(精品)1.2《基因工程的基本操作程序》.ppt
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1、1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序团风中学团风中学 吴建兵吴建兵1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤一、目的基因的获取一、目的基因的获取(一一)、目的基因主要是、目的基因主要是_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因(二)、获取目的基因的常用方法有哪些(二)、获取目的基因的常用方法有哪些?1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、
2、人工合成、人工合成阅读教材阅读教材P8-11如:与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、如:与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。1 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因(1 1).基因文库基因文库 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断,导入片断,导入到受体菌的群体中,各个受体菌分别含有这种生物的到受体菌的群体中,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,
3、称为基因文库。不同基因,称为基因文库。种种类类基因组文库:基因组文库:含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库:部分基因文库:只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因,基因,如:如:cDNA文库文库非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子终止子终止子基因的结构基因的结构启动子启动子原核原核真核真核原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非非编码区编码区非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋白质。不编码蛋白
4、质。:编码蛋白质:编码蛋白质 ,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构调控遗传信息表达调控遗传信息表达,上上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点:启动子启动子真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显外显子:能编码蛋白质的序列子:能编码蛋白质的序列内含子:不能编码蛋白质的序列内含子:不能编码蛋白质的序列:有调控作用:有调控作用,上游
5、有上游有RNARNA聚合聚合酶结合位点酶结合位点(启动子启动子)。非非编码序列:编码序列:包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子非非编码序列:编码序列:包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的,边的,边_边边_编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的,先的,先_后后_相同点相同点都由都由能够编码蛋白质的能够编码蛋白质的_和具有和具有调控作用的调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码转录转录翻译翻
6、译转录转录翻译翻译1下列关于基因结构的认识中,正确的是下列关于基因结构的认识中,正确的是()A大豆基因中内含子是能够编码蛋白质的序列大豆基因中内含子是能够编码蛋白质的序列B乳酸菌与酵母菌基因结构中都存在外显子和内含子乳酸菌与酵母菌基因结构中都存在外显子和内含子C大肠杆菌基因与大肠杆菌基因与RNA聚合酶结合位点位于编码区的聚合酶结合位点位于编码区的下游下游D水稻细胞基因的编码区中存在非编码序列水稻细胞基因的编码区中存在非编码序列2(多选)原核细胞与真核细胞基因结构的共同特点(多选)原核细胞与真核细胞基因结构的共同特点是是()A编码区都有能编码蛋白质的序列编码区都有能编码蛋白质的序列B编码区都是连
7、续的编码区都是连续的C非编码区都能调控遗传信息的表达非编码区都能调控遗传信息的表达D非编码区都有非编码区都有RNA聚合酶结合的位点聚合酶结合的位点DACD提取某种生物的提取某种生物的全部全部DNADNA用适当的限制酶酶切用适当的限制酶酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接重组载体重组载体基因组文库基因组文库导入受体菌中储存导入受体菌中储存(2 2).基因文库的构建方法基因文库的构建方法基因组文库的构建基因组文库的构建提取某种生物的提取某种生物的某器官某器官或或特定发育时期特定发育时期的的mRNAmRNA单链单链DNADNA双链双链cDNAcDN
8、A片段片段重组载体重组载体与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反(逆)转录酶反(逆)转录酶DNADNA聚合酶聚合酶导入受体菌中储存导入受体菌中储存 cDNA文库的构建文库的构建-逆转录法:逆转录法:mRNARNADNA杂合双链杂合双链单链单链DNA双链双链DNA逆逆转转录录(cDNA)DNA聚合酶聚合酶真核生物的基因用逆转录法得到真核生物的基因用逆转录法得到的的cDNA与原基因相同吗?有哪些差异与原基因相同吗?有哪些差异?原核生物基因呢?原核生物基因呢?思考思考?编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区DNA聚合酶聚合酶剪接有关的酶剪接有
