鸭坦布苏病毒抗体血凝抑制检测方法(T-CVMA 14—2020).pdf

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1、ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 142020 鸭坦布苏病毒抗体血凝抑制检测方法 Hemagglutination-inhibition detection method for antibody against duck Tembusu virus 2020-5-20 发布 2020-5-20 实施 中 国 兽 医 协 会 发 布 T/CVMA 142020 目 次 前 言.I 引 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 试剂和材料.1 6 器材和设备.2 7 血清样本的处理.3 8 操作步骤.3 9 结果判定.5 附录

2、A（规范性）鸭坦布苏病毒血凝抑制试验抗原的制备.6 附录 B（规范性）试剂配制.7 T/CVMA 142020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件部分条款涉及专利的使用。本文件由中国兽医协会提出并归口。本文件起草单位：北京市农林科学院、中国兽医药品监察所。本文件主要起草人：林健、王小蕾、杨志远、杨承槐、段会娟、赵际成、刘立新、潘洁、程慧敏、侯力丹、刘月焕。T/CVMA 142020 引 言 鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）引起的鸭生殖、免疫和神经等多系统脏器

3、损伤的急性传染病。以产蛋鸭产蛋骤然大幅下降和雏鸭出现神经症状和死亡为主要特征，死亡率可达 20%。该病 2010 年起在福建、浙江、江苏、山东、河北和北京等蛋鸭养殖区流行，给鸭产业造成了巨大的经济损失。鸭坦布苏病毒属于黄病毒属，目前国际上通用的黄病毒属血清学检测方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、琼脂扩散试验(AGP)、血凝抑制试验(HI)、补体结合试验(CFT)和中和试验(NT)等。其中，HI 方法具有敏感、简便的优点，在定性的同时也可以定量检测，并且不需要特殊仪器设备，更适合基层应用。检测诊断是疫病防制的基础，研发准确、快捷的鸭坦布苏病毒病检测方法，对当前防控鸭坦布苏病毒病具有重要意义。

4、北京市农林科学院通过暴露病毒粒子血凝特性工艺的研究，制备了鸭坦布苏病毒 HI 试验抗原，并建立了鸭坦布苏病毒抗体 HI 检测方法，该方法敏感、特异，易于操作，能快速定量检测鸭坦布苏病毒抗体水平。制定该病的检测技术标准，将有助于保障养鸭业健康发展，预防该病的传播与危害，提高对该病的检测技术。本文件的发布机构提请注意，申明符合本文件时，可能涉及到 5.1、8 与抗原制备及检测操作方法相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意在公平、合理、无歧视基础上，免费许可任何组织或者个人在实施本文件时实施专利。该专利持有人的声明已

5、在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：专利持有人：北京市农林科学院 联系人：刘月焕 地址：北京市海淀区曙光花园中路 9 号 北京市农林科学院 邮编：100097 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。T/CVMA 142020 1 鸭坦布苏病毒抗体血凝抑制检测方法 1 范围 本文件规定了鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）抗体血凝抑制检测方法的缩略语、试剂和材料、器材和设备、血清样本的处理、操作步骤、结果判定。本文件适用于鸭和鹅等水禽鸭坦布苏病毒抗体的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内

6、容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。BABS：牛血清白蛋白硼酸氯化钠溶液（Bovine Serum Albumin Boric Acid Sodium Chloride Solution）DID50：鸭半数感染量（Duck Median Infective Dose）HA：血凝反应（Hem

7、agglutination）HI：血凝抑制反应（Hemagglutination-Inhibition）HAU：血凝单位（Hemagglutination Unit）PBS：磷酸盐缓冲溶液（Phosphate Buffered Saline）VAD：病毒调整稀释液（Virus Adjusting Diluent）5 试剂和材料 5.1 鸭坦布苏病毒血凝抑制试验抗原 按照附录 A 制备。5.2 标准阳性血清 T/CVMA 142020 2 鸭坦布苏病毒（HB 株）用无菌 0.5%乳汉液（按照附录 B.1 制备）稀释成 100 DID50/0.5 mL，以 0.5 mL/只的剂量经肌肉注射途径接种

