的，为此，溶剂和溶质从黏膜流向浆膜时要受到严格的控制。肠黏膜的通透性主要取决于紧密连接有效封闭顶端上皮细胞的能力。上皮细胞间隙被一种叫做 c l a u d i n 的内嵌蛋白所占据，此蛋

15、白结合到支架蛋白如 Z O-1蛋白上，Z O-1蛋白再反过来将其连接到网状的细胞骨架上（B a r r e t t，2 0 0 8）。在疾病状态下，尤其是当肠道受到肠腔抗原的感染时，肠黏膜屏障功能将发生急剧变化。肠上皮的通透性受到若干刺激的调节。分泌性腹泻与通透性的增加有关（T o i v o l a 等，2 0 0 4）。梭状芽孢杆菌和弧菌分泌的毒素能改变一些紧密连接蛋白的定位（C h e n 等，2 0 0 2）或减少紧密连接的链数（S o n o d a 等，1 9 9 9）。此外，肠毒素也可通过诱导炎性细胞因子如 I F N-Y和 T N F-的释放间接地影响肠上皮的通透性，这两种细胞

16、因子可减少 Z O-1蛋白和闭合蛋白（o c c l u d i n）的表达，从而使上皮细胞的通透性增加（T s u k i t a等，2 0 0 2；B r u e w e r 等，2 0 0 3）。金黄色葡萄球菌肠毒素 B也会刺激淋巴细胞分泌 I F N-和 T N F-，可分解紧密连接蛋白复合体，进而增加微血管内皮细胞的细胞旁路通透性（N u s r a t 等，2 0 0 0）。我们观察到 S E B使肠管中水分的含量增加，表明 S E B影响水的吸收和分泌的平衡（P r e z-B o s q u e等，2 0 0 4）。图 3 表示：在第二次注射 S E B后，日粮中的 S D P

17、和 P P F对肠毒素的抑制作用可达 2 4 小时，而 S D P 在 4 8 小时后仍发挥效用。其他研究结果表明：日粮添加血浆可改善动物的健康；例如，通过口服来补充犊牛血清，可改善角虫感染所引起的腹泻（H u n t 等，2 0 0 2），并可减轻冠状病毒对犊牛机体造成的损伤（A r t h i n g t o n 等，2 0 0 2）。肠腔内渗透压的改变（如养分吸收或排泄减少）或黏膜通透性的改变引起了肠管中水的增加。因为葡萄糖和氨基酸的吸收几乎不受不影响（见下文），于是我们猜想可否用旁细胞通透性的变化来解释对肠腔中水含量的变化的影响。为此，我们测量了示踪剂的透壁流量和控制旁细胞通透的紧密连

18、接蛋白质的表达。采用两种示踪剂，荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖（F D，4 k D）和辣根过氧化物酶（H R P），分子量为 4 0 k D，与食物抗原蛋白类似。S E显著增加了 F D的跨膜流量；添加 S D P和P P F可抑制这一效应（图 4）。金黄色葡萄球菌肠毒素 B也促进了 H R P的跨膜流量，而添加 S D P和P P F具有降低这种作用的趋势。然而，F D和 H R P的流量值存在显著的正相关关系，这表明：动物感染肠毒素后，旁细胞途径有助于增加肠道中蛋白质的跨膜运输。金黄色葡萄球菌肠毒素 B降低了Z O-1 蛋白和-c a t e n i n 蛋白的表达，而这两种蛋白质与 F D流量

19、呈负相关，这表明：在上皮细胞水平上，葡聚糖流量的增加与 Z O-1和-c a t e n i n表达的下降是两个平行的过程（图 5）。这些结果表明：S E B诱导 F D流量的增加与上皮紧密连接复合体的减少有关；在日粮中添加 S D P和 P P F，在一定程度上能改善了这一诱导作用（图 5）。S E B的诱导作用与所描述的注射 S E B小鼠的症状类似（L u 等，1 9 9 8）。日粮添加的 S D P和 P P F可降低毒素诱导的肠黏膜通透性增加，阻止病原微生物和食物抗原进入肠道，进而阻断局部炎症反应（S a n-Treatment广东饲料 第 18 卷第 10 期2009 年 10 月

20、国 外 科 技3 9 图 6 在大鼠轻度肠道炎症模型中，日粮中补充S D P 和 P P F对空肠刷状缘处的 N a+-葡萄糖转运蛋白-1 表达的影响。图 5 在大鼠轻度肠道炎症模型中，日粮中补充浓缩血浆（血浆蛋白粉，S D P）和血浆蛋白组分（P P F）对上皮中的Z O-1 蛋白和-C a t e n i n 蛋白在肠道水平上表达的影响。t o s 等，2 0 0 1）。这些影响主要是炎性细胞因子引起的，因为它们是有 S E B诱导产生的（H u a n g 等，1 9 9 8），而且促进了抗原的旁细胞路途(T o i v o l a 等，2 0 0 4)。肠毒素如 S E B可 刺 激

