木质纤维素的酶降解工艺.docx

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1、木质纤维素的酶降解工艺姓名：黄国昌学院：生命科学院学号：4056046045151. 文献综述1.1 争辩的意义能源问题是关系国民经济进展的大事，目前大多数国家仍以石油为主。但从世界石油储量和消费量来看，今后全世界能开采的石油约2 万亿桶，估量可再用 50 年左右，石油的最终枯竭是在所难免的，开发其替代品是人们关心的问题。燃料乙醇属可再生资源，用它取代局部汽油，意义重大，有关人士称之为“一次能源的革命”。将乙醇与汽油按肯定的比例混配成的乙醇汽油，不仅能削减汽油消耗，而且能有效降低汽油尾气污染，推广和使用对于解决能源危机和环境污染具有重要的意义。乙醇不仅是助燃剂，而且是抗爆剂，添加到汽油中可提高

2、汽油的辛烷值，并能够降低环 境污染。美国加利福尼亚的科学家经争辩认为，为了提高汽油辛烷值而参加汽油中的MTBE(甲 基叔丁基醚)有致癌作用，虽有争议，但加利福尼亚州还是打算2023年起制止使用MTBE，美 国环保署现也同意逐步制止使用。乙醇可代替MTBE参加汽油，而且乙醇的燃烧在自然界形成 自身的循环，削减了能够形成臭氧的污染物的排放，没有任何污染，且缓解地球的温室效应。目前我国乙醇生产原料主要为国库备荒陈粮。我国人口众多，粮食并不富有.陈粮到底 有限，拓宽燃料乙醇生产原料，降低生产本钱是势在必行，必需尽快加快争辩。就世界范围 来说，尽管有报道称美国用于乙醇生产的玉米量至少可以扩大五倍而不会破

3、坏其市场。但人 口的增长，可耕地的削减，粮食作为原料终究不能长期。现在各国正致力于开发自然纤维素 生产燃料乙醇，这主要是基于废物利用的考虑。自然的木质纤维素资源是地球上最丰富和廉 价的可再生资源，主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素(木素)，纤维素可水解为葡萄糖， 能很简洁地用酵母发酵成乙醇，半纤维素可水解为戊糖和已糖，也可用来发酵生产乙醇。我 国是农业大国，植物纤维资源也格外丰富，仅农业秸杆、皮壳就达4亿多吨，林业生产所提 供的采伐和加工剩余物也有1000万吨之多，然而，在这浩大的数量中，人类仅能在建筑、造 纸、纺织、燃料、饲料等方面利用其中极少的一局部。随着世界人口的激增，粮食和能源的短缺

4、将日趋严峻，从自然纤维素生产燃料乙醇是一条解决能源危机的有效途径，因此，争辩 植物纤维素制燃料乙醇具有深远的现实意义。1.2 木纤维素的性质木质纤维素的构造较简单。细胞壁中的半纤维素和木质素通过共价键联结成网络构造, 纤维素镶嵌其中。纤维素是由葡萄糖通过-1 ,4 糖苷键联接而成的线性长链高分子聚合物。纤维素大约由500 到10 000个葡萄糖单元组成。纤维素分子中的羟基易于和分子内或相邻的纤维素分子上的含氧基团之间形成氢键,这些氢键使很多纤维素分子共同组成结晶构造, 并进而组成简单的微纤维、结晶区和无定形区等纤维素聚合物。X-射线衍射的试验结果显示, 纤维素大分子的聚拢,一局部排列比较整齐、

5、有规章,呈现清楚的X-射线衍射图,这局部称之 为结晶区；另一局部的分子链排列不整齐、较松弛, 但其取向大致与纤维主轴平行,这局部称之为无定形区。结晶构造使纤维素聚合物显示出刚性和高度水不溶性。因此高效利用纤维素的关键在于破坏纤维素的结晶构造,使纤维素构造松散,使得酶水解或化学水解更简洁进展。半纤维素在构造和组成上变化很大,一般由较短高度分枝的杂多糖链组成。组成半纤维素的构造单元主要有:木糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖,半乳糖等。各种糖所占比例随原料而变化,一般木糖占一半以上。半纤维素排列松散,无晶体构造,故比较简洁被稀酸水解成单糖。木质素是由苯基丙烷构造单元通过碳碳键连接而成的高分子化合物。木质

