非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法(T-CVMA 27—2020).pdf

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1、 ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 27-2020 非洲猪瘟病毒微滴式数字 PCR 检测方法 Method of droplet digital PCR for detection of african swine fever virus 2020-12-22 发布 2020-12-22 实施 中 国 兽 医 协 会 发 布 T/CVMA 27-2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件涉及专利。本文件由中国兽医协会提出并归口。本文件起草单位：中国动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人

2、：原霖、杨林、王传彬、宋晓晖、董浩、倪建强、刘洋、毕一鸣、陈亚娜。T/CVMA 27-2020 II 引 言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到一种检测饲料中非洲猪瘟病毒的数字PCR技术及试剂盒相关专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构承诺，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：专利持有人姓名：中国动物疫病预防控制中心（农业农村部屠宰技术中心）地址：北京市大兴区生物医药基地天贵大街17号 请注意除上

3、述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。T/CVMA 27-2020 1 非洲猪瘟病毒微滴式数字 PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，ASFV)微滴式数字PCR检测方法的原理、试剂与耗材、仪器与设备、操作步骤、结果分析。本文件适用于猪血液样品、淋巴结、脾脏、扁桃体、肌肉、血球粉、肉骨粉等样本中非洲猪瘟病毒核酸的精准定量检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，

4、其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 原理 微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）的技术原理是利用微滴化技术将一份反应体系分成数万个纳升级的微滴进行定量PCR检测，本质上是将传统定量PCR的一次检测变成数万次检测，提高了检测的灵敏度和精准度。微滴发生器可以将每一份扩增体系分成数万个均匀的纳升级微滴，每个微滴不含或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都将作为一个独立的PCR扩增体系，在PCR扩增仪上进行终点

5、PCR扩增。利用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0。根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。5 试剂与耗材 5.1 提取 宜选取商品化的病毒DNA提取试剂盒，或选用其他等效提取核酸方法。5.2 微滴式数字 PCR 扩增试剂 宜按照不同的微滴式数字 PCR 平台的说明书选取推荐的微滴式数字 PCR 扩增试剂。5.3 引物和探针 T/CVMA 27-2020 2 ASFV 上游引物(ASFV F)：5-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3 ASFV 下游引物(ASFV R)：5-GATACCACAAG

6、ATCRGCCGT-3 ASFV探针(ASFV P)：5-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-BHQ1-3 5.4 阳性、阴性及空白对照 以含有ASFV目的序列的质粒或者假病毒作为阳性对照；以未感染ASFV的动物组织混样总DNA作为阴性对照；以无核酸酶水作为空白对照。6 仪器与设备 生物安全柜、PCR扩增仪、数字PCR微滴发生器、数字PCR微滴检测器。7 操作步骤 7.1 样品采集及运输 按照NY/T 541执行。7.2 样品处理 检测前样品应在二级生物安全柜中处理。血液样品：用无核酸酶水作1:5稀释后编号备用。淋巴结、脾脏、扁桃体、肌肉等组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪

7、取待检样品2.0 g于研钵中充分研磨，再加10.0 mL 的0.01 mol/L PBS混匀（样品不足2.0 g按1:5比例加PBS），3 000 r/min，4 离心5 min，取上清液，编号备用。血球粉和肉骨粉处理不需要研磨步骤，其余处理同组织样品。将上述处理的样品置于60 条件下灭活30 min。7.3 DNA 提取 使用病毒DNA提取试剂盒或选用其他等效提取核酸方法对样品进行DNA提取。7.4 微滴式数字 PCR 扩增方法 微滴式数字 PCR 扩增体系配制如表 1。该步骤按照不同微滴式数字 PCR 平台的说明书进行操作。T/CVMA 27-2020 3 表 1 微滴式数字 PCR 扩增

8、体系 试剂 终浓度 mol/L 体积 L 2 酶混合液a-10 ASFV F（10 mol/L）0.5 1 ASFV R（10 mol/L）0.5 1 ASFV P（10 mol/L）0.1 0.2 DNA 模板-2 无核酸酶水-5.8 总体系-20 注：使用微滴式数字 PCR 平台进行实验时，应依据不同微滴式数字 PCR 平台说明调整扩增体系的组分和最终体积，并保证表中所列组分的终浓度不变。a 微滴式数字 PCR 扩增试剂。反应液配制后，使用数字 PCR 微滴发生器对扩增体系进行微滴生成。微滴生成后，使用 PCR 扩增仪或荧光定量 PCR 仪进行 PCR 扩增。使用数字 PCR 微滴检测器读

9、取 PCR 扩增结果，荧光分析步骤采用 FAM 单荧光通道，微滴式数字 PCR 扩增程序如表 2 所示。表 2 微滴式数字 PCR 扩增程序 步骤 温度 持续时间 循环数 1 95 10 min 1 2 95 30 s 40 3 55 1 min 4 98 10 min 1 5 4 60 min 1 注：升降温速度设置为 2/s。7.5 微滴式数字 PCR 反应的对照 在进行微滴式数字PCR实验，应设置阳性对照、阴性对照与空白对照。各对照PCR扩增体系中，除模板外，其余组分和PCR扩增程序同7.4。8 结果分析 8.1 实验成立条件 微滴式数字PCR扩增结果，有效微滴数不得低于理论微滴数的60

10、%。阴性对照组和空白对照组均未检出阳性微滴，阳性对照有明显阳性微滴，且核酸拷贝数浓度大于10 copies/L，则实验成立。8.2 阈值设定 微滴式数字PCR结果中，阴性微滴和阳性微滴明显分开，阈值设在阴性微滴和阳性微滴分开的区域。T/CVMA 27-2020 4 8.3 结果判定 样品中检测出阳性微滴，且阳性核酸拷贝数浓度10 copies/L，则判定为阳性。样品中检测出阳性微滴，阳性核酸拷贝数浓度10 copies/L，则需复检。若复检结果仍检测出阳性微滴，则判定为阳性，否则判定为阴性。样品中未检出阳性微滴，则判定为阴性。9 实验室生物安全要求 9.1 本方法涉及实验室生物安全管理要求见 GB 19489。国家农业行政主管部门另有规定的，按其规定执行。9.2 使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后按医疗废弃物进行处理。剩余样品等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后按医疗废弃物进行处理。_