21、淋 巴 细 胞 分 泌 干 扰 素 和T N F-，这两种细胞因子可分解紧密连接蛋白（N u s r a t 等,2 0 0 0）或降低其表达（T s u k i t a 等，2 0 0 2）。肠道通透性的增加会引发局部炎症反应，如溃疡性结肠炎、炎症性肠病(M c K a y，2 0 0 1)。3 养分吸收对于养殖场的动物，其肠道感染可能会引起肠道炎症、肠绒毛萎缩或吸收障碍等，导致较高的死亡率（v a n D i j k 等，2 0 0 2）。在不同的动物模型中研究了肠道炎症对养分吸收的影响。对于新生的大鼠，角虫感染不影响其体内肽的转运（M a r q u e t，2 0 0 7），但扰乱了

22、A A的吸收，导致营养不良和生长受阻，且无法通过自身清除寄生虫获得修复（T o p o u c h i a n 等，2 0 0 1）。脂多糖（L P S）通过一个复杂的细胞机制抑制了肠道对 D-半乳糖的吸收，这个机制可能涉及到刷状缘处与 N a+耦合的葡萄糖和半乳糖的转运体转录后的调控过程 S G L T 1（A-m a d o r 等，2 0 0 7 。脂多糖还通过一个与 T N F-有关的机制来降低肠黏膜上的葡萄糖转运体-5 的表达，该 蛋 白 是 刷 状 缘 上 果 糖 的 特 异 转 运 体（G a r c a-H e r r e r a 等，2 0 0 8）。T N F-抑制了兔肠道

23、对 D-果糖的摄取（G a r c a-H e r r e r a 等，2 0 0 4），而 I F N-则下调了 T8 4细胞对 D-葡萄糖的转运（Y o o 等，2 0 0 0）。这些研究结果表明，炎症过程中产生的细胞因子参与调控养分运输蛋白的表达。我们利用 S E B模型研究发现，肠毒素并不影响 L-亮氨酸、L-蛋氨酸和 L-赖氨酸盐酸盐的吸收速率，但通过 S G L T 1 降低了空肠中 D-葡萄糖的转运能力（G a r r i g a 等，2 0 0 5）。D-葡萄糖的转运能力的下降是由于刷状缘膜上 D-葡萄糖转运体的表达减少引起的，如 V m a x（最大转运能力动力学常量）的下降

24、。通过对 S G L T 1 的免疫染色分析证实了这一观点符合 F e r r a r i s 等（1 9 9 0）的观点。S G L T 1 免疫染色表明，该蛋白质在吸收性上皮细胞上沿着隐窝-绒毛轴线分布，在绒毛顶端表达量大于在中部和基底部的表达（图 6）。由此，得出的结论是：我们所观察到的感染 S E B大鼠体内的D-葡萄糖转运动力学的改变是由于对 S G L T 1 的功能造成了特定的影响。S D P提高了 S G L T 1 的最大转运能力。P P F则起中间调节作用。We s t e r n b l o t的分析进一步证实了 S D P对 S G L T 1表达的影响（G a r r

25、 i g a 等，2 0 0 5 年）。尽管 S D P的作用机制尚存在争议；但有证据表明，它可降低早期断奶仔猪因感染大肠杆菌 K 8 8而引起的炎性细胞因子在 G A L T中的表达（B o s i等，2 0 0 4 年）。此外，我们实验室的研究表明，补充的血浆可能会改变黏膜中的炎性细胞因子和抗炎细胞因子的平衡（M o r e t 等，2 0 0 8）。这些研究结果表明，S D P 可能通过减少黏膜中的炎性细胞因子来影响 S G L T 1的表达。黏膜炎性细胞因子可降低S G L T 1 在体内的表达（G a r c a-H e r r e r a 等，2 0 0 4，2 0 0 8）和 S

26、 G L T 1 在体外的表达（Y o o 等，2 0 0 0）已被证实。G a r r i g a 等（2 0 0 5）估测，在对照组的大鼠中，对生理管腔浓度为 5 0 m m o l/L的 D-葡萄糖，2 5 通过转导机制被吸收，7 5 通过简单扩散被吸收；而在 S E B感染的大鼠中，6 通过转导被吸收，9 4 通过简单扩散被吸收。如果我们假设，在消化间期，广东饲料 第 18 卷第 10 期2009 年 10 月国 外 科 技4 0图 7 该图总结了 S D P 或 P P F 的作用模式。食物蛋白抗原和共生菌的产物均可被派尔集合淋巴结中的 M细胞、固有层中的树突状细胞（D C）或通过跨