6、素不能水解为单糖,在纤维素四周形成保护层,影响纤维素水解。木质素中氧含量低,碳含量较高,其能量密度(27 MJ/kg) 较高,水解中留下的木质素残渣可作为燃料。1.3 木质纤维素的水解工艺木质纤维素原料具有较简单的构造特点,需要将其水解成单糖,才能被微生物发酵利用生产 乙醇。针对不同木质纤维素原料特性,需要承受不同的水解工艺,一般分为酸水解工艺和酶水解工艺。1.3.1 酸水解工艺酸水解又分为浓酸水解和稀酸水解法。1.3.1.1 浓酸水解工艺浓酸水解在19世纪即已提出,它的原理是秸秆纤维素在较低的温度下可完全溶解于72% 的硫酸、42%的盐酸和77%83%的磷酸中,导致纤维素的均相水解。浓硫酸水

7、解为最常用方法, 其主要优点是糖的回收率高,大约有90%的半纤维素和纤维素转化的糖被回收。William A Farone 等提出的浓酸水解工艺:生物质原料枯燥至含水10%左右, 并粉碎到约35 mm。把该原料和70%77%的硫酸混合,以破坏纤维素的晶体构造,最正确酸液和固体质量比为1.251 ,糖的水解收率到达90%左右。浓酸对水解反响器的腐蚀作用是一个重要问题。近年来在浓酸水解反响器中利用加衬耐酸的高分子材料或陶瓷材料解决了浓酸对设备的腐蚀问题。浓硫酸法糖化率高,约有80%90%纤维素能被糖化,糖液浓度高,但承受了大量硫酸,需要回 收重复利用。一种方法是利用阴离子交换膜透析回收,硫酸回收率

8、约80% ,浓度20%25% , 浓缩后重复使用。该方法操作稳定,适于大规模生产,但投资巨大,耗电量高,膜易被有机物污染。1.3.1.2 稀酸水解工艺主要工艺为: 木质纤维原料被粉碎到粒径2.5 cm 左右,然后用稀酸浸泡处理,将原料转入一级水解反响器,温度190 ,0.7 %硫酸水解3 min。可把约20%纤维素和80%半纤维素水解。水解糖化液经过闪蒸器后,用石灰中和处理,调pH 后得到第一级酸水解的糖化液。将剩余的固体残渣转入二级水解反响器中,220 ,1.6 %硫酸处理3 min。可将剩余纤维素中约70%转化葡萄糖,30%转化为羟基糠醛等。经过闪蒸器后,中和,得到其次级水解糖液。合并两局

9、部糖 化液,转入发酵罐,经发酵生产得到乙醇等产品。在稀酸水解中添加金属离子可以提高糖化收率。金属离子的作用主要是加快水解速度, 削减水解副产物的发生。近年来,Fe离子的助催化作用的争辩令人关注。Quang A Nguyen 等具体争辩了Fe离子的催化效果。华东理工大学等单位也对二价Fe 离子的催化效果进展了详细争辩。总的说来,稀酸水解工艺糖的产率较低,一般为50%左右,而且水解过程中会生成对发酵有害的副产品。1.3.2 酶水解工艺应用酶催化可以高效水解木质纤维素,生成单糖。酶水解工艺的优点在于:可在常温下反响,水解副产物少,糖化得率高,不产生有害发酵物质,可以和发酵过程耦合。但是由于木质纤维素

10、致密的简单构造及纤维素结晶的特点,需要适宜的预处理方法,使得纤维素分子成为松 散构造,便于纤维素酶分子与纤维素分子的结合,然后通过纤维素酶分子的催化作用,高效地水解产生单糖。因此木质纤维素酶水解工艺必定包含原料预处理的重要步骤。1.3.2.1 原料预处理利用化学和物理方法进展预处理,使纤维素与木质素、半纤维素等分别开,同时纤维素内部氢键翻开,成为无定型纤维素。此外,还进一步打断局部糖苷键,降低聚合度,半纤维素被水解成木糖、阿拉伯糖等单糖。经预处理后,有的纤维素的酶法降解速率甚至可以与淀粉水解相比。1) 物理法物理法主要是机械粉碎。可通过切、碾和磨等工艺使生物质原料的粒度变小,增加和酶接触的外表

