分瓶细胞株细胞细胞系动物细胞培养过程.ppt

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1、动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体制备单克隆抗体制备细胞核移植细胞核移植动物动物细胞细胞工程工程技术技术动物细胞工程动物细胞工程的基础的基础动物细胞的培养和核移植技术动物细胞的培养和核移植技术一、动物细胞培养一、动物细胞培养（一）、概念（一）、概念 是指从动物机体内取出相关的是指从动物机体内取出相关的组织组织，将它分散，将它分散成成单个细胞单个细胞，然后放在适宜的，然后放在适宜的培养基培养基中，让中，让这些细胞这些细胞生长生长和和增殖增殖。（二）、原理（二）、原理细胞分裂增殖细胞分裂增殖（三）过程（三）过程 幼龄动物幼龄动物取动物器官取动物器官和组织和组织剪碎组织剪碎组

2、织胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理单个细胞单个细胞细胞培养细胞培养动物动物胚胎胚胎或或幼龄幼龄动动物的组织、器官物的组织、器官胰蛋白酶胰蛋白酶剪碎剪碎单个细胞单个细胞加培养液加培养液制成制成细胞细胞悬浮悬浮液液接触接触抑制抑制部分细胞部分细胞“癌变癌变”，无限传代，无限传代10代细胞代细胞原原代代培培养养传代培养传代培养细细胞胞贴贴壁壁剥离、分瓶剥离、分瓶细胞株细胞株细胞细胞细胞系细胞系2.动物细胞培养过程：动物细胞培养过程：50代细胞代细胞（大多死（大多死少不死）少不死）（大多死（大多死少不死）少不死）强调一：细胞贴壁过程强调一：细胞贴壁过程细胞贴壁：细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴在培养

3、瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。附在瓶壁上，称为细胞贴壁。培养瓶或培养皿壁要求：培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于表面光滑、无毒、易于帖附。帖附。当贴壁细胞分裂生当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细殖，这种现象称为细胞的接触抑制。胞的接触抑制。强调二：接触抑制强调二：接触抑制有关概念有关概念:原代培养：原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。原代细胞。传代培养：传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以

4、上的制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。培养瓶中继续培养，称为传代培养。有关概念有关概念细胞株：细胞株：原代细胞一般传至原代细胞一般传至1010代左右细胞代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到活到40504050代，这种传代细胞为细胞株。代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞系：细胞株传代至细胞株传代至5050代后又出现细胞代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞

5、为细胞系。种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。容易传代培养。动物动物胚胎胚胎或或幼龄幼龄动动物的组织、器官物的组织、器官胰蛋白酶胰蛋白酶剪碎剪碎单个细胞单个细胞加培养液加培养液制成制成细胞细胞悬浮悬浮液液接触接触抑制抑制部分细胞部分细胞“癌变癌变”，无限传代，无限传代10代细胞代细胞原原代代培培养养传代培养传代培养细细胞胞贴贴壁壁剥离、分瓶剥离、分瓶细胞株细胞株细胞细胞细胞系细胞系2.动物细胞培养过程：动物细胞培养过程：50代细胞代细胞（大多死（大

6、多死少不死）少不死）（大多死（大多死少不死）少不死）思考题：思考题：1 1、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？做动物细胞培养材料？2 2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？因为这些组织或器官，分裂能力因为这些组织或器官，分裂能力旺盛，易于培养。旺盛，易于培养。成块组织使细胞靠在一起限制了细胞的生长和成块组织使细胞靠在一起限制了细胞的生长和增殖，且细胞不能与培养液充分接触，不利于增殖，且细胞不能与培养液充分接触，不利于培养。培养。3、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间、胰蛋白

7、酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？的物质是什么成份？催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋白质白质(胶原蛋白等胶原蛋白等)。4、细胞膜的主要成份是什么？、细胞膜的主要成份是什么？蛋白质和磷脂蛋白质和磷脂5、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？能能6 6、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？织分散成单个细胞要注意什么问题呢？7 7、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？注意时间的控制注意时间的控制 不能，因为两者的最

