生物分离工程 第八章 电泳技术(精品).ppt
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1、电泳技术电泳技术Electrophoresis本章主要知识点本章主要知识点uu电泳的概念电泳的概念uu电泳的基本原理电泳的基本原理uu电泳技术的分类电泳技术的分类uu常用的凝胶电泳技术有哪些?常用的凝胶电泳技术有哪些?uu电泳装置的基本组成电泳装置的基本组成uu聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程uuSDS-PAGESDS-PAGE电泳的基本原理及过程电泳的基本原理及过程uu琼脂糖电泳的特点及其应用琼脂糖电泳的特点及其应用uu等电聚焦电泳的基本原理等电聚焦电泳的基本原理uu双相电泳的概念及其特点双相电泳的概念及其特点学习总体要求学习总体要求 掌握电泳概念,电泳速度及凝胶电泳
2、,了解掌握电泳概念,电泳速度及凝胶电泳,了解其他几种常见电泳原理及特点,操作及应用。其他几种常见电泳原理及特点,操作及应用。电泳概念uuArne TiseliusArne Tiselius物理化学家、诺贝尔奖金获得者物理化学家、诺贝尔奖金获得者uu定义定义荷电的胶体粒子在电场中的移动;荷电的胶体粒子在电场中的移动;uu电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层,离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时,层,离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时,电泳现象变得越明显。因此,电泳现象中的电泳现象变得越明显。因此,电泳现象中的表面表面电势电势和和双电层双电层的因
3、素起着决定性的作用。的因素起着决定性的作用。电泳的简单原理uu蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中,蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中,它们的净电荷取决于介质的它们的净电荷取决于介质的H H+浓度或与其它大浓度或与其它大分子的相互作用。分子的相互作用。uu带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺尺寸大小寸大小和和形状形状、分子所带电荷分子所带电荷或或分子的生物学分子的生物学与化学特性与化学特性。Stokes Law(斯托克斯定律)uu如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中,使颗粒具有恒定
4、迁移速率的驱动力来自于颗粒上的中,使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷有效电荷Q Q和电位梯度和电位梯度E E,它们与介质的摩擦阻力它们与介质的摩擦阻力f f相抗相抗衡,这种抗衡服从斯托克斯定律:衡,这种抗衡服从斯托克斯定律:f=6rvuv是是介质粘度为介质粘度为 中中半径为半径为r r的的颗粒的移动速度颗粒的移动速度。uu但实际情况中,但实际情况中,f 还取决于凝胶厚度、颗粒尺寸、甚还取决于凝胶厚度、颗粒尺寸、甚至是介质的内渗等。至是介质的内渗等。电泳迁移率uu电泳迁移率(电泳迁移率(mobilitymobility):在电位梯度在电位梯度E E的影响下,的影响下,带电颗粒在
5、时间带电颗粒在时间t t中的迁移距离中的迁移距离d d。uu其单位是其单位是cmcm2 2secsec-1-1 V V-1-1uu电泳迁移率的不同提供了从混合物中分离不同物电泳迁移率的不同提供了从混合物中分离不同物质的基础质的基础电泳的大致分类uu依据电泳原理,现有三种形式的电泳分离系统移动界面电泳(移动界面电泳(moving boundary electrophoresismoving boundary electrophoresis)区带电泳(区带电泳(zone electrophoresis zone electrophoresis)稳态电泳(稳态电泳(steady state elec
6、trophoresis steady state electrophoresis)其中区带电泳是目前常用的电泳系统。区带电泳的主要技术uu区带电泳中的常用技术载体电泳:粉末电泳、纸电泳、载体电泳:粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、凝胶电泳、聚焦电泳聚焦电泳无载体电泳:自由电泳、无载体电泳:自由电泳、毛细管电泳毛细管电泳凝胶电泳uu作为电泳支持介质必须具有:化学惰性、不干扰大分作为电泳支持介质必须具有:化学惰性、不干扰大分子的电泳过程,化学稳定性好、均匀、重复性好、电子的电泳过程,化学稳定性好、均匀、重复性好、电内渗小等特性。内渗小等特性。uu凝胶电泳的支持介质:凝胶电泳的支持介质:聚丙烯酰胺凝胶聚丙