8、 14 月龄未做任何疫苗免疫、无传染病史、无明显临床症状的健康鸭，感染后 14 d 采集血液分离血清制备而成，HI 试验检测鸭坦布苏病毒抗体效价1:80。5.3 标准阴性血清 采集 14 月龄未做任何疫苗免疫、无传染病史、无明显临床症状的健康鸭血液，分离血清制备而成，HI 试验检测鸭坦布苏病毒抗体效价1:10。5.4 鹅红细胞悬液 按照附录 B.2 制备。5.5 0.33%工作浓度的鹅红细胞悬液 按照附录 B.3 制备。5.6 10%工作浓度的鹅红细胞悬液 按照附录 B.4 制备。5.7 阿氏液 按照附录 B.5 制备。5.8 PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）按照附录 B.6 制备

9、。5.9 VAD：按照附录 B.7 制备。5.10 硼酸氯化钠溶液 按照附录 B.8 制备。5.11 BABS 按照附录 B.9 制备。5.12 25%白陶土悬浊液 按照附录 B.10 制备。6 器材和设备 应配备如下器材和设备：恒温培养箱：371；冰箱：28；低速离心机；微量板振荡器；单道和多道微量移液器及吸头：10 L100 L；离心管：1.5 mL、15 mL；T/CVMA 142020 3 96 孔 U 型微量板；湿盒：商品化湿盒或自制，即塑料保鲜盒或铝制饭盒内置湿纱布。7 血清样本的处理 7.1 血清样本的存放与运送 血清样本置-20以下冷冻保存，应避免反复冻融。采集的血清样本可用冰

10、袋或保温桶加冰密封等方式运输。运输时间应尽量缩短。7.2 检测前血清样本的处理 7.2.1 100 L 血清加入 400 L25%白陶土悬浊液。7.2.2 剧烈震荡血清-白陶土混合物，每 5 min 震荡 1 次，共震荡 4 次。7.2.3 室温下 1000 g 离心 20 min。7.2.4 加入 100 L10%工作浓度的鹅红细胞悬液。7.2.5 每 5 min 轻轻摇动上层清液，不得扰动下层白陶土沉淀，使红细胞保持悬浮状态，共摇动 4 次。7.2.6 室温下 800 g 离心 10 min，红细胞沉积于白陶土上层。7.2.7 将上清液移入新管中，此液体视为 1:5 稀释的待检血清。8 操

11、作步骤 8.1 鸭坦布苏病毒血凝抑制试验抗原 HA 效价测定 鸭坦布苏病毒血凝抑制试验冻干抗原样品加入 1 mL BABS 复原，待抗原完全融化成澄清液体后，进行 HA 效价测定。采用 96 孔 U 型微量板进行试验，反应总体积为 100 L。从第 1 孔至第 12 孔，用移液器每孔加入 BABS 50 L，用移液器吸取被检样品 50 L，从第 1孔起，依次作 2 倍系列稀释，至第 11 孔，弃去移液器内 50 L 液体，第 12 孔为不加样的红细胞对照孔，然后每孔加入 50 L 0.33%的鹅红细胞悬液。立即在微量板振摇器上摇匀，放入湿盒，湿盒置 37作用 60 min，观察凝集反应。具体操

12、作方法见表 1。结果判定方法：微量板水平放置，当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。T/CVMA 142020 4 表 1 HA 效价测定操作术式 单位：L 孔数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 红细胞对照 稀释倍数 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 稀 释 液 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 抗 原 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 /0.33%鹅红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50

