第二章 蛋白质(3).ppt

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1、第二章第二章 蛋白质蛋白质(3)2.6.蛋白质的性质与分离、分析技术蛋白质的性质与分离、分析技术2.6.1 蛋白质的性质蛋白质的性质（1）蛋白质的分子量）蛋白质的分子量蛋白质的相对分子量很大，一般在蛋白质的相对分子量很大，一般在蛋白质的相对分子量很大，一般在蛋白质的相对分子量很大，一般在10,00010,0001,000,0001,000,000之间。之间。之间。之间。（二）蛋白质的两性电离及等电点蛋白质也是两性电解质。能解离的基团除-氨基和-羧基以外，还有侧链的-氨基、-羧基、-羧基、咪唑基、胍基、酚基、巯基等。蛋白质的两性解离pH=pIpHpI蛋白质的等电点与其氨基酸的种类和数量有关。如鱼

2、精蛋白（12-12.4）、胃蛋白酶（1-2.5）。等电点时蛋白质溶解度最小，容易聚集而沉淀。因此，可利用此特性进行分离、提纯。电泳（electrophoresis）带电的大分子化合物在电场中移动（与带电荷相反）的现象称为电泳。蛋白质分子电泳的方向和速度取决于其带电性、电荷多少、分子量以及颗粒大小。电泳法常用于混合蛋白质的分离和提纯。（三）蛋白质的变性（三）蛋白质的变性变性（变性（denaturation）：天然蛋白质因受物理或化学的因素影响，其分子内部原有的高度规律性结构发生变化，致使蛋白质的理化性质和生物学性质有所改变，但并不导致蛋白质一级结构的破坏，这种现象称变性作用。蛋白质变性的实质：高

3、级结构被破坏，共价键不变，生物活性丧失。引起蛋白质变性的因素：强酸碱、尿素、胍、去污剂、重金属盐、三氯醋酸、磷钨酸、苦味酸、浓乙醇；加热、紫外线、X射线、超声波等。变性蛋白质的特性变性蛋白质的特性（1）生物活性全部或部分丧失（2）一些侧链基团暴露，可滴定基团增加（3）一些物理化学性质的改变（4）生化性质的改变变性的可逆性巯基乙醇作为巯基的保护剂巯基乙醇作为巯基的保护剂许多蛋白质变性时被破坏严重，不能恢复，称为不可逆性变性 蛋白质变性的应用生活常识生活常识1蛋白质热变性的应用蛋白质热变性的应用 高温瞬间灭菌；加热破坏食物中的有毒蛋白，使之失去生理活性；在加工蔬菜、水果时，先用热水烫漂，可使维生素

4、C氧化酶或多酚氧化酶变性而失活，从而减少加工过程中维生素C由于酶促氧化的损失和酶促褐变；在烹饪中在烹饪中 爆、炒、烟等方法，由于进行快速高温加热，加快了蛋白质变性的速度，原料表面因变性凝固、细胞孔隙闭合，从而原料内部的营养素和水分不会外流，可使菜看的口感鲜嫩，并能保住较多的营养成分不受损失。经过初加工的鱼、肉在烹制前有时先用沸水烫一下，或在较高的油锅中速炸一下，也可达到上述的目的。例如，在制作干烧鱼时，先将鱼放人热油中，炸成七成熟后，再放人加有调味品的汤烧制，不仅鱼肉鲜嫩可口，而且形优色美，诱人食欲。2蛋白质其他变性的应用蛋白质其他变性的应用酸、碱、有机溶剂、振荡等因素也会引起蛋白质变性，并均

5、可在烹饪中得到应用。蛋白质的pH值处于4以下或10以上的环境中会发生酸或碱引起的变性，在制作松花蛋时，就是利用碱对蛋白质的变性作用，而使蛋白和蛋黄发在制作松花蛋时，就是利用碱对蛋白质的变性作用，而使蛋白和蛋黄发生凝固；生凝固；酸奶饮料和奶酪的生产，则是利用酸对蛋白质的变性作用；酸奶饮料和奶酪的生产，则是利用酸对蛋白质的变性作用；牛奶中的乳糖在乳酸菌的作用下产生乳酸，牛奶中的乳糖在乳酸菌的作用下产生乳酸，pH值下降引起乳球蛋白凝值下降引起乳球蛋白凝固，同时使可溶性的酪蛋白沉淀析出。固，同时使可溶性的酪蛋白沉淀析出。酒精和其他有机溶剂也能使蛋白质变性，酒精和其他有机溶剂也能使蛋白质变性，鲜活水产品

6、的醉腌就是利用这一原理，通过酒浸醉死，不再加热，即可食用，如醉蟹、醉虾等。搅拌搅拌 将蛋白质进行不断的搅拌，由于液层产生了应力，导致蛋白质空间结构被破坏而引起变性，变性后的蛋白质肽链伸展；由于连续不断的搅拌，不断地将空气掺入到蛋白质分子内部中去，肽链可以结合许多气体，使蛋白质体积膨胀，形成泡沫。如果在较低的温度或时间较短的情况下进行搅拌或振荡，只能破坏蛋白质的三级和四级结构，这种变性是可逆的，如蛋清拍打后产生的泡沫，放置后又可回复为蛋清。新鲜蛋品所含的卵粘蛋白较多，经过剧烈搅拌后，容易形成泡沫；当蛋品新鲜度下降后，卵粘蛋白即分解成糖和蛋白质，使整个蛋清变稀薄，从而影响起泡。因此制作蛋泡糊、装点