11、积,更重要的是破坏纤维素的晶体构造。2) 物理化学法a) 蒸汽爆裂(自动水解)蒸汽爆裂是木质纤维素原料预处理较常用的方法。蒸汽爆裂法是用高压饱和蒸汽处理生物质原料,然后突然减压,使原料爆裂降解。主要工艺:用水蒸汽加热原料至160260 ( 0.694.83MPa) ,作用时间为几秒或几分钟,然后减压至大气压。由于高温引起半纤维素降解,木质素转化,使纤维素溶解性增加。蒸汽爆破法预处理后木质纤维素的酶法水解效率可达90%。蒸汽爆裂法的优点是能耗低,可以间歇也可以连续操作。主要适合硬木原料和农作物秸秆。但蒸汽爆裂操作涉及高压装备,投资本钱较高。连续蒸汽爆裂的处理量较间歇式蒸汽爆裂法有增加,但是装置更

12、简单,投资本钱大为增加。b) 氨纤维爆裂氨纤维爆裂(ammonia fiber explosion , AFEX) 法是将木质纤维素原料在高温存高压下用液氨处理,然后突然减压,造成纤维素晶体的爆裂。典型的AFEX工艺中,处理温度在90 95 ,维持时间2030 min ,每千克固体原料用12 kg 氨。氨纤维爆裂装备与蒸汽爆裂装备根本一样,另外需要氨的压缩回收装置,因此投资本钱也很高。c) CO 爆裂2CO 爆裂原理与水蒸汽爆裂原理相像,在处理过程中局部CO 以碳酸形式存在,增加木质22纤维素原料的水解率。主要工艺:用4 kg CO2处理每公斤木质纤维素原料,在5.62 MPa 压力处理后减压

13、爆裂处理,其效果比蒸汽爆裂法和氨纤维爆破法差,更缺乏经济竞争力。3) 化学法a) 稀酸预处理法前面已介绍稀酸水解产率低,但其破坏纤维素的结晶构造,使原料构造疏松,从而有利于酶水解。经过稀酸处理后可以显著提高纤维素的水解速率。b) 碱预处理碱处理法是利用木质素能够溶解于碱性溶液的特点,用稀氢氧化钠或氨溶液处理生物质原料,破坏其中木质素的构造,从而便于酶水解的进展。碱处理机理在于OH- 能够减弱纤维素和半纤维素之间的氢键及皂化半纤维素和木质素分子之间的酯键。稀NaOH 处理引起木质纤维原料润胀,结果导致内部外表积增加,聚合度降低,结晶度下降,木质素和碳水化合物之间 化学键断裂,木质素构造受到破坏。

14、碱处理木质纤维原料的效果主要取决于原料中的木质素含量。4) 其它预处理方法文献报道还有臭氧处理、有机溶剂处理、氧化处理等木质纤维预处理方法,但这些方法都因缺乏竞争力而很少被应用。1.3.2.2 酶催化水解木质纤维素原料经过适当预处理后,可以利用纤维素酶催化水解纤维素生成葡萄糖,其 优点是反响条件温存(50 ,pH 4.8) ,不发生副反响。细菌、真菌及动物都可以产生可以水解木质纤维素原料的纤维素酶。纤维素酶是一种很简单的酶,是由几种酶共同作用下降解纤维素的。酶降解纤维素至少需要三种酶协同作用: (1) 内切葡聚糖酶( EG, endo-1 ,4-D-葡聚糖水解酶,或EC3.2.1.4) , 攻

15、击纤维素纤维的低结晶区,产生游离的链末端基; (2) 外切葡聚糖酶,常称纤维二糖水解酶(CBH ,1 ,4-p-D-葡聚糖纤维二糖水解酶,或EC3.2.1.91) ,通过从游离的链末端脱除纤维二糖单元来进一步降解纤维素分子; (3) 葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21) ,水解纤维二糖产生葡萄糖。纤维二糖和葡萄糖对于纤维素酶的催化作用具有猛烈的反响抑制作用。要提高纤维素酶水解纤维素的效率,必需解除纤维素酶的反响抑制。因此将纤维素酶水解与发酵产乙醇进展耦合,使得中间产物纤维二糖和葡萄糖的浓度保持很低水平,从而可以 解除其反响抑制作用。1.4 纤维素酶的产生菌的纤维素酶产生菌主要有霉菌、担子菌等真