9、关的酶RNA聚合酶聚合酶mRNA前体前体mRNA单链单链DNAcDNA逆转录酶逆转录酶转录转录剪接剪接逆转录逆转录复制复制启动子启动子启动子启动子终止子终止子基因基因不含不含非编码非编码系列系列。即不。即不含含非编码区非编码区和和内含子内含子(3 3)构建基因文库的目的)构建基因文库的目的 怎样从基因文库中得到我们所怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢需的目的基因呢?便于在便于在不知道目的基因核苷酸序列不知道目的基因核苷酸序列的情况下,获得所需的目的基因。的情况下,获得所需的目的基因。依据:目的基因的有关信息。依据:目的基因的有关信息。如:根据基因的核苷酸序列如:根据基因的核苷酸序列 基因
10、的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性(4)从基因文库中得到目的基因的方法)从基因文库中得到目的基因的方法直接分离法直接分离法(鸟枪法鸟枪法)直接分离法直接分离法供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶限制酶受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离(鸟枪法鸟枪法)回顾必修课中目的基因的获取方法有哪些?回顾必修课中目的基因的获取方法有哪些?多用于原核生物多用于原核生物某生物体内全部
11、某生物体内全部DNADNA 许多许多DNADNA片段片段受体菌群体受体菌群体限制酶限制酶与运载体连接导入与运载体连接导入基因组文库基因组文库cDNAcDNA反转录反转录受体菌群体受体菌群体与运载体连接导入与运载体连接导入部分基因文库部分基因文库(cDNA文库)文库)基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较某种生物某个时期的某种生物某个时期的mRNAmRNA基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较构建基因组
12、构建基因组DNA文库时,首先应分离细胞的文库时,首先应分离细胞的A、染色体、染色体DNAB、线粒体、线粒体DNAC、总、总mRNAD、tRNA目的基因可从基因文库中获得,下列有关基因文库的目的基因可从基因文库中获得,下列有关基因文库的描述正确的是描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多、将含有某种生物不同的许多DNA片段,导入某个片段,导入某个生物生物体内,则这个生物就是一个基因文库体内,则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的
13、一部分基因的基因文库叫、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文文库库AC2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念:概念:PCRPCR全称为全称为_,是一项,是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。原理:原理:_多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶DNADNADNADNA复制复制复制复制的条件的条件的条件的条件:模板DNA、脱氧核苷
14、酸脱氧核苷酸、解旋酶、引物酶引物酶、DNA聚合酶、DNA连接酶引物引物PCR技术技术v原理:原理:v前提:前提:v原料:原料:v优点优点过程:过程:PCR扩增仪扩增仪DNA复制复制已知目的基因的一段核苷酸序列已知目的基因的一段核苷酸序列:以:以_方式扩增,方式扩增,在短时间内大量扩增目的基因在短时间内大量扩增目的基因指数指数模板模板DNA;DNA引物;四种脱氧引物;四种脱氧核苷酸;热稳定核苷酸;热稳定DNA聚合酶聚合酶(Taq酶);离子酶);离子变性变性 复性复性延伸延伸过程:过程:a a、DNADNA变性变性(90-9590-95):):双链双链DNADNA模板在热作用下,模板在热作用下,_
15、断裂,形成断裂,形成_b b、退火、退火(复性复性55-6555-65):):系统温度降低,系统温度降低,引物引物与与DNADNA模模板结合,形成局部板结合,形成局部_。c c、延伸、延伸(70-7570-75):在):在TaqTaq酶酶的作用下,合成与模板的作用下,合成与模板互补的互补的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链d.重复重复a.b.ca.b.c步骤:每重复一步骤:每重复一次,目的基因增加次,目的基因增加_倍倍一一过程:过程:PCRPCR反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成指数指数指数指数(2(2n n)形式扩增形式扩增
16、形式扩增形式扩增方式:以方式:以_方式扩增,即方式扩增,即_(n n为扩增循为扩增循环的次数)环的次数)条件:条件:_、_、_ _、_ _、前提条件、前提条件:_:_ 结果:结果:模板模板DNA(DNA(含目的基因含目的基因)四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使使_在短时间内成百万倍地扩增在短时间内成百万倍地扩增已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列含目的基因的含目的基因的DNADNA片段片段DNA复制复制PCR技术技术场所场所原理原理条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的
17、比较碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模四种脱氧核苷酸、模板、酶、板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、模板、酶、模板、酶、引物引物DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋解旋酶催化解旋半保留复制、半保留复制、边解旋变复制边解旋变复制半保留复制、半保留复制、全解旋再复制全解旋再复制体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶、聚合酶、解旋酶、解旋酶、DNA连接酶等连接酶等 1 1个个DNADNA分子进行分子进行P