7、烯酰胺凝胶(polyacrylamidepolyacrylamide gel,PGA gel,PGA)由丙烯酰胺和交联剂由丙烯酰胺和交联剂N N,N-N-甲叉双丙烯酰胺在引发甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下,聚合而成;剂和增速剂的作用下,聚合而成;琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶:从琼脂中精制分离出的胶状多糖,其分子结构大部从琼脂中精制分离出的胶状多糖,其分子结构大部分是由分是由1,31,3连接的连接的-D-D吡喃半乳糖和吡喃半乳糖和1,41,4连接的连接的3,63,6脱水脱水-D D吡喃半乳糖交替形成的;吡喃半乳糖交替形成的;丙烯酰胺的聚合uu丙烯酰胺的聚合通常是由化学或光化学过程完成的,通丙烯酰
8、胺的聚合通常是由化学或光化学过程完成的,通常采用过硫酸铵、过硫酸钾或核黄素(常采用过硫酸铵、过硫酸钾或核黄素(引发剂引发剂)来引发)来引发该过程;以该过程;以N N,N N,NN,N-N-四甲基乙二胺(四甲基乙二胺(TEMEDTEMED)为为增速剂增速剂。uu该引发该引发-增速的催化系统实质是自由基催化的氧化增速的催化系统实质是自由基催化的氧化-还原还原过程。过程。uu丙烯酰胺的化学聚合是由过硫酸铵在碱性条件下,产生丙烯酰胺的化学聚合是由过硫酸铵在碱性条件下,产生游离氧自由基引发单体丙烯酰胺成为自由基状态,经过游离氧自由基引发单体丙烯酰胺成为自由基状态,经过一系列的自由基反应得到的聚合物;一系
9、列的自由基反应得到的聚合物;影响聚合的主要因素uu引发剂和增速剂的浓度引发剂和增速剂的浓度:浓度小易导致聚合速度慢;浓度:浓度小易导致聚合速度慢;浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变;一般控制过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变;一般控制使聚合过程在使聚合过程在40604060分钟内完成。分钟内完成。uu系统系统pHpH值值:酸性条件、碱性条件均可,但仍然存在一个最:酸性条件、碱性条件均可,但仍然存在一个最佳佳pHpH值,以获得最佳的聚合结果;值,以获得最佳的聚合结果;uu温度温度:低温下聚合导致凝胶变脆和混浊;适当提高温度可:低温下聚合导致凝胶变脆和混浊;适当提高温度可以是凝胶透
10、明而有弹性;以是凝胶透明而有弹性;uu分子氧分子氧:分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合;抽气:分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合;抽气uu系统纯度:金属离子会影响凝胶的聚合;系统纯度:金属离子会影响凝胶的聚合;聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应uu在在使用凝胶介质的电泳中,由于电泳介质具有高粘度使用凝胶介质的电泳中,由于电泳介质具有高粘度和高的摩擦阻力,因此不仅可以防止对流,而且可以和高的摩擦阻力,因此不仅可以防止对流,而且可以把扩散减到最小。把扩散减到最小。uu凝胶中的大分子分离取决于它的凝胶中的大分子分离取决于它的电荷电荷、尺寸尺寸和和形状形状uu凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的凝
11、胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力(尺寸筛分能力(Size sieving capacitySize sieving capacity),),这种现象被称这种现象被称为为分子筛效应分子筛效应(molecular sieving effectmolecular sieving effect)分子筛效应图中图中A A,B B,C C均为阳离子,在直流电场作用下电泳情况示意图均为阳离子,在直流电场作用下电泳情况示意图分子量大小依次为分子量大小依次为MA=MBMCMA=MBMC,所带电荷量相同所带电荷量相同Q QA A=Q=QB B=Q=QC C。ABC+-琼脂糖凝胶的性能、结构
