纳米材料在生物检测中的应用.pdf

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1、纳米材料在生物检测中的应用 谭婷婷;王光寅;潘祖亭;罗运柏【摘 要】纳米颗粒是生物医学中研究最多、应用最广的纳米材料,有许多独特的性质.综述了近年来国际上以纳米颗粒为基础的纳米技术在生物传感器及生物检测中的研究成果和进展,介绍了纳米颗粒的制备方法及其在纳米生物传感器和纳米生物芯片中的应用,结合纳米病原微生物检测介绍了有关免疫传感器检测细菌的研究成果,并对该领域的应用前景进行了展望.【期刊名称】化学与生物工程【年(卷),期】2009(026)003【总页数】4 页(P58-61)【关键词】纳米技术;纳米生物学技术;纳米颗粒;纳米生物传感器;生物检测【作 者】谭婷婷;王光寅;潘祖亭;罗运柏【作者单

2、位】武汉大学化学与分子科学学院,湖北,武汉,430072;武汉大学化学与分子科学学院,湖北,武汉,430072;武汉大学化学与分子科学学院,湖北,武汉,430072;武汉大学化学与分子科学学院,湖北,武汉,430072【正文语种】中 文【中图分类】O614;TB383 纳米生物技术是纳米技术与生物技术交叉渗透形成的新技术，是纳米技术的重要组成部分，也是生物医学领域的一个重要发展方向。纳米颗粒通常大于 1 nm，是生物医学领域应用最广的纳米材料，也是目前研究得最多的纳米材料之一。纳米颗粒是介于微观与宏观之间的一类新的物质层次，具备许多独特的性质1，如小尺寸效应、量子尺寸效应、表面效应、宏观量子隧

3、道效应、体积效应等。实现对纳米颗粒的尺寸大小、粒度分布、形状、表面修饰的控制，以及它们在光电化学中的应用，是纳米颗粒研究的关键。1 纳米颗粒的制备和修饰 除了纳米颗粒的特性，其组成成分对于它们的适用性也是非常重要的，如纳米颗粒的组成成分不仅决定了纳米探针与被分析物的兼容性和匹配性，也决定了检测精度。最常见用来制备纳米颗粒的原材料是金、硅和半导体(如 CdSe、ZnS、CdS)等。金对于纳米生物技术来讲是一种活性材料，因为金纳米颗粒能与巯基发生强的共价键合2，使得胶态金与巯基标记的生物活性分子结合形成探针可用于生物体系的检测。Frens3用柠檬酸三钠还原 HAuC14 得到纳米级胶体金颗粒。研究

4、者进一步优化此方法合成了直径在 13 nm 左右的纳米金。纳米金较容易被改良，因为它具有微弱的带电配体的结合层，能保持稳定；改良纳米金的方法现在已经很优化，适合于大范围的粒径及多种表面组分。借用纳米金表面易被修饰的特性，Mirkin提出了一种合成金壳银核的核-壳型纳米颗粒的方法，以薄金壳包裹在银纳米粒子表面，形成一种金外包被的颗粒，它易与烷基修饰的寡核苷酸共价结合，从而形成新型的银/金核-壳探针。该纳米颗粒既保持着银的化学和物理特性，又具有金的稳定性；这种新型纳米探针与纯金体系的探针有完全不同的色度改变，二者可用来检测同一样本中两种不同的目标 DNA。硅是一种在生物分析中被广泛采用的材料，如生

5、物传感器、生物芯片等。硅可以通过多种加工技术制备纳米颗粒、透明薄膜以及固体平面材料。硅纳米颗粒的制备有两种经典的途径，一种是倒转微乳化法，主要是用来合成染料掺杂硅颗粒和超小磁性硅颗粒；另一种是 St/3ber 方法，用于制备纯硅颗粒和有机染料掺杂硅颗粒。所合成硅颗粒的特征可通过尺度、光学或者磁学特性来描述，其粒径可用透射电镜或扫描电镜来确定(一般直径在 60100 nm 之间)。染料掺杂硅颗粒中的染料分子可以是双吡啶钌(RuBpy-)、若丹明、四甲基右旋糖苷以及荧光素右旋糖苷等，这种硅颗粒的大小和光学特性是决定其用途的最主要因素。磁性硅颗粒包括Fe3O4/SiO2 和 Fe2O3/SiO2 两

