化妆品防腐挑战性测试方法(T-GDCDC 010—2019).pdf

《化妆品防腐挑战性测试方法(T-GDCDC 010—2019).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《化妆品防腐挑战性测试方法(T-GDCDC 010—2019).pdf（9页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、ICS 71.100.01分类号:Y40T/GDCDC广东省日化商会团体标准T/GDCDC 010-2019化妆品防腐挑战性测试方法Test method for the preservative challenge of cosmetics2019-12-16 发布2020-01-01 实施广东省日化商会发 布T/GDCDC 010-2019I前言本标准按GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写规则起草。请注意本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由广东省日化商会提出和归口。本标准起草单位:上海新高姿化妆品有限公司、广州中科

2、检测技术服务有限公司、广州薇美姿实业有限公司、广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）、广东雅丽洁精细化工有限公司、广东博然堂生物科技有限公司、广东嘉丹婷日用品有限公司、广州市娇兰化妆品有限公司、广东芭薇生物科技股份有限公司、广东润洁日化有限公司、广东迪美生物技术有限公司、南京华狮新材料有限公司、拉芳家化股份有限公司、广东省日化商会。本标准主要起草人:李雪竹、唐嘉雯、钟瑜、陈敏珊、孙廷丽、郑木创、张梅、王耀、曾小云、张娇、张忠伟、刘永龙、任传鹏、周生、刘丽红、卓琦。本标准于2019年12月首次发布。T/GDCDC 010-20191化妆品防腐挑战性测试方法1范围本标准规定了化妆品的防腐效

3、果测试方法，包括术语和定义、仪器及设备、培养基和试剂、生物菌株、实验步骤和结果计数及报告方法。本标准适用于亲水性的膏、霜、乳、水剂等常见化妆品的防腐效果测试。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1防腐采用化学或物理方法预防或抑制产品内微生物生长的过程。2.2防腐挑战性测试在产品中接入若干种类，一定数量的微生物并定期检测样品中微生物的数量，根据数量的变化来评价其防腐效果。3仪器及设备测试所需仪器及设备如下：a)生物安全柜；b)高压蒸汽灭菌锅；c)冰箱：2-8；d)培养箱：361、282；e)恒温水浴锅；f)振荡器；g)天平：精确至 0.01g；h)pH 计；i)移液器：容量 1mL、5m

4、L 和 10mL；j)灭菌试管：15150mm；k)灭菌培养皿：直径 90mm；l)锥形瓶：容量 250mL；m)玻璃珠；n)玻璃棒；o)均质器；T/GDCDC 010-20192p)离心机。4培养基和试剂4.1卵磷脂-吐温 80 营养琼脂培养基4.1.1成分蛋白胨20g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g卵磷脂1.0g吐温807.0g蒸馏水1000mL4.1.2制法先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温 80，将其他成分加到其余的蒸馏水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐温 80，混匀，用 1mol/L 氢氧化钠溶液或 1mol/L 盐酸溶液调节 pH 值至 7.1-7.4，分装，

5、于 121高压灭菌 20 分钟。4.2沙氏琼脂培养基4.2.1成分蛋白胨10.0g葡萄糖40.0g琼脂15.0g氯霉素0.1g蒸馏水1000mL4.2.2制法取上述成分混合，溶解，分装，于115高压灭菌15分钟。4.3卵磷脂-吐温 80 沙氏琼脂培养基4.3.1成分蛋白胨10.0g葡萄糖40.0g琼脂15.0g氯霉素0.1g卵磷脂1.0g吐温807.0g蒸馏水1000mL4.3.2制法T/GDCDC 010-20193取卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80；取除卵磷脂和吐温80外其他成分加到剩余的蒸馏水中，溶解，再加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀，分装，于115高压灭菌15分钟。4

6、.4营养琼脂4.4.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏粉3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mL4.4.2制法取上述成分混合，溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH值至7.30.2，分装，于121高压灭菌15分钟。4.5生理盐水称取氯化钠8.5g，蒸馏水加至1000mL，溶解，分装，于121高压灭菌20分钟。4.60.5%氯化三苯四氮唑（TTC）称取氯化三苯四氮唑粉末0.5g，加100mL蒸馏水溶解，过滤除菌或于115高压灭菌20分钟，装于棕色试剂瓶，置4冰箱备用。5生物菌株菌株代数均不超过5代，可根据需求增加其他菌株作为实验菌株。可以使用加入世界菌种保藏联合会