27、细胞途径（尤其是在发育的初期阶段）所摄取。然后，被抗原提呈细胞转呈给初始的 C D4T 细胞，并将其激活。被激活的淋巴细胞产生炎性细胞因子，放大免疫反应，诱导炎症细胞进行修复。发生炎症反应时，免疫细胞释放活性氧（R O S），以消除入侵的病原体；但是，释放的活性氧物质可能会导致肠道改变和组织损伤。日粮添加血浆蛋白可在管腔水平上调节免疫反应（如对微生物的增殖、病原体的吸附进行修饰）；存在于血浆中的生物活性化合物也可以直接与黏膜免疫细胞作用。血浆可通过诱导黏膜细胞因子发生改变来阻止或逆转免疫系统激活所产生的有害影响。I E L=上皮内淋巴细胞;T-r e g=调节 T 淋巴细胞;A P C=抗原提

28、呈细胞;T h 1=1型辅助性 T 细胞;T h 2 细胞=2 型辅助性 T 细胞。?管腔 D-葡萄糖浓度值通常为 0.2 m m o l/L（F e r r a r i s等，1 9 9 0），S D P将使肠道对 D-葡萄糖的吸收量提高 8 9。这个作用虽小但非常重要，在动物日粮中添加 S D P可提高其生长速率和饲料转化率（C o f f e y 等，2 0 0 1）。4作用模式S D P 的作用可能是可直接提高食物摄入量（例如，通过改善适口性来增加采食量；E r m e r 等，1 9 9 4），或者是 S D P以其他机制在管腔、黏膜和系统水平上发挥间接的作用。v a n D i j

29、 k 等（2 0 0 1）就S D P的管腔效应进行了报道，指出 S D P可增强肠管的免疫活性，减少管腔抗原借助于血浆糖蛋白与黏膜结合。最近的研究结果表明，S D P 对于生长性能的作用机制涉及到对 G A L T的调节。B o s i 等（2 0 0 4）发现，在受到感染的猪中，对于日粮中添加 S D P的猪，其炎性细胞因子的表达减少。我们实验室的研究结果表明，日粮补充的血浆减少了黏膜中的炎性细胞因子的表达（M o r e t 等，2 0 0 8），降低了固有层和上皮细胞中的活化的辅助性 T淋巴细胞的表达（P r e z-B o s q u e 等，2 0 0 8 b）。对黏膜细胞因子的这

30、些影响可用来解释：日粮添加的血浆降低了黏膜上的炎症反应，以及 S D P和 P P F抑制了由 S E B引起的黏膜的通透性的改变（P r e z-B o s q u e 等，2 0 0 4）、紧密连接蛋白表达的下降（P r e z-B o s q u e等，2 0 0 6）以及养分吸收的改变（G a r r i g a 等，2 0 0 5）。S D P和 P P F可通过很多种可能的方式来调节肠道免疫反应。浓缩血浆是一个复杂的混合物，包含生长因子、细胞因子及其他生物活性化合物。这些蛋白质可以与肠黏膜上的免疫细胞相互作用，从而改变细胞因子的环境。最后，S D P 测得比 P P F 影响更多个

31、变量，证实了这一假说：S D P 含有的多种蛋白质有助于 S D P 发挥作用（图 7）。5 总结和结论血浆蛋白粉可降低对动物（如猪和大鼠）免疫反应的过度激活，使更多的可利用能量和营养物质用于生长和其他繁殖性能，而不是被转化用于免疫反应。在 S E B诱导大鼠轻度肠道炎症反应中，S D P 可降低黏膜中的炎性细胞因子的产生，增加了抗炎细胞因子 I L-1 0的数量。证实了这一假说，S D P通过增加 I L-1 0 的分泌来降低对黏膜免疫反应的过度刺激。S D P 在系统水平上同样发挥作用。例如，当猪感染脂多糖时，它可降低炎性细胞因子在外周组织中的表达（T o u c h e t t e 等，

32、2 0 0 2），并且，在 L P S诱导肺炎模型中，它还可抑制活化淋巴细胞数量的增加（P r e z-B o s q u e 等，2 0 0 8 a）。因为有结构的 G A L T是一个诱导位点，与局部和外周的效应部位（呼吸道、腺体组织以及子宫黏膜）相接，可进一步推测，S D P可能会降低对广泛的共黏膜免疫系统的过度刺激。译自J A N I M S C I2 0 0 9：8 7 E 9 2-1 0 0D i e t a r y p l a s m a p r o-t e i n s,t h ei n t e s t i n a l i m m u n es y s t e m,a n dt h eb a r r i e r f u n c t i o n s o ft h e i n t e s t i n a l m u c o s a 广东饲料 第 18 卷第 10 期2009 年 10 月国 外 科 技4 1