6、种，其直径大约在 23 nm；采用超导量子干扰装置(Superconducting quantum interference device，SQUID)分析其粉末形式，发现磁性硅颗粒的特性接近超顺磁性物质，可见磁性硅颗粒的大小和磁学特性将决定其最佳合成条件。量子点(Quantum dots，QNs)是一种半导体晶体材料的纳米颗粒，直径在 10 nm以内，较普通细胞的体积小数千倍，具有吸收波长范围宽和发射波长范围窄的特性，不同材料的量子点还会发出不同的荧光。用作量子点的材料有硒化镉(CdSe)、硫化锌(ZnS)、砷化铟(InAs)等，近年的研究中硒化镉最受重视。量子点的合成途径有多种，从传统荧光

7、标记的量子点到用作测量各向异性的拉长“纳米杆”，较经典的是“由下向上”的一步法反应，即同一容器中，无机物的化学转化与纳米结晶过程。最初使用的量子点小于 10 nm，比金属及磁性纳米颗粒的表面积更小，其发光效率也低，还容易发生光化学降解和聚集。CdSe/ZnS 是化学合成的无机物，为了增强其胶体稳定性、水溶性和减少非特异性吸附及细胞内聚集，并减少被网状内皮系统的吞噬，常对其进行亲水性处理：一种是用表面活性剂，如二氢硫辛酸、巯基乙酸等处理其表面，或用聚乙二醇 PEG 修饰包被的聚合物；另一种是在其表面包被蛋白质，如卵白素、生物素、链亲和素等，这样使其表面获得巯基、羧基等活性基团，以结合蛋白质、抗体

8、、肽或核酸46。另外，由于 CdSe 与 ZnS 以静电结合，表面带负电荷，可结合带中性电荷或阳性电荷的蛋白质及抗体(如 IgG等)7，8。2 纳米生物传感器 纳米材料本身就是非常敏感的化学和生物传感器，固定有能选择性结合靶分子的生物探针的纳米传感器称为纳米生物传感器。纳米生物传感器能和生物芯片等结合，从而使分子检测更加高效、简便，在微生物检测、体液代谢物监测以及组织病变(如肿瘤的早期发现)等方面应用较多。2.1 纳米线生物传感器 由于纳米颗粒表面易于改良，纳米线实际上可以被任何可能的化学或生物识别分子所修饰。纳米材料以一种极度敏感、实时和定量的方式将发生在其表面的化学键合事件转换成纳米线的电

9、导率。掺硼的硅纳米线已经被用来制作高度敏感、实时监测的传感器，用于检测 pH 值以及 pmolL-1 浓度的抗生物素蛋白、Ca2+等生化物质9，今后还可以发展应用于阵列扫描和在体诊断。研究能快速、直接地分析小分子物质和蛋白质大分子特异性结合的微型仪器，对于发现和筛选新药分子有实质性的意义。Wang 等10报道了一种硅纳米线场效应晶体管(FET)装置，在酪氨酸蛋白激酶(Abl)的介导下，它能高度敏感、免标记地直接检测到 ATP 以及 ATP 的小分子阻断剂(Gleevec)，因此能成为药物开发的技术平台。2.2 病毒纳米生物传感器 病毒颗粒实际上就是生物纳米颗粒。单纯疱疹病毒(HSV)和腺病毒可

10、以触发磁性纳米珠的集合，从而成为临床上检测相关病毒的纳米传感器。纳米珠由超磁性氧化铁内核包被右旋糖苷组成，再附着作为抗病毒抗体的 G 蛋白。在 Weissleder 小组的实验中，经磁场作用，一个 10 mL 的血清样本中能检测到少至 5 个的病毒颗粒。该系统要比酶联免疫吸附实验(ELISA)敏感，同时也比基于 PCR 扩增的检测方法有所改进11。但是利用纳米线场效应晶体管，Hayden 能直接、实时地从样本中检测到单个流行性感冒病毒 A 颗粒；而且用两种抗体修饰的纳米线装置能平行检测出相应的流行性感冒病毒和腺病毒，这提示如果这种装置具有大规模区分能力的话，就有可能在单个病毒水平上同时检测到多

11、种不同的病毒侵袭。2.3 光学纳米生物传感器 表面等离子体共振(SPR)是一种光和金属电子相互作用的光-电子现象，是将光子所携带的能量转移给金属表面的电子。虽然迫切需要能特异鉴别周围环境中低浓度生物物质的微型化光学传感器，但目前还不存在未经扩增就能鉴定出自然浓度的这种仪器。借助局部 SPR 光谱技术，可利用三面体银纳米颗粒制成一种新型的光学传感器，因为这种银颗粒具有显著的光学特性，能大大提高检测的敏感性。SPR 纳米生物传感器为利用简单、轻便、经济的仪器来实现超敏感的生物检测提供了一条有效途径。结合纳米技术、生物学和光子学，Vo-Dinh 等提出了一种激光纳米传感器，用来对单个活细胞中的蛋白或