7、的菌种保藏机构提供的、与下述菌种等效的试验菌。5.1细菌金黄色葡萄球菌ATCC6538，大肠杆菌ATCC8739，铜绿假单胞菌ATCC9027。5.2真菌白色假丝酵母ATCC10231，巴西曲霉ATCC16404。6实验步骤6.1样品的背景微生物检查6.1.1从不少于 2 个包装单位的产品中共取 10g 或 10mL，加入到装有玻璃珠的 90mL 灭菌生理盐水锥形瓶中，振荡 20 秒，或加入到装有 90mL 灭菌生理盐水的灭菌均质袋中，使用均质器拍打均质 1-2 分钟，混合后，制成 1:10 稀释液。6.1.2吸取稀释液 4mL，分别注入到四个灭菌平皿内，每皿 1mL。将 45-50卵磷脂-吐

8、温 80 营养琼脂培养基（每 100mL 卵磷脂-吐温 80 营养琼脂中加入 1mL 0.5%TTC 溶液）倾注到其中两个平皿内，另外两个平皿中倾注卵磷脂-吐温 80 沙氏琼脂培养基，每皿约 15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充T/GDCDC 010-20194分混匀，待琼脂凝固后翻转平皿。6.1.3细菌培养条件：361，48 小时2 小时，然后做菌落计数；真菌培养条件：282，5天，并于第 3 天起逐日1)观察计数，以菌落未蔓延生长的最大天数结果报告。6.22)菌液制备6.2.1混合细菌悬液制备6.2.1.1将待测细菌分别接种到营养琼脂斜面上，于 361培养 18 小时-24 小时。6.

9、2.1.2将 5mL-10mL 的生理盐水加入斜面试管内，反复吹吸洗下菌苔。6.2.1.3分别用移液器将每种菌悬液移至相应的无菌试管中，振荡 20 秒，混匀后，稀释至实验所需浓度 1108 CFU/mL-9108CFU/mL。6.2.1.4将每种细菌菌液稀释液按等体积混合，菌液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用，若保存在 2-8，可在 24 小时内使用。6.2.1.5取上述菌液1mL加入到9mL生理盐水试管中充分混匀，制成1:10稀释液，以此类推制成1:100，1:1000 等适宜的稀释倍数。取 2-3 个适宜浓度稀释度的稀释液（一般取稀释度为 1:100000，1:1000000和

10、1:10000000 的稀释液），每个稀释液取 2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。6.2.1.6将 45-50营养琼脂倾注到平皿内，每皿约 15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混匀，待琼脂凝固后，倒置于 361培养箱内培养 48 小时2 小时，然后做菌落计数。6.2.2混合真菌悬液制备6.2.2.1将待测真菌分别接种到沙氏琼脂培养基斜面上（或根据菌种培养需求自定），其中，白色假丝酵母于 282培养 24 小时-48 小时，巴西曲霉于 282培养 5-7 天。6.2.2.2将 5mL-10mL 的生理盐水加入斜面试管内，反复吹吸洗下菌苔。6.2.2.3分别用移液器将每种菌悬液

11、移至相应的无菌试管中，振荡 20 秒，混匀后，制备成实验所需浓1107CFU/mL-9107CFU/mL。6.2.2.4将每种真菌菌液按等体积混合，并使用 100m 细胞过滤器或无菌纱布过滤菌丝体，也可使用离心机离心获取孢子。菌液制备后可保存在 2-8，并在验证过的贮存期内使用。6.2.2.5吸取上述菌液 1mL 加入到 9mL 生理盐水中充分混匀，制成 1:10 稀释液，以此类推制成 1:100，1:1000 等适宜的稀释倍数。取 2-3 个适宜浓度稀释度的稀释液（一般取稀释度为 1:10000，1:100000，1:1000000 的稀释液），每个稀释液取 2mL，分别注入到两个灭菌平皿内

12、，每皿 1mL。6.2.2.6将 45-50沙氏琼脂培养基（或根据菌种培养需求自定）倾注到平皿内，每皿约 15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混匀，待琼脂凝固后，倒置于 282培养箱内培养 5 天，并于第3 天起逐日观察计数，以菌落未蔓延生长的最大天数结果报告。6.2.3单一细菌悬液制备按6.2.1中6.2.1.1、6.2.1.2、6.2.1.3、6.2.1.5和6.2.1.6步骤操作。6.2.4单一真菌悬液制备按6.2.2中6.2.2.1、6.2.2.2、6.2.2.3、6.2.2.5和6.2.2.6步骤操作。6.3待测样品加菌6.3.1混合菌接种1)当样品中菌落数100 CFU/mL

13、（g）时，方可进行防腐挑战性测试。2)接种方式可根据需求选择混合菌接种或单一菌接种。T/GDCDC 010-20195在无菌条件下称取样品于两个无菌试剂瓶中，每瓶100g或100mL。在称好的2瓶样品中分别加入1mL的混合细菌菌液和1mL的混合真菌菌液。将菌液和样品充分混合均匀，置于室温（20-25）避光贮存。6.3.2单一菌接种3)在无菌条件下称取样品于无菌试剂瓶中，每瓶100g或100mL。在称好的样品中加入1mL的单一菌液。将菌液和样品充分混合均匀，置于室温（20-25）避光贮存。6.4样品检测6.4.1分别于加菌后第 7、14、21 和 28 天检测化妆品中的菌落数。取样前，充分混匀样