8、适不能，因为两者的最适PHPH不同，而正常组织不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PHPH较接近较接近3.3.总结：动物细胞总结：动物细胞培养过程培养过程动物胚胎或幼龄动物的动物胚胎或幼龄动物的组织、器官组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液剪碎用胰蛋白酶处理剪碎用胰蛋白酶处理1010代细胞代细胞转入培养瓶转入培养瓶40-5040-50代细胞代细胞传传代代培培养养无限传代无限传代单个细胞单个细胞加培养液稀释加培养液稀释传代传代1010代以内，代以内，遗传物质不改变，遗传物质不改变，保持保持正常正常二倍体核型二倍体核型。传代传代10-5010-50代左右，增长缓慢

9、以代左右，增长缓慢以至于完全停止，至于完全停止，部分细胞核型可部分细胞核型可能发生变化能发生变化（遗传物质可能改变（遗传物质可能改变）为什么用胰蛋白酶处理？为什么用胰蛋白酶处理？原代培养特点：原代培养特点：细胞贴壁、接触细胞贴壁、接触抑制抑制继续传代培养少部分细胞继续传代培养少部分细胞获得不获得不死性死性，细胞突变细胞突变，遗传物质已经遗传物质已经改变改变，等同于癌细胞等同于癌细胞。原原代代培培养养归纳归纳过程过程取取 的组织、器官的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液 酶酶 细胞贴壁、细胞贴壁、接触抑制接触抑制 培养培养 10 10代细胞代细胞 培养培养细胞株细胞株无限传代无限传代细胞系细胞系单个

10、细胞单个细胞加加 液液遗传物质遗传物质 改变改变遗传物质遗传物质 改变改变动物胚胎或幼龄动物动物胚胎或幼龄动物胰蛋白胰蛋白培养培养原代原代传代传代未未已已50代细胞代细胞讨论讨论对于多细胞生物来说，细胞都生活在内环对于多细胞生物来说，细胞都生活在内环境中，根据你所学的知识，认为体外培养境中，根据你所学的知识，认为体外培养细胞应该需要什么样的条件？细胞应该需要什么样的条件？4 4.动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件:1 1）无菌无毒）无菌无毒 的环境：的环境：适宜的温度：适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为人和哺乳动物细胞最适温度为36.50.5。适宜的酸碱度：适宜的酸碱度：PH：7.2-7

11、.4液体合成培养基：（液体合成培养基：（糖、氨基酸）、促生长糖、氨基酸）、促生长因子、（无机盐、微量元素）因子、（无机盐、微量元素）等；通常还等；通常还需加入需加入血浆、血清等血浆、血清等天然成分。天然成分。4 4）气体环境：）气体环境：2 2）营养：）营养：3 3）温度和）温度和pHpH：“95空气+5CO2”的混合气体培养箱。氧气是细胞代谢必须的；CO2维持培养液的PH。对培养液和所有培养用具对培养液和所有培养用具无菌处理；无菌处理；培养液培养液中中添加抗生素添加抗生素防止培养过程中污染；防止培养过程中污染；定期更定期更换培养液换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞以清除代谢产物，防止对培

12、养细胞造成危害。造成危害。5.动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体、基因工程技术、病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体、基因工程技术、检测有毒物质、医学应用等。检测有毒物质、医学应用等。植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的细胞的 细胞细胞培养基特有培养基特有成分成分 、植物激素、植物激素 葡萄糖、葡萄糖、培养结果培养结果植物体植物体培养目的培养目的快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株无病毒植株获得获得全能性全能性增殖增殖蔗糖蔗糖动物动物血清血清细胞株、细胞系细

13、胞株、细胞系细胞细胞 2 2、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是细胞是 （）A A获得不死性的细胞获得不死性的细胞 B B1010代以内细胞代以内细胞 C C原代细胞原代细胞 D D传代细胞传代细胞1 1、动物细胞工程技术的基础是、动物细胞工程技术的基础是 （）A.A.动物细胞融合动物细胞融合 B.B.单克隆抗体单克隆抗体 C.C.胚胎移植胚胎移植 D.D.动物细胞培养动物细胞培养A AD D课堂反馈练习课堂反馈练习3 3、在动物细胞培养的有关叙述中正确的是：（、在动物细胞培养的有关叙述中正确的是：（）A A、动物细胞培养的目的只是为了获得大量