12、生物标记进行胞内分析。这种纳米传感器的光纤被拉长至尖端达到纳米级范围，并被生物探针(如抗体或酶底物)修饰；将尖端插入细胞，激光导入光纤后，尖端的消散区激发目标分子与探针结合，光度检测系统采集结合区域的光信号(如荧光)后用于分析。Vo-Dinh 等相继报道了利用这种光学纳米传感器，在单个活 MCF-7 细胞(人乳腺癌细胞株细胞)中检测 Caspase-9 蛋白和细胞色素 C 蛋白活性的实验。2.4 纳米肿瘤生物传感器 肿瘤生物传感器由量子点与能够识别肿瘤细胞标志物的特异性靶向分子(如特异性配体、单克隆抗体、核酸探针等)组装而成，通过靶向分子与肿瘤细胞表面标志物分子的结合，利用物理方法来测量传感器

13、中的磁信号、光信号等，可实现肿瘤的定位和显象，有利于肿瘤的早期诊断。3 纳米技术在生物检测中的典型应用 3.1 纳米生物芯片 生物芯片是在很小几何尺度的表面积上，装配一种或集成多种生物活性分子，仅用微量生理或生物采样，即可以同时检测和研究不同生物细胞、生物分子和 DNA 的特性，以及它们之间的相互作用，获得生命微观活动的规律。传统的生物芯片有不少局限性，如不能很好地固定 DNA、样品的需要量大、荧光标记不可直接读出和敏感度低等。将纳米技术应用于生物芯片，能极大地改善这些局限性，如可采用自组装的方法来固定、样本需要量少但敏感度大大提高、结合微电子技术后高产而成本低等。在过去的 10 年中，DNA

14、 序列的检测在遗传学、病理学、刑事学、食品安全等方面越来越普遍和重要，因此向研究者提出更高的要求，需在同一样本中同时进行千百万不同 DNA 序列的检测，于是 DNA 微阵列，也称基因芯片应运而生。但是，目前的 DNA 微阵列还面临不少困难：如阵列的制作和读出都必须微型化，以满足“芯片上的实验室”的需要；阵列需有高选择性和高灵敏度。基于荧光标记的检测体系近年来在 DNA 芯片中的重要作用已经获得认同，并且在基因差异表达、基因突变、基因多态性研究和基因诊断等领域得到了应用，但其寡核苷酸阵列的制作以及后续的杂交检测都有较高的仪器设备要求，荧光标记物也比较昂贵，这是一般实验室条件无法达到的。因此，建立

15、和发展高效、快速、低成本的 DNA 序列测定新方法显得尤为重要。纳米颗粒的 DNA 阵列技术改善了荧光标记阵列的局限性，是一种可望广泛应用的新的 DNA 检测方法。在任何异源 DNA 微阵列的检测中，目标 DNA 链均需要被标记，以便信号的观察。除了纳米金用于 DNA 检测和 DNA 微阵列外，RuBpy-硅颗粒也能用于痕量 DNA检测，该实验基于“三文治”机制，能检测 pmolL-1 浓度以下的靶序列。量子点本身就是荧光标记物，与生物大分子共价结合后，也能实现超敏感的生物检测。然而，配位键的性质显著影响了量子点的光物理特性，限制了它在这方面的应用。微小 RNA(miRNAs)是一种高度进化保

16、守的小的未编码 RNAs，在动植物细胞内发挥着重要的调节作用，它能剪切 mRNAs 或是抑制其转录。miRNAs 的错误调节会导致多种人类疾病，探明 miRNAs 的表达情况对于研究 miRNAs 的生物功能十分重要。大多数研究小组采用的是 Northern 杂交和 miRNA 克隆的方法来分析。Ruan 报道了一种新型的 miRNA 微阵列，实验中目标 miRNA 的 3-末端先被生物素标记，然后与固定在玻片上的互补寡核苷酸-DNA 进行杂交，再加入抗生物素修饰的量子点，最后检测结合在 miRNA 上的量子点的荧光强度；也可以加入纳米金探针，经银沉淀加强后检测。相比 Northern 杂交等

