无菌检查操作规程2023年.docx

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1、无菌检查操作规程1. 目的建立无菌检查标准操作规程，确保检查结果准确、牢靠。2. 使用范围本公司无菌产品的无菌检查3. 职责质量部 QC4. 依据2023 版中国药典通则 1101GB/T 19973.2-2023ISO11737-2:1998疗器械的灭菌 微生物学方法 第 2 局部：确认灭菌过程的无菌试验GB/T 14233.2-2023医用输液、输血、注射器具检验方法 第 2 局部：生物学试验方法5. 内容5.1. 无菌检查环境保障5.1.1. 无菌检査的全部操作均需在严格把握微生物污染的环境下进展，即无菌检査应在环境干净度10000 级下的局部干净度100 级的单向流空气区域内或隔离系统

2、中进展。5.1.2. 操作环境的无菌保障程度将直接影响无菌检查结果，为了保证无菌检查用干净室区环境的稳定性，确保检查结果的牢靠性，对干净室区的环境定期监测并实行合理的措施保证干净环境符合要求。5.1.3. 无菌检查全过程必需严格遵守无菌操作，防止微生物污染。5.1.4. 干净区的温度、湿度等参数必需符合相应干净级别的要求。5.1.5. 无菌检查操作还需要对检查环境进展监控，5.2. 培育基、稀释液、缓冲液5.2.1. 硫乙醇酸盐流体培育基，市售培育基干粉。除另有规定，接种后应置3035培育。5.2.2. 胰酪大豆胨液体培育基，市售培育基干粉。接种后应置 2035培育。5.2.3. 中和或灭活用

3、培育基，按上述硫乙醇酸盐流体培育基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法，在培育基灭菌或使用前参加适宜的中和剂、灭活剂或外表活性剂，其用量同方法适用性试验。5.2.4. 胰酪大豆胨琼脂培育基，市售培育基干粉。5.2.5. 沙氏葡萄糖液体培育基，市售培育基干粉。5.2.6. 沙式葡萄糖琼脂培育基，市售培育基干粉。5.2.7. PH7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液，市售培育基干粉。5.2.8. 0.9%无菌氯化钠溶液。5.2.9.培育基使用性检查无菌检査用的硫乙醇酸盐流体培育基和胰酪大豆胨液体培育基等应符培养基的无菌性检査及灵敏度检査的要求。本检查可在供试品的无菌检査或与供试品的无菌检査同时进展。5.2.9

4、.1.无菌性检查：每批培育基随机取 5 支瓶，按各培育基规定的温度下培育 14 天，应无菌生长。5.2.9.2. 灵敏度检查5.2.9.2.1. 菌种：培育基灵敏度检查所用的菌株传代数不得超过 5 代(从菌种存中心获得的干菌种第 0 代，并承受适宜的菌种保藏技术进展保存，以证试验菌株的生物学特性 。金黄色葡萄球菌CMCC(B)26 003铜绿假单胞菌CMCC(B)10 104枯草芽孢杆菌CMCC(B)63 501生孢梭菌CMCC(B)64 941白色念珠菌CMCC(F)98 001黑曲霉CMCC(F)98 0035.2.9.2.2. 菌液制备：接种金色葡萄球菌、铜绿假胞菌、枯草芽孢杆菌的培育物

5、至胰酪大豆胨液体培育基中或胰酪大豆胨琼脂培育基上，接种生孢梭菌的培育物至硫乙醇酸盐流体培育基中，3035培育 1824 小时；接种白色念珠菌的培育物至沙氏葡萄糖液体培育基中或沙氏葡萄糖琼脂培育基上，2025培育 2448 小时，上述培育后的颖培育物用PH7.0 无菌化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌化钠溶液制成每 lml 菌数小于 100cfu(菌落形成的菌悬液。接种黑曲霉的培育物至沙氏葡萄糖琼脂面培育基上，2025培育 57 天，加人 35 ml 0.05%(ml/ml) 聚山梨酯 80 的 pH7.0 无菌化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，承受适宜的方法吸出孢