13、 50 8.2 4HAU 工作抗原液的制备 根据测定的血凝抑制试验抗原的 HA 效价，用 BABS 配制 4 个血凝单位（4HAU）的抗原。血凝效价除以 8 为抗原的预稀释倍数。示例：抗原的 HA 效价为 1:128，稀释倍数为 128/8=16，16 倍稀释，即 1 mL 的抗原液加入 15 mL BABS 进行稀释。抗原配制完成应进行标定，即将 4HAU 抗原液做 HA 效价测定，稀释至 1HAU 时应使红细胞完全凝集，稀释至 0.5HAU 时应使部分红细胞凝集。8.3 HI 试验 应用 96 孔 U 型微量板进行试验，反应总体积为 100 L。按表 2，用 BABS 将血清（待检血清处理

14、方法见 7.2）作 2 倍系列稀释，加入 25 L 4HAU 工作抗原，充分振摇后，置于湿盒内 28过夜。取出恢复至室温后，加入 50 L 0.33%的鹅红细胞悬液，混匀，放入湿盒，湿盒置 37作用 60 min，观察凝集反应。试验应设阴、阳性血清对照、处理后的血清样品对照及红细胞对照。表 2 HI 试验操作术式 单位：L 孔数 1 2 3 4 5 6 7 8 红细胞对照 血清对照 稀释倍数 5 10 20 40 80 160 320 640 稀释液/25 25 25 25 25 25 25 50 25 被检血清 50 25 25 25 25 25 25 25 /25 4HAU 抗原 25 2

15、5 25 25 25 25 25 25 /0.33%鹅红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 8.4 HI 试验成立条件 微量板水平放置，当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果，阳性对照血清以凝集图形与红细胞对照孔一致（即红细胞呈显著钮扣状）的血清最高稀释度为判定终点，阴性对照血清孔红细胞应完全凝集。当对照阴、阳性血清的 HI 效价与已知效价相差不超过 1弃去 弃去 T/CVMA 142020 5 个滴度时，试验结果成立。9 结果判定 微量板水平放置，以待检血清凝集图形与红细胞对照孔一致（即红细胞呈显著钮扣状）的血清最高稀释度作为判定终点；如果待检血清孔红细胞完全

16、凝集，则判为 HI 效价 1:5。待检血清的 HI 抗体效价1:10 判为阴性，HI 抗体效价1:10 判为可疑，HI 抗体效价1:20 判为阳性。T/CVMA 142020 6 附录 A（规范性）鸭坦布苏病毒血凝抑制试验抗原的制备 A.1 材料 A.1.1 鸭坦布苏病毒（HB株）：分离自发病北京鸭的脏器组织，GenBank登录号为MN649262。A.1.2 13 日龄 BALB/c 乳鼠：购买 SPF 级成年 BALB/c 鼠后繁殖。A.1.3 丙酮、甲醛、明胶、蔗糖：均为分析纯的商品化试剂。A.1.4 PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）：按照附录 B.6 制备。A.2 方法 A

17、.2.1 接种及收获：鸭坦布苏病毒 HB 株（DTMUV-HB 株）稀释至 100 ELD50（鸡胚半数致死量）/0.1 mL，以 0.025 mL/只的剂量脑内接种 BALB/c 乳鼠，接种后 6 d 收获存活乳鼠。无菌操作收集感染脑组织，匀浆，称重。A.2.2 提纯：按照 W/V1:4 的比例向脑组织匀浆中加入质量分数为 8.5%的无菌蔗糖溶液，混匀。在搅动状态下，将匀浆逐滴加入匀浆量 20 倍体积的 4预冷丙酮中。500 g 离心 5 min，弃去上清液，将沉淀物用与上述相同量的冷丙酮悬浮，冰浴至少 1 h。500 g 离心 5 min，弃去上清液。将沉淀物收集到无菌试管内，500 g