17、方法，该途径提高了检测效率，同时灵敏度也大幅改善。3.2 纳米病原微生物检测 快速、灵敏地检测出致病菌对于食品安全、临床诊断和治疗以及反生物恐怖等十分重要。铁磁纳米粒和陶瓷纳米球已经应用于这些方面，但未能令人满意。Tan 等提出了一项新的生物纳米技术，该技术采用生物修饰的纳米颗粒，通过以荧光信号为基础的免疫实验，能快速、准确地检测出单个细菌。他们选择大肠杆菌 O157：H7 作为检测细菌，因为它是食物来源肠道感染致病菌的主要代表。检测微量细菌的传统方法需要扩增或是富及样本中的目标菌，过程繁琐而费时费力。该研究中，纳米颗粒起到极强的信号放大作用，细菌众多的表面抗原可供抗体修饰的纳米颗粒识别与结合

18、，所以每一个细菌表面将结合数以千计的纳米颗粒，从而提供极强的荧光信号。该方法甚至能发展到 384 孔微平板的多菌样本高通量检测。单个细菌结合极多纳米颗粒，利于信号放大化，用针对不同细菌的特异性抗体来修饰纳米颗粒，就能检测多种来源的细菌病原体，包括生物恐怖试剂以及食品、临床和环境样本。根据电化学阻抗谱良好的界面表征特性，作者采用硅烷化单分子层的固定化技术，将抗体固定在三氧化二锡铟(IT0)电极表面来捕获大肠杆菌 O157：H7；配制不同细菌浓度的溶液与免疫电极发生结合，通过 Nyquist 图反映的电荷转移电阻来初步确定电化学阻抗谱传感器的检测性能，包括检测限 4103cfumL-1，检测线性区

19、间 41034106cfumL-1，初步完成了对大肠杆菌 O157：H7 的定量分析。结果表明，该传感器检测时间短，操作简单，在一定范围的离子强度和酸度环境下具有较高的稳定性，能够实时检测。但是，研究还存在一些问题：(1)在免疫电极的处理过程中，由于手工操作等人为因素使得电极的一致性难以保证，对此可考虑采用微加工技术和集成制造技术来改进；(2)传感器的灵敏度还需要进一步提高。由于纳米生物技术在病原菌检测中能发挥其良好的优势，所以作者拟将该技术应用于交流阻抗谱免疫传感器，预计能进一步提高检测的灵敏度。4 结语 纳米生物技术是国际生物技术领域的前沿和热点问题，在生物传感器及生物检测领域中有着广泛的

20、应用和明确的产业化前景，特别是纳米生物传感器、微型智能化医疗器械以及纳米药物载体等，将在疾病的诊断、治疗和卫生保健方面发挥重要作用。未来的研究方向将着重于纳米磁性材料及其生物医学应用、纳米材料的生物安全性、生物医学诊断与治疗、纳米器件(包括细胞分离)、生物芯片技术等方面。此外，纳米生物技术的发展需要不同学术背景的研究者密切合作，通过概念、知识和技术上的相互交流来达到不断创新、共同进步，比如，将单细胞和单分子力学与微机电加工、微全分析和纳微流控技术结合起来是纳米技术发展的一个重点，并将使分子生物学发展到一个崭新的水平。参考文献：1 张阳德.纳米生物技术学M.北京：科学出版社，2005：61-65

21、.2 胡瑞省，刘善堂，朱涛，等.金纳米粒子通过形成 Au-S 键的组装 J.物理化学学报，1999，15(11)：961-964.3 Frens G.Controlled nucleation for the regulation of particle size monodisperse suspension J.Nat Phys Sci，1973,241(105)：20-22.4 Wu X Y,Liu H J,Liu J Q,et al.Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets w

22、ith semiconductor quantum dots J.Nat Biotechno，2003,21(1)：41-46.5 Mao C,Flynn C E,Hayhurst A,et al.Viral assembly of oriented quantum dot nanowires J.Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(12):6946-6951.6 Nisman R,Dellaire G,Ren Y,et al.Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence,con

23、ventional,and energy-filtered transmission electron microscopy J.Journal of Histochemistry and Cytochemistry,2004,52(1):13-18.7 Jaiswal J K,Mattoussi H,Mauro J M,et al.Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugatesJ.Nature Biotechnol，2003,21(1):47-51.8 Lidke D S,Nagy

24、P,Heintzmann R,et al.Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction J.Nat Biotechnol,2004,22(2):198-203.9 Cui Yi,Wei Qingqiao,Hongkun Park,et al.Nanowire Nanosensors for highly sensitive and selective detection of biological and chemical speciesJ.Science,2001,293(5533):1289-1292.10 Wang Wu,Chen C,Lin K H,et al.Label-free detection of small-molecule-protein interactions by using nanowire nanosensors J.Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(9)：3208-3212.11 张灯，陈松月，秦利锋，等.检测大肠杆菌 O157:H7 的电化学阻抗谱生物传感器的研究 J.传感器技术学报，2005,18(1)：5-9.