14、的细胞、动物细胞培养的目的只是为了获得大量的细胞 分泌蛋白分泌蛋白B B、动物细胞培养前要用胰蛋白酶使细胞分散、动物细胞培养前要用胰蛋白酶使细胞分散C C、细胞的癌变发生在原代培养向传代培养的过渡、细胞的癌变发生在原代培养向传代培养的过渡 过程中过程中D D、培养至、培养至5050代后传代细胞遗传物质没有发生改变代后传代细胞遗传物质没有发生改变B B4 4、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（）无毒的环境无毒的环境 无菌的环境无菌的环境 培养基需要加入血培养基需要加入血清清 温度与动物体温相似温度与动物体温相似 需要需要O O2 2，不需要

15、，不需要COCO2 2 COCO2 2能调节培养液能调节培养液PHPHA A、B B、C C、D D、D D5 5、动物细胞培养的特点、动物细胞培养的特点 （）细胞贴壁细胞贴壁 有丝分裂有丝分裂 细胞分化细胞分化 接触抑制接触抑制 减数分裂减数分裂 原代培养一般传原代培养一般传1 11010代代A A、B B、C C、D D、A A6 6、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：此回答：（1 1）容器）容器A A中放置的是动物器官或组织。它一中放置的是动物器官或组织。它一般取自般取自_。（2 2）容器）容器A A中的动物器官或组织首先要进行的中

16、的动物器官或组织首先要进行的处理是处理是 ，然后用，然后用 酶处理，酶处理，这是为了使细胞分散开来，这样做的目的是这是为了使细胞分散开来，这样做的目的是 。动物胚胎或幼龄动物动物胚胎或幼龄动物剪碎剪碎胰蛋白胰蛋白使细胞与培养液充分接触，便于培养使细胞与培养液充分接触，便于培养（3 3）培养首先在）培养首先在B B瓶中进行，瓶中的培养基成瓶中进行，瓶中的培养基成分有分有 _等。在此瓶中培养等。在此瓶中培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，这是培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，这是培养到第到第 代代。（4 4）为了把）为了把B B瓶中的细胞分装到瓶中的细胞分装到C C瓶中，用瓶中，用 处理，然后配

17、置成处理，然后配置成 ，再，再分装。分装。动物血清动物血清10胰蛋白酶胰蛋白酶细胞悬浮液细胞悬浮液 概念概念：将动物的一个细胞的细胞核，移入一：将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。发育成动物个体。用用核移植核移植的方法得到的动物的方法得到的动物称为称为克隆动物克隆动物核移植核移植（难度高）（难度高）受体细胞减数第二次分受体细胞减数第二次分裂中期的卵母细胞裂中期的卵母细胞二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆

18、动物胚胎细胞核移植：胚胎细胞核移植：体细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，细胞分化程度低，恢复全能性容易恢复全能性容易卵细胞卵细胞C母绵羊子宫母绵羊子宫母绵羊母绵羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植细胞核移植胚胎移植胚胎移植早期胚胎早期胚胎多利羊多利羊分娩分娩卵裂卵裂融合后的卵细胞融合后的卵细胞细胞拆合技术细胞拆合技术妊娠妊娠多多莉莉羊羊的的培培育育过过程程克克隆隆羊羊培培育育过过程程黑面绵羊去黑面绵羊去核卵细胞核卵细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核细胞核移植细胞核移植重组细胞重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期胚胎早期胚胎胚胎移植胚胎移植另另一头绵羊的子宫

19、一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利、动物的克隆与植物克隆一样吗？、动物的克隆与植物克隆一样吗？、用动物体细胞进行克隆的过程、用动物体细胞进行克隆的过程,其实其实际操作过程是什么？际操作过程是什么？动物克隆过程的实际是动物克隆过程的实际是细胞核移植细胞核移植不一样不一样思考题思考题1.体细胞核移植的过程体细胞核移植的过程（以高产奶牛为例）（以高产奶牛为例）体细胞体细胞培养培养甲牛甲牛乙牛乙牛M卵卵母细胞母细胞去除核去除核去核卵去核卵母细胞母细胞重组重组细胞细胞卵裂卵裂重组重组胚胎胚胎代孕母牛丙代孕母牛丙移植移植体细胞群体细胞群克隆牛克隆牛细胞核移植细胞核移植胚胎移植胚胎移植物