6、子悬液至无菌试管内，用0.05% (ml/ml)聚山梨醋 80 的 pH7.0 无菌化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 lml 孢子数量小于 100cfu 的孢子悬液。菌悬液假设在室温下放置，应在 2 小时内使用；假设保存在 28 在 24h 内使用。黑曲霉孢子悬液存在 28，在验证过的贮存期内用。5.2.9.2.3. 培育基接种：取每管装量为 12ml 的硫乙醇酸盐流体培育基 7 支，分别接种小于 100cfu 的色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各 2 支，另1 支不接种作为空白比照，培育 3 天；取每管装量为 9ml 的胰酪大豆胨液体培育基 7 支，分别接种小于 100c

7、fu 的草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各 2 支，另 1 支不接种作为空白比照，培育 5 天。逐日观看结。5.2.9.2.4. 结果判定：空白管应无菌生长，加菌的管生长良好，说明该培育基灵敏度符合规定。5.3. 方法试用性试验进展产品无菌检查时，应进展方法适用性试验，以确认所承受的方法适合于产品的无菌检查。假设检验程序或产品发生化可能影响检验结果时，应重进展方法适用性试验。方法适用性试验按“5.4 供试品的无菌检查”的规定及以下要求进展操作。对每一试验菌应逐一进展方法。5.3.1. 菌种及菌液的制备：大肠埃希菌CMCC(B)44 102外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑

8、曲霉的菌株及菌液制同“5.2.9.2 培育基灵敏度检查”。大肠埃希菌的菌液制同金黄色葡萄球菌。5.3.2. 薄膜过滤法：每种培育基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗， 在最终一次的冲洗液中参加小于 100cfu 试验菌，过滤。加硫乙醇酸盐流体培育基或胰酪大豆胨液体培育基至滤筒内。另取一装有同体积培育基的容器，参加等量试验菌，作为比照。置规定温度下培育，培育时间不得超过 5 天，各试验菌同法作。5.3.3. 直接接种法：取符直接接种法培育基用量要求的硫乙醇酸盐流体培育基6管，分别接入小于 100cfu 的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2 管，取符直接接种法培育基用量要求的胰酪大豆

9、胨液体培育基 6 管，分别接入小于 100cfu 的枯草芽孢杆菌 、白色念珠菌、黑曲霉各 2 管。其中1 管接入每支培育基规定的供试品接种量，另 1 管作比照，置规定的温度培育，培育时间不得超过 5 天。5.3.4. 结果推断：与比照管比较，如供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的检验量在检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以无视不计， 照此检査方法和检查条件进展供试品的无菌检查。如供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的检验量在检验条件下有抑菌作用，应承受增加冲洗量、增加培育基的用量、用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消退供试品的抑菌作用，并重进展方法适用

10、性试验。方法适用性试验与供试品的无菌检查同时进展。5.4. 供试品无菌检查无菌检査法括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性质允许，应承受薄膜过滤法。供试品无菌检查所承受的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法一样。无菌试验过程中，假设需用面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。5.4.1. 检验数量：除另有规定外，按表 1 规定。5.4.2. 检验量：即接种量，除另有规定外，按表 2 规定。5.4.3. 阳性比照：应依据供试品特性选择阳性比照菌：无抑菌作用及抗革兰氏阳性菌为主的供试品，以金色葡萄球菌为比照菌；抗革兰氏阴性菌为主的供试品，以大肠埃希菌为比照菌；抗

11、厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为比照菌； 抗真菌的供试品，以白色珠菌为比照菌。阳性比照试验的菌液制同“5.2.9.2 培育基灵敏度检查”，加菌量小于 100cfu，供试品用量同供试品无菌检查时每份培育基接种的样品量。阳性比照管培育 72 小时内应生长良好。5.4.4. 阴性比照：供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作， 作为阴性比照。阴性比照不得有菌生长。5.4.5.供试品的处理及接种培育基操作时，用适宜的消毒液对供试品容器面进展彻消毒，如供试品容器内有肯定的真空度，可用适宜的无菌器材(如带有除菌过滤的针头向容器内导入无菌空气，再按无菌操作启开容器取出内物。5.4.5.1. 薄膜过