14、品。6.4.2取 10g 或 10mL 样品加到装有玻璃珠及 90mL 灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振荡 20 秒，或加入到装有 90mL 灭菌生理盐水的灭菌均质袋中，使用均质器拍打均质 1 分钟-2 分钟，混匀后，稀释成 1:10的样品稀释液。6.4.3吸取 1:10 样品稀释液 2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。另取 1mL 注入到 9mL 灭菌生理盐水试管中，充分混匀，制成 1:100 检液，并吸取 2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。如样品含菌量高，还可再稀释成 1:1000，1:10000 等，并吸取各稀释液 2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。

15、每个稀释度应换 1 支吸管。6.4.4将 45-50培养基倾注到平皿内，每皿约 15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混匀。含细菌样品采用卵磷脂-吐温 80 营养琼脂培养基培养（每 100mL 卵磷脂-吐温 80 营养琼脂中加入 1mL0.5%TTC 溶液），含真菌样品采用卵磷脂-吐温 80 沙氏琼脂培养基培养，待琼脂凝固后翻转平皿。6.4.5细菌培养条件：361，48 小时2 小时，然后做菌落计数；真菌培养条件：282，5天，并于第 3 天起逐日观察，以菌落未蔓延生长的最大天数结果报告。7结果计数及报告方法7.1菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用5倍-10倍的放大镜检查，以防

16、遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。7.2细菌菌落计数及报告方法7.2.1首先选取平均菌落数在 30-300 个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数(见表 1 中例 1)。7.2.2若有两个稀释度，其平均菌落数均在 30-300 个之间，则应求出两菌落总数之比值进决定，若其比值小于或等于 2，应报告其平均数，若大于 2 则

17、报告其中稀释度较低的平皿的菌落数(见表 1 中例 2及例 3)。7.2.3若所有稀释度的平均菌落数均大于 300 个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表 1 中例 4)。7.2.4若所有稀释度的平均菌落数均小于 30 个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表 1 例 5)。3)根据菌种数量，每种菌种各需 1 瓶，单一菌种的试验应分别进行。T/GDCDC 010-201967.2.5若所有稀释度的平均菌落数均不在 30-300 个之间，其中一个稀释度大于 300 个，而相邻的另一稀释度小于 30 个时，则以接近 30 或 300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(

18、见表 1 中例 6)。7.2.6若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每 g 或每 mL 小于 10CFU。7.2.7菌落计数的报告，菌落数在 10 以内时，按实有数值报告，大于 100 时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用 10 的指数进表示(见表 1 报告方式栏)。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。表 1 菌落计数结果及报告方式7.2.8按重量取样的样品以 CFU/g 为单位报告，按体积取样的样品以 CFU/mL 为单位报告。7.3真菌菌落计数及报告方法判定结果时，应选取菌落数在 5-50 个范围之内的平皿计数，乘以稀

19、释倍数后，即为每 g（或每 mL）检样中所含的真菌菌落数。其他范围内的菌落数报告应参照菌落总数的报告方法报告。7.4对数减少值计算方法化妆品的防腐效果可以以菌落数的对数减少值（RX）作为评价指标。计算方式见式（1）。RX=lgNO-lgNX(1)式中：NO菌液在样品中的初始浓度；NX样品在不同检测时间的菌落数。例 次不同稀释度平均菌落数两稀释度菌数之比菌落总数CFU/ml 或 CFU/g报告方式CFU/ml 或 CFU/g10-110-210-311365164201640016000 或 1.610422760295461.63800038000 或 3.810432890271602.22

20、710027000 或 2.71044不可计4650513513000510000 或 5.1105527115270270 或 2.71026不可计305123050031000 或 3.1104700011010T/GDCDC 010-20197AA附录A（资料性附录）化妆品防腐效果评价标准表A.1 化妆品的防腐效果评价标准菌种类型细菌真菌评价参数对数减少值 RXa测试时间T7T14T21T28T7T14T21T28标准33 且 NIb3 且 NIb522 且 NIb2 且 NIb4标准33 且 NIb3 且 NIb411 且 NIb1 且 NIb3标准-33 且 NIb3且NIb-11 且 NIb1且NIba:在挑战测试中，可接受偏差范围为 0.5log。b:NI表示与前一个测试时间相比未增长。注:本评价标准仅供参考，各企业应根据不同产品及配方设计目标等制定相应的防腐效果评价标准。_