18、CRPCR扩增扩增,循环循环4 4次,理论上至少需要次,理论上至少需要几个引物几个引物?2(2n-1)(n为循循环次数次数)(24-1)2=30蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因化学合成化学合成推测推测推测推测3、人工合成法:、人工合成法:在在基因较小,核苷酸序列已知的情况基因较小,核苷酸序列已知的情况下,下,可以利用可以利用DNA合成仪人工合成合成仪人工合成化学法合成的目化学法合成的目的基因含的基因含内含子、启内含子、启动子和终止子动子和终止子吗?吗?反转录法反转录法目的基因的信使目的基因的信使RNAR
19、NA目的基因目的基因化学合成法化学合成法肽链氨基酸序列肽链氨基酸序列信使信使RNARNA序列序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因合成合成人工合成法(人工合成法(真核生物真核生物)推测推测推测推测单链单链DNADNA合成合成那么原核生物和真核生物基因结构有没有区别呢?那么原核生物和真核生物基因结构有没有区别呢?一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成种种类类基因组文库:基因组文库:含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库:部分基因文库:只包含了一种生物的只
20、包含了一种生物的部分部分基因,基因,如:如:cDNA文库文库课堂小结:课堂小结:2 2、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是()()利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成A.B.C.D.A.B.C.D.1在已知在已知基因的核苷酸基因的核苷酸序列的情况下,获取目的序列的情况下,获取目的基因的最方便方法是基因的最方便方法是A、化学合成法、化学合成法B、基因组文库法、基因组文库法C、CDNA文库法文库法D、聚合酶链反应、聚
21、合酶链反应3 3、在基因工程中,把选出的一个目的基因(共在基因工程中,把选出的一个目的基因(共10001000个脱氧核苷酸对,其中腺嘌岭脱氧核苷酸是个脱氧核苷酸对,其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460460个)放入个)放入DNADNA扩增仪中扩增扩增仪中扩增4 4次,那么,在扩增次,那么,在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是(仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是()个)个A.540B.8100C.17280D.75601.加热至加热至95摄氏度的目的是使摄氏度的目的是使DNA中的中的断裂,这一过程在细胞内是通过断裂,这一过程在细胞内是通过解旋酶解旋酶的作用来完成的。的作用来完成的。2.当温度降低时,
22、引物与模板末端结合,在当温度降低时,引物与模板末端结合,在DNA聚合酶的作用下,引物沿模板延伸,最聚合酶的作用下,引物沿模板延伸,最后合成后合成2个个DNA分子,此过程中的原料分子,此过程中的原料,遵循的原则是,遵循的原则是。3.Taq酶的特点是(酶的特点是()A.耐强酸耐强酸B.耐强碱耐强碱C.耐高温耐高温D.最适温度最适温度37摄氏度摄氏度4.请指出请指出PCR技术与技术与DNA复制过程的区别复制过程的区别在遗传工程中,若有一个控制有利性状的在遗传工程中,若有一个控制有利性状的DNA分子分子片段为片段为ATGTGTACAC,要使其数量增多,可用,要使其数量增多,可用PCR技术进行人工复制,
23、复制时应给予的条件是技术进行人工复制,复制时应给予的条件是双链双链DNA分子为模板分子为模板ATGTG或或TACAC模板链模板链四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸四种核苷酸四种核苷酸DNA聚合酶聚合酶热热稳定稳定DNA聚合酶聚合酶引物引物温度变化温度变化恒温恒温ABCDD在基因工程中,把选出的目的基因(共在基因工程中,把选出的目的基因(共1000个脱氧核个脱氧核苷酸对,其中腺嘌岭脱氧核苷酸是苷酸对,其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个)放入个)放入DNA扩扩增仪中扩增增仪中扩增4代,那么,在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核代,那么,在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是苷酸的个数是A.540个个 B.8100
24、个个 C.17280个个D.7560个个B在已知序列信息的情况下,获取目的基因的最方便在已知序列信息的情况下,获取目的基因的最方便方法是方法是A、化学合成法、化学合成法B、基因组文库法、基因组文库法C、cDNA文库法文库法D、聚合酶链反应、聚合酶链反应下列获取目的基因的方法中需要模板链的是下列获取目的基因的方法中需要模板链的是从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因利用利用PCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因反转录法反转录法通过通过DNA合成仪利合成仪利用化学方法人工合成用化学方法人工合成ABC DAD(1 1)用一定的)用一定的_切切割质粒,使其出现一个切口,割质粒,使其出现一个切
25、口,露出露出_。(2 2)用)用_切断目切断目 的基因,使其产生的基因,使其产生_ _ _。(3 3)将切下的目的基因片段插入质粒的)将切下的目的基因片段插入质粒的_处,再加入适量处,再加入适量_,形成了一个重组,形成了一个重组 DNADNA分子(重组质粒)分子(重组质粒)限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同1.1.过程过程:v基因表达载体的构建质粒质粒目的基因目的基因限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶表表达达载载体体同一种同一种
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- 基因工程的基本操作程序 精品 1.2 基因工程 基本 操作 程序
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