12、滤法：薄膜过滤法一般应承受封闭式薄膜过滤。无菌检査用的滤膜孔径应不大于 0.45um，直径约 50mm。依据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。5.4.5.1.1. 水溶性供试品：水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤，以润湿滤膜。取规定量，直接过滤，或混至含不少于 100ml 适宜的稀释液的无菌容器中，混匀，马上过滤。如供试品有抑菌作用，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗数一般不少于 3 次每滤膜每次冲洗量一般为 100ml， 且冲洗量不得超过 1000ml，以避开滤膜上的微生物受损伤，所用的冲洗量、冲洗方法同方法适用性试验中确定的。除生物制品外，一般样品冲洗后，

13、1 份滤器中加人 100ml 硫乙醇酸盐流体培育基，1 份滤器中参加 100ml 胰酪大豆胨液体培育基。5.4.5.1.2. 非水溶性供试品：取规定量，直接过滤；或混合溶于适量含聚山梨酯80 或其他适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，马上过滤。用含0.1%1 %聚山梨酯 80 的冲洗液冲洗滤膜至少 3 次。参加含或不含聚山梨酯80 的培育基。接种培育基照水溶液供试品项下的方法作。5.4.5.1.3. 具有导管的医疗器具输血、输液袋等供试品：取规定量，每个最小装用 50100ml 冲洗液分别冲洗内壁，收集冲洗液于无菌容器中， 然后照水溶液供试品项下方法作。同时应承受直接接种法进展装中所配带的针头、针

14、管的无菌检査。5.4.5.2. 直接接种法：直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进展无菌检査的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培育基和胰酪大豆胨液体培育基中。除生物制品外，一般样品无菌检查时两种培育基接种的瓶或支数一样。除另有规定外，每个容器中培育基的用量不得大于接种到该容器中的供试品体积的 10 倍，同时，硫乙醇酸流体培育基每管装量不少于 15ml，胰大豆胨液体培育基每管装量不少于 10ml。供试品检査时，培育基的用量和髙度同方法适用性试验中确定的。5.4.5.2.1. 灭菌医用器具供试品：取规定量，必要时应将其拆散或切成小碎段， 等量接种于各管以浸没供试品的适量培育基中。5

15、.4.6. 培育及观看：将上述接种供试品后的培育基容器分别按各培育基规定的温度培育 14 天；培育期间应逐日观看并记录是有菌生长。如在参加供试品后或在培育过程中，培育基消灭浑浊，培育 14 天后，不能从外观上推断有无微生物生长，可取该培育液适量转种至同种颖培育基中，培育 3 天， 观看接种的同种颖培育基是否再消灭浑浊；或取培育液涂片，染色，镜检，推断是否有菌。5.4.7. 结果推断5.4.7.1. 阳性比照管应生长良好 ，阴性比照管无菌生长，供试品管都无菌生长， 则供试品符合规定。5.4.7.2. 阳性比照管应生长良好 ，阴性比照管无菌生长，供试品管中有任意一管有菌生长，则供试品不符合规定。5

16、.4.7.3. 阳性比照管应生长良好 ，阴性比照管无菌生长，供试品管浑浊，经确凿无菌生长，则供试品符合规定；经确证有菌生长，则供试品不符合规定。5.4.7.4. 有以下状况的，判试验无效。5.4.7.4.1. 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。5.4.7.4.2. 回忆无菌试验过程，觉察有可能引起微生物污染的因素，并且已经确证。5.4.7.4.3. 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所用的物品和或)无菌操作技术不当引起的。5.4.7.5. 试验假设经确认无效，则应重试。重试时，重取同量供试品，依法检查， 假设无菌生长，判供试品符规定；假设有菌生