16、菌，也包括细菌、放线菌和一些原生动物。目前使用的纤维素酶主要来源于绿色木霉、里氏木霉、根霉、青霉、嗜纤细菌等 ，其中绿色木霉、白腐菌应用最为广泛。2. 试验局部2.1 菌种的活化和高产菌株的筛选菌种来自江西武藏野生物化工，先用刚果红培育基进展活化，接种后于 28 恒温培育箱中培育 4-6 天，再点种接刚果红平板，培育 5 天后，挑取水解圈较大的单菌落接种到 PDA 试管斜面，共 30 支，28恒温培育 56 天后，置于 4冰箱中保存。2.2 稻草的预处理稻草来自南昌市郊区四周农家，当年收割。为了脱除稻草纤维素的木质素和降低其结晶度，使纤维素酶能充分和纤维素接触，先将稻草剪成23CM 长的小段，

17、再承受以下预处理方法：2.2.1 汽爆法稻草段装入三角烧瓶中，参加 2 倍体积 2%的稀 H SO ,于高压灭菌锅中 126、0.15MPa24维持 10min 左右，快速减至常压，水洗后烘干粉碎，过80 目筛备用。2.2.2 碱预处理其机理是破坏木聚糖半纤维素和其他组分内局部子间比方木素和其他半纤维素之间 的酯键。稀碱预处理对木素含量高26%的针叶木没有效果，对稻草类木素含量 10% 18%有效。将稻草粉浸泡在 2%的 NaOH 溶液中过夜，用水洗至中性，枯燥后备用。2.2.3 汽爆加碱预处理将上述汽爆后的纤维素粉浸泡在 2%的 NaOH 溶液中过夜，用水洗至中性，枯燥后备用。2.3 单因素

18、试验2.3.1 根底培育基：稻草 10g/L，麸皮 5g/L,蛋白胨 3.0 g/L , 硫酸铵 2.0 g/L , 酵母膏 0.5 g/L ,KH PO 4.024g/L , CaCl 2H O 0.3 g/L , M gSO 7H O 0.3 g/L , Tween-80 0.2ml/L。22422.3.2 不同预处理方法的影响在三角瓶中分别参加不同预处理的稻草粉，每组三个比照，121 灭菌20 min ，接种量5%，上摇床，转速150r/min，30培育96h.2.3.3 不同氮源的影响依据蛋白胨：硫酸铵分别为2:2，2:3，3:2(g/L)的比例配制培育基，121 灭菌20 min ，

19、 接种量5%，转速150r/min，30培育96h.2.3.4 起始pH的影响依据根本培育基的配方：配制摇瓶液体发酵培育基6瓶，其中3瓶自然pH，另外3瓶调pH 至5.0，接种量5%，转速150r/min，30培育96h.2.3.5 离子浓度的影响2.3.5.1 Mg2的影响调整培育基中Mg2浓度分别为0.03%、0.02%，其他条件不变，摇瓶培育。2.3.5.2 PO43-的影响调整培育基中PO43-浓度分别为4.0g/L、3.0g/L, 其他条件不变，摇瓶培育。2.3.6 外表活性剂的影响比较参加吐温80和不加吐温80对纤维素降解的影响。2.3.7 碳源配比的影响调整碳源比分别为稻草粉15

20、g、稻草粉:麸皮10:5g/L、稻草粉:麸皮:葡萄糖10:4:2g/L， 其他条件依据上述结果而定，接种量5%，转速150r/min，30培育96h.2.3.8 温度的影响依据以上试验结果，依据最正确培育基组合，分别在28、30以及3028的温度下， 接种量5%，转速150r/min，培育96h.2.4 正交试验依据单因素试验的结果，确定正交试验因素水平，设计正交试验，依据试验结果，进展极差分析，确立最正确培育基组合及发酵条件。2.5 总糖含量及复原糖含量的测定2.5.1 DNS试剂的配制称取酒石酸钾钠91 g于500ml蒸馏水中，依次加人3，5-二硝基水杨酸3.5 g，NaOH 20 g，

21、加热搅拌，使之溶解，再加人重蒸酚2.5g，无水亚硫酸钠2.5 g，搅拌使之溶解，1000ml定容，贮于棕色瓶中，l周后使用。2.5.2 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制称取28.40克磷酸氢二钠定容至1L，为0.2 mol/L；称取21.01克一水柠檬酸定容至1L， 为0.1 mol/L。依据磷酸氢二钠:柠檬酸10.3:9.7的体积比，配成pH为5.0的缓冲液。2.5.3 葡萄糖标准曲线的制作准确称取经 105、3h 烘干至恒重的无水葡萄糖AR1.0 克，配成10mg/mL 浓度的标准葡萄糖液。分别吸取 10mg/mL 标准葡萄糖液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL 于 50m