12、与特点其优点如下:其优点如下:uu琼脂糖凝胶孔径较大琼脂糖凝胶孔径较大,0.075%0.075%琼脂糖的孔径为琼脂糖的孔径为800nm800nm,可以分析百万道尔顿分子量的大分子,但分辨率较可以分析百万道尔顿分子量的大分子,但分辨率较凝胶电泳低。凝胶电泳低。uu机械强度高:可以在浓度机械强度高:可以在浓度1%1%以下使用;以下使用;uu无毒;无毒;uu染色、脱色程序简单,背景色较低;染色、脱色程序简单,背景色较低;uu热可逆性热可逆性;uu生物中性生物中性:一般不与生物材料结合;:一般不与生物材料结合;uu电内渗(电内渗(EEOEEO)大:对于对流电泳有益大:对于对流电泳有益电泳新介质N-N-
13、取代聚丙烯酰胺介质:取代聚丙烯酰胺介质:uuPoly-N-acryl-Poly-N-acryl-tristris(NAT)gel(NAT)geluuN-N-AcryloylAcryloyl sugars sugarsuuAcryloylmorpholineAcryloylmorpholineuuHydrolinkHydrolink gels gelsuuN-N-acryloylaminoethoxyeacryloylaminoethoxye thanolthanol(AAEE)(AAEE)特点:特点:特点:特点:uu具有极强的水解稳定性具有极强的水解稳定性uu具有高度亲水性具有高度亲水性uu孔
14、径大孔径大电泳系统的基本组成uu电泳槽电泳槽:是凝胶电泳系统的核心部分,管式电泳槽、:是凝胶电泳系统的核心部分,管式电泳槽、垂直板电泳槽、水平板电泳槽垂直板电泳槽、水平板电泳槽uu电源电源:聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳200600V200600V,载体两性电解质载体两性电解质等电聚焦电泳等电聚焦电泳10002000V10002000V,固相梯度等电聚焦固相梯度等电聚焦30008000V30008000Vuu外循环恒温系统外循环恒温系统:高电压会产生高热,需冷却;高电压会产生高热,需冷却;uu凝胶干燥器凝胶干燥器:用于电泳和染色后的干燥;用于电泳和染色后的干燥;uu灌胶模具灌胶模具:制胶
15、,玻璃板和梳子;:制胶,玻璃板和梳子;uu电泳转移装置:利用低电压,大电流的直流电场,使电泳转移装置:利用低电压,大电流的直流电场,使凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上,凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上,如如PVDFPVDF膜膜uu电泳洗脱仪:回收样品电泳洗脱仪:回收样品uu凝胶扫描和摄录装置:对电泳区带进行扫描,从而给凝胶扫描和摄录装置:对电泳区带进行扫描,从而给出定量的结果。出定量的结果。垂直电泳槽及灌胶模具垂直电泳槽及灌胶模具电泳的一般过程常规聚丙烯酰胺凝胶电泳原理:原理:uu由于聚丙烯酰胺凝胶电泳(由于聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGEPAGE)是多孔介质,不仅是多孔介
16、质,不仅能防止对流,把扩散减少到最低;而且其孔径大小与能防止对流,把扩散减少到最低;而且其孔径大小与生物大分子具有相似的数量级,生物大分子具有相似的数量级,能主动参与生物分子能主动参与生物分子的分离,具有分子筛效应的分离,具有分子筛效应。uu因此,在使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离时,因此,在使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离时,在电泳过程中在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密度,还取决不仅取决于蛋白质的电荷密度,还取决于蛋白质的尺寸和形状。于蛋白质的尺寸和形状。uuPAGEPAGE可以用圆盘电泳、垂直电泳或水平电泳可以用圆盘电泳、垂直电泳或水平电泳电泳前的准备工作uu缓冲系统的选择:保
17、证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物活性的保持;活性的保持;电泳时间和分辨率:从理论上讲电泳时间和分辨率:从理论上讲PAGEPAGE可可以在任何以在任何pHpH进行,但实际上过酸或过碱的进行,但实际上过酸或过碱的条件下将发生某种水解(脱酰胺)。因此,条件下将发生某种水解(脱酰胺)。因此,pHpH应限制在应限制在310310之间。之间。缓冲系统的选择原则uu是两种标准的对立权衡 如果缓冲液的如果缓冲液的pHpH选择在远离样品中各种蛋白的等电选择在远离样品中各种蛋白的等电点,蛋白质分子所带电荷的密度大,电泳时间短,点,蛋白质分子所带电荷的密度大,电泳时间短,区带细
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