17、长，判供试品不符规定。6. 相关文件干净区尘埃粒子监测操作规程干净区沉降菌监测操作规程试验室干净区清洁、消毒操作规程干净区环境监测治理规程ZW 型集菌仪使用、维护操作规程SPX-150 型生化培育箱使用、维护操作规程MJK-150 型霉菌培育箱使用、维护操作规程SW-CJ 系列干净工作台使用、维护规程阳性菌种治理规程7. 记录无菌检查原始记录附表：表 1：批出厂产品的最少检验数量供试品批产量接种每种培育基的最少检验数量10010%或 4 件取较多者医疗器具100N50010 件5002%或 20 件取较少者注：表中最少检验数量不包括阳性比照用的供试品数量每支供试品接入每种培育供试品供试品装量基

18、的最少量外科用敷料棉花及纱布取 100mg 或 13cm缝合线、一次性医用材料整个材料注医疗器具带导管的一次医疗器具二分之一内外表积整个器具注切碎或拆散其他医疗器具开表 2：供试品的最少检验量注：假设医疗器械体积过大，培育基用量可再2023ml 以上，将其整个完全浸没。无菌检查原始记录薄膜过滤法产品名称产品批号来源型号规格灭菌批号检品数量检验编号： 产品数量 灭菌有效期检验日期年月日完成日期检验结果年月 日 检验依据无菌检查标准操作规程培育基：硫乙醇酸盐流体培育基配制批号：胰酪大豆胨液体培育基配制批号：稀释液、冲洗液：0.1%蛋白胨水溶液PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液0.9%无菌氯化钠溶液

19、其他配制批号：阳性比照菌菌液： 取比照菌颖培育物，接种至适量的 0.9%无菌氯化钠溶液中，取 1ml进展 10 倍系列稀释，取稀释液作为比照菌液。比照菌名称：代数：计数结果：cfu/ml仪器设备：ZW-808A 型集菌仪仪器编号：MJX-150 霉菌培育箱 2025仪器编号：SPX-150 生化培育箱 3035 仪器编号： 无菌集菌器：批号：生产厂家：净化工作台环境监测 温度： 湿度：%沉降菌标准培育温度：3035：1cfu/皿碟号12培育时间3结果推断培育 48h 菌落数培育天数1234567891011121314培育基样品硫乙醇酸盐流体培育基阳性3035阴性胰酪大豆胨样品液体培育基202

20、5阴性注：逐日观看，集菌器中有菌生长则填“+”，无菌生长则填“-”结果判定：本品按无菌检查标准操作规程依法检查，结果检验人/日期：复核人/日期：无菌检查原始记录直接接种法检验编号：产品名称产品批号来源型号规格灭菌批号检品数量产品数量灭菌有效期检验日期年月日完成日期年月 日 检验依据无菌检查标准操作规程检验结果第一页培育基：硫乙醇酸盐流体培育基配制批号：胰酪大豆胨液体培育基配制批号：稀释液、冲洗液：0.1%蛋白胨水溶液PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液0.9%无菌氯化钠溶液 其他配制批号：阳性比照菌菌液：取比照菌颖培育物，接种至适量的 0.9%无菌氯化钠溶液中，取 1ml进展 10 倍系列稀释，取

21、稀释液作为比照菌液。比照菌名称：代数：计数结果：cfu/ml仪器设备：MJX-150 霉菌培育箱 2025 仪器编号：SPX-150 生化培育箱 3035仪器编号：净化工作台环境监测 温度： 湿度：%沉降菌标准培育温度：3035：1cfu/皿碟号12培育时间3结果推断培育 48h 菌落数培育天数培育基管号1231234567891011121314硫乙醇酸盐4流体培育基30355678注：逐日观看，有菌生长则填“+”，无菌生长则填“-”第 1 页 共 2 页无菌检查原始记录直接接种法检验编号：产品名称型号规格产品数量产品批号灭菌批号灭菌有效期来源检品数量检验日期年月日完成日期年月 日 检验依据无菌检查标准操作规程检验结果其次页培育天数管号91234567891011121314培育基硫乙醇酸盐流体培育基303510阳性阴性1234胰酪大豆胨液体培育基20255678910阴性注：逐日观看，有菌生长则填“+”，无菌生长则填“-”结果推断：本品按无菌检查标准操作规程依法检查，结果检验人/日期：复核人/日期：第 2 页 共 2 页