7、菜肴或制作糕点时，应选用起泡性强的新鲜蛋。（四）蛋白质的胶体性质蛋白质相对分子量大，在水溶液中的形成的颗粒具有胶体溶液的特征（布朗运动、丁道尔现象、电泳现象、不能透过半透膜以及具有吸附能力等）。（五）蛋白质的沉淀反应1.加高浓度盐类盐析（盐析（salt out）：高浓度盐可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象，称盐析。如点卤。2.加有机溶剂破坏蛋白质的亲水层。3.加重金属盐碱性溶液中与重金属离子作用而沉淀。4.加某些酸类能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。（六）蛋白质的颜色反应1.双缩脲反应红紫色红紫色2.米伦氏反应

8、米伦试剂：硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液。蛋白质加入米伦试剂后产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。含有酚基的化合物都有此反应。3.乙醛酸反应蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁缓缓加入浓硫酸，在两液层之间会了现紫色环。凡含有吲哚基（色氨酸）的化合物均有此反应。4.坂口反应精氨酸分子中的胍基，能与次氯酸钠及-萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物。5.酚试剂（Folin试剂）反应酪氨酸中的酚基能将Folin试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物。（七）蛋白质的紫外吸收大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸收与含有哪几种氨基酸有关？这些氨基酸在结构上有什么特点？蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学蛋白

9、质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从研究的基础。自从1953年年F.Sanger测定测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。上千种不同蛋白质的一级结构被测定。2.6.3蛋白质一级结构的测定胰岛素胰岛素一级结构，即有 21 和 30 个氨基酸组成的 A、B 两条肽链种氨基酸的排列顺序，及其中一个链内两个链间二硫键的位置。测定步骤1、测定蛋白质分子中多肽链的数目。测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。的关系

10、，即可确定多肽链的数目。摩尔数相等，则只有一条；残基摩尔数是蛋白质倍数，则为多条。2、多肽链的拆分。多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价键力；应用过甲氧酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键3、测定氨基酸的组成利用酸水解法完全水解多肽，测定并计算各种氨基酸的分子比！LysMetValCysIlePheThrTrp纸层析图谱与茚三酮作用4、测定多肽链的氨基酸排列顺序1）多肽链断裂成多个肽段多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。多肽的选择性降解多肽的选择性降解的方法的方法

11、有：酶解法：利用酶选择性的水解多肽链中的某一类肽键Lys-Phe-Leu-Arg-Tyr-Trp化学法：溴化氰水解法，能够选择性地切割由甲硫氨酸的羧基形成的肽键！专一性强，分析含甲硫氨酸的肽段的一个理想方法！这个选择性主要针对羧基端的肽键来说的！2）多肽链末端氨基酸测定测定N-端氨基和C-端羧基（重要的是N-端分析法）几种典型的方法A、二硝基氟苯法（DNFB法，Sanger法）DNP-氨基酸游离氨基酸色谱法鉴定！抽取碱性条件下(H+)B、丹磺酰氯法很强的荧光性，灵敏度高可达10-9碱性条件下C、肼解法（多肽链C-端氨基酸分析法）肼化物苯甲醛不溶物3）循环顺序分析法）循环顺序分析法 Edman，

12、1956年，N-端分析法特点：不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离（PTC）（PTC-多肽）（PTH-氨基酸）广泛应用的一种生化分析仪氨基酸顺序分析仪自动化程度高可测定只有10-3mg的样品例题：有一7肽，经分析氨基酸的组成是：Lys、Leu、Arg、Phe、Ala、Tyr、Ser；此肽与DNFB反应产生DNP-Phe；经糜蛋白酶作用，该肽断裂成游离的Phe和两个肽段，两个肽段的氨基组成分别为Ala、Tyr、Ser和Leu、Lys 和Arg，两个肽段与DNFB反应分别产生DNP-Ser和DNP-Lys；（糜蛋白酶只水解芳香族氨基酸的羧基端的肽键）此7肽与胰蛋白酶作用，只产生两

13、个肽段（胰蛋白酶只水解Lys或Arg的羧基端肽键）。问：此7肽的一级结构是什么？并简要写出分析过程解答：1）与DNFB反应产生DNP-Phe，得N端为Phe；2）经糜蛋白酶作用，此肽断裂为Phe和两个肽段Ala，Tyr，Ser与Leu、Lys、Arg，推测该肽端第四位为Tyr（糜蛋白酶作用点）；3）两个肽段与DNFB作用分别产生DNP-Ser和DNP-Lys，得该肽第二位为Ser，第三位为Ala，第5 位为Lys；4）此7肽与胰蛋白酶作用，只产生两个肽段，说明C末端即第7位必为Arg，并与第六位Leu相连，若C端为Leu的话，则Arg位于倒数第2位，其N端与Lys相连，C端与Arg相连，胰蛋白酶就会有两个作用点。该7肽的顺序是：N-Phe-Ser-Ala-Tyr-Lys-Leu-Arg-C作作业P61-62：3，（要求，（要求说明原因）明原因）4，6，（要求写出分析，（要求写出分析过程）程）7，（要求写出，（要求写出计算算过程）程）