22、L 容量瓶中，用蒸馏水制成每毫升分别含有葡萄糖200、400、600、800、1000、1200 g 的标准液。各取不同浓度标准液 0.5mL 于试管中，加磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 1.5mL，DNS 试剂3 mL 于沸水浴中沸腾 7min，取出后马上参加蒸馏水10mL 混匀，冷却后，用紫外分光光度计550nm 处比色，以所得的光密度 OD 值为纵坐标，以对应的葡萄糖量为横坐标，绘制标准曲线。空白的制作：以 0.5mL 蒸馏水代替 0.5mL 标准葡萄糖液，以下操作步骤同标准曲线制作。2.5.4 复原糖含量的测定发酵液离心3000r/min5分钟后，取上清液，沉淀物用蒸馏水反复洗涤屡次，洗涤液

23、参加上清液中，取混合液0.5ml于试管中，加磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.5mL，DNS试剂3 mL 于沸水浴中沸腾7min，取出后马上参加蒸馏水10mL混匀，冷却后，用紫外分光光度计在550nm 处比色，所得光密度OD值与葡萄糖标准曲线比照，计算复原糖的含量。2.5.5 总糖含量的测定2.5.5.1 标准葡萄糖溶液的配制：准确称取105枯燥至恒重的葡萄糖比照品100mg,加适量水溶解,转移至100ml容量瓶中, 加水至刻度,摇匀,配成浓度为1mg/ml标准葡萄糖溶液备用。2.5.5.2 50ml/L苯酚溶液的配制:取苯酚100,加铝片0.1和NaHCO3 0.05,常压蒸馏,收集182馏分10

24、,加蒸馏水200ml溶解,置棕色瓶内放冰箱备用。2.5.5.3 标准曲线的制作:取6支大试管,用移液枪分别吸取10,20,40,60,80,100 l的标准葡萄糖液(1mg/ml),各加蒸馏水至2.0ml,然后各参加苯酚试液1ml,快速滴加浓H2SO45ml,待试管冷却后,沸水浴中加热15min,取出放入冷水中冷却至室温,于490nm波长下测定吸光度。2.5.5.4 样品总糖含量测定：方法同标准曲线的制作方法。2.5.6 发酵产物中单糖组成成分的分析2.5.6.1 标准糖样的HPLC分析标准糖样的制备：分别配制葡萄糖、纤维二糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖溶液，浓度均为1mg/ml，各取5ml瓶装。

25、HPLC分析：色谱仪承受RI检测器，外标法测定。2.5.6.2 产糖的HPLC分析分析柱为Carbohydrate analysis,流淌相为乙腈水8515，流速1.0 ml/min，示差检测。2.6 验证扩大试验2.6.1 培育基50L发酵培育基：Avicel 3% ,稻草2%，麸皮1% ,蛋白胨0.3% , 硫铵0.2% , 酵母膏0.05% ,KH PO 0.3% , CaCl 2H O 0.03% , MgSO 7H2O 0.03% , Tween-80 0.02% , 消泡剂适量。242242.6.2 50L扩大培育将培育了 48 小时的液体种子，按 10%接种量接种至 28L 液体

26、培育基中，通风量 10.2 1vvm , 转速 250-400r/min, 通过流加 2N NH OH 自动把握发酵液pH 为 4.0; 通过把握风4量和转速, 保持溶氧饱和度在 20%。2.7 发酵产物的提取分别2.7.1 过滤处理发酵终止后，将发酵液通过过滤处理，除去菌体及剩余的培育基等固形物。2.7.2 除蛋白将滤液用草酸调pH=7，参加3%的TCA，使蛋白质沉淀，上清液由黄绿色变为浅黄色，此时pH=4，放置过夜，使蛋白充分沉淀;离心沉淀蛋白，取上清液减压浓缩至肯定体积。3. 主要参考文献1 邱雁临,孙宪迅,曾莹.发酵秸秆生产纤维素酶工艺条件的争辩J.粮油食品科技,2023,12(2):

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