18、离心 5 min，弃去上清液，将沉淀物分装在干燥管内，-70冷冻过夜。A.2.3 提纯产物冻干：提取物真空冷冻干燥 6 h（-80）。A.2.4 水化：按照原匀浆量 V/V1:1.2 的比例，加入无菌 PBS 缓冲液，充分溶解冻干产物 12h24 h。8000 g 离心 1 h，取上清。A.2.5 灭活：上清液中按照溶液终体积 0.1%的比例加入甲醛灭活，颠倒混匀后，4静置 72 h。A.2.6 成品冻干：灭活后的上清液按抗原与保护剂 7:1 的比例加入由蔗糖、明胶配制的冻干保护剂（按照附录 B.11 制备），按照预设的冻干曲线真空冷冻制成冻干固态抗原。A.3 生物安全操作及处理 实验过程中的

19、生物安全要求应按照 GB 19489、NY/T 1948 的规定进行操作。T/CVMA 142020 7 附录 B（规范性）试剂配制 B.1 0.5%乳汉液的配制 称取 0.7 g CaCl2单独溶于少量去离子水，称取 40 g NaCl、2 g KCl、1 g MgSO47H2O、0.76 g Na2HPO412H2O、0.3 g KH2PO4、5 g 葡萄糖、25 g 水解乳蛋白，溶于 1000 mL 去离子水，加入 8 mL1%酚红溶液及溶解的 CaCl2溶液，加去离子水至 5000 mL，完全溶解后分装，116灭菌 15 min。28保存。用时，用 7.5%碳酸氢钠溶液调整 pH 值至

20、 7.07.2。B.2 鹅红细胞悬液的配制 未做任何疫苗免疫、无传染病史、无明显临床症状的健康 236 月龄鹅 24 只，静脉采血，按 1:1（v/v）加入阿氏液抗凝。1500 r/min 离心 5 min，去除阿氏液及白细胞。用PBS 洗涤红细胞 2 次，每次 1500 r/min 离心 10 min，弃上清，加入红细胞压积 10 倍以上的PBS 摇匀，28静置存放。存放时间不超过 10 d。B.3 0.33%工作浓度的鹅红细胞悬液的配制 静置存放的鹅红细胞悬液，使用前弃去上清，重新加入 PBS 摇匀，以 1500 r/min 离心15 min，用 VAD 配制成 0.33%浓度的红细胞悬液

21、，28存放。存放时间不超过 48 h。B.4 10%工作浓度的鹅红细胞悬液的配制 静置存放的鹅红细胞悬液，使用前弃去上清，重新加入 PBS 摇匀，以 1500 r/min 离心15 min，用 PBS 配制成 10%红细胞悬液，28存放。存放时间不超过 48 h。B.5 阿氏液的配制 称取 2.05 g 葡萄糖、0.8 g 柠檬酸钠、0.055 g 柠檬酸、0.42 g NaCl，加去离子水至100 mL，调整 pH 值至 6.1，115灭菌 30 min。28保存。B.6 PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）的配制 称取 8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.89 g Na2

22、HPO412H2O、0.2 g KH2PO4，加入去离子水至T/CVMA 142020 8 1000 mL，溶解后调 pH 值，121灭菌 30 min。28保存。B.7 VAD 的配制 称取 8.77 g NaCl、11.1 g Na2HPO412H2O、24.96 g NaH2PO42H2O，加入去离子水至 1000 mL，28保存。该溶液与等量 BABS 混合后 pH 值应为 6.2。B.8 硼酸氯化钠溶液的配制 称取 8.77 g NaCl、4.42 g H3BO3、0.96 g NaOH，加入去离子水至 1000 mL，调整 pH 值为 9.0，28保存。B.9 BABS 的配制 称取 0.1 g 牛血清白蛋白 V，加入硼酸氯化钠溶液至 100 mL。B.10 25%白陶土悬浊液的配制 称取 25 g 白陶土，加入 100 mL 硼酸氯化钠溶液。用前摇匀。白陶土质量标准为中值粒径为 1.1 m1.8 m、干燥失重不超过 1.5%。B.11 冻干保护剂的配制 称取 8 g 明胶、40 g 蔗糖，加入去离子水至 100 mL，116灭菌 40 min。室温保存。