20、理或化学方法激活物理或化学方法激活体细胞体细胞 注入注入细胞融合细胞融合供体细胞（供核）供体细胞（供核）细胞培养细胞培养体细胞体细胞卵巢卵母细胞（卵巢卵母细胞（M中期：供质）中期：供质）去核去核无核卵母细胞无核卵母细胞注入注入细胞细胞融合融合重组重组细胞细胞重组胚胎重组胚胎胚胎移植胚胎移植代孕母体代孕母体生出与供体奶牛遗传生出与供体奶牛遗传基础相同的犊牛基础相同的犊牛归纳归纳:1.共分成两大阶段：共分成两大阶段：核移植核移植和和胚胎移植胚胎移植2.取卵细胞作受体细胞的取卵细胞作受体细胞的原因原因是是:它是最大的细胞它是最大的细胞,易操作易操作3.严格来说新个体有卵巢母细胞的细胞质所以有严格来说

21、新个体有卵巢母细胞的细胞质所以有两个亲本的性状两个亲本的性状细胞细胞培养培养、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。价值的动物提供的细胞。、用于核移植的供体细胞一般都选用传代、用于核移植的供体细胞一般都选用传代1010代以内的细胞，为什么？代以内的细胞，为什么？1010代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变未发生突变思考题思考题3 3、体细

22、胞核移植方法生产的克隆动物是对体细、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？的复制吗？为什么？不是，克隆动物绝大部分不是，克隆动物绝大部分DNADNA来自供体细胞核，来自供体细胞核，但核外还有少部分但核外还有少部分DNADNA（如线粒体（如线粒体DNADNA）来自）来自受体卵母细胞受体卵母细胞思考题思考题4、对比对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出操作过程的不同点？出操作过程的不同点？多莉克隆过程的受体细胞是多莉克隆过程的受体细胞是去核去核卵卵细胞细胞，而高产，而高产奶牛的克隆过程的受体细胞是奶牛的克

23、隆过程的受体细胞是去核去核卵母卵母细胞细胞；多；多莉克隆过程是将供体莉克隆过程是将供体细胞核细胞核注入受体细胞，而高注入受体细胞，而高产奶牛的克隆过程是将供体产奶牛的克隆过程是将供体细胞细胞注入受体细胞。注入受体细胞。5 5、讨论分析上述哪一种措施更科学？并说明、讨论分析上述哪一种措施更科学？并说明理由？理由？卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、活性比卵细胞高，用它作受体更容易成功，活性比卵细胞高，用它作受体更容易成功，将将供体细胞供体细胞注入受体细胞，注入受体细胞，使克隆动物更像使克隆动物更像供体动物供体动物，操作也方便。操作也方便。思考题思考题胚胎移植技术胚胎移

24、植技术试管动物（婴儿）培养过程试管动物（婴儿）培养过程卵细胞卵细胞精子精子体外受精体外受精受精卵受精卵胚胎胚胎新个体新个体母体子宫内母体子宫内孕育、产出孕育、产出2.体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术的应用前景 1、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育2、保护濒危物种，增加存活数量、保护濒危物种，增加存活数量3、克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白、克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白4、可以作为异种移植的供体，可以用于组织、可以作为异种移植的供体，可以用于组织器官的移植器官的移植3.体细胞核移植技术存在的问题：体细胞核移植技术存在的问题：（1

25、）成功率仍然非常低。成功率仍然非常低。（2）绝大多数克隆动物还存在健康问题。许绝大多数克隆动物还存在健康问题。许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。调等。（3）对克隆动物食品的安全性问题存有争议。）对克隆动物食品的安全性问题存有争议。1 1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是的细胞是 -（）A A细胞系细胞系 B B细胞株细胞株 C C原代细胞原代细胞 D D传代细胞传代细胞2 2、动物细胞工程技术的基础是、动物细胞工

26、程技术的基础是 -（）A.A.动物细胞融合动物细胞融合 B.B.单克隆抗体单克隆抗体 C.C.胚胎移植胚胎移植 D.D.动物细胞培养动物细胞培养AD课堂反馈：3 3、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞是这样的组织细胞 （）A.A.容易产生各种变异容易产生各种变异 B B具有更强的全能性具有更强的全能性 C.C.取材十分方便取材十分方便 D D分裂增殖的能力强分裂增殖的能力强D4.4.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于-（）A.A.培养基不同；培养基不同；B.B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；C.C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；D.D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培 养成植株。养成植株。A5.下列关于细胞工程的叙述中，错误的是-（)A植物细胞融合必须先制备原生质体B试管婴儿技术包括人工授精和胚胎移植两方面 C经细胞核移植培育出的新个体只具有一个亲本的遗传物质D用于培养的植物器官或组织属于外植体C