空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验方法(T-CPMA 006—2019).pdf

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1、ICS 11.100.10 C 04 T/CPMA 0062019 空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验方法 Identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli 2019 年 8 月 16 日发布 2019 年 9 月 1 日实施 团体标准 中华预防医学会发布 T/CPMA 0062019 II 目 次 前 言.III 1 范围.1 2 设备和材料.1 3 培养基和试剂.1 4 检验程序.2 5 检测步骤.3 6 结果报告.7 7 生物安全.8 附录 A（规范性附录）培养基和试剂的成分及制法.9 A.1 粪便标本采集液的成分及制法.

2、9 A.2 食品样品漂洗液的成分及制法.9 A.3 增菌液的成分及制法.9 A.4 哥伦比亚血琼脂平板成分及制法.10 A.5 Karmali 琼脂平板成分及制法.11 T/CPMA 0062019 III 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由中华预防医学会归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、国家食品安全风险评估中心、黑龙江省疾病预防控制中心、北京市顺义区疾病预防控制中心、深圳市南山区疾病预防控制中心。本标准主要起草人：张茂俊、张建中、郭云昌、遇晓杰、段永翔、顾一心、李颖、李薇薇、闫军、马红梅、鞠长燕。T/CPMA 0062019 1

3、 空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验方法 1 范围 本标准规定了空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）、结肠弯曲菌（Campylobacter coli）的检验方法。本标准适用于粪便标本、食品和水样品中空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的检验。2 设备和材料 2.1 冰箱：4 8，-20，-80；2.2 恒温培养箱：42 1，36 1；2.3 微需氧培养装置：提供微需氧气体条件（5%氧气、10%二氧化碳和 85%氮气）；2.4 水浴装置：36 1、100；2.5 离心机：离心力20000 g；2.6 天平：感量 0.1 g；2.7 显微镜：10 倍100 倍，有相差功能；2.8 培养皿：直径为 9

4、0 mm 或 60 mm；2.9 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸；2.10 振荡器；2.11 过滤装置及滤膜（0.22 m、0.45 m）；2.12 均质器与配套均质袋；2.13 基因扩增仪；2.14 DNA 电泳仪；2.15 凝胶成像系统；2.16 弯曲菌分离培养试剂盒。3 培养基和试剂 3.1 粪便标本采集液：见附录 A 中 A.1。3.2 食品样品漂洗液：见附录 A 中 A.2。3.3 增菌液：见附录 A 中 A.3。3.4 哥伦比亚血琼脂平板：见附录 A 中 A.4。3.5 Karmali 琼脂平板：见附录 A 中 A.5。T/CPMA 0062019 2 3.6 空肠弯曲

5、菌标准菌株 ATCC700819。3.7 结肠弯曲菌标准菌株 ATCC33559。4 检验程序 空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验程序见图 1。42 1 24 h36 h 42 1 24 h48 h 42 1 24 h48 h 图 1 空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验程序 粪便标本 过滤接种 Karmali 或者哥伦比亚血琼脂平板，微需氧培养 食品样品 水样品 充分漂洗食品样品后取漂洗液增菌培养 富集水样品，取富集液增菌微需 挑取形态疑似菌落接种 Karmali或哥伦比亚血琼脂平板 PCR 核酸鉴定 生化鉴定 报告结果 氧 化 酶 试过氧化氢酶试验 马尿酸水解试验 吲哚乙酸酯水解试验 取粪便标本或肛拭子增菌

6、培养 革兰氏染色 T/CPMA 0062019 3 5 检测步骤 5.1 标本及样品采集、运输及前期处理 5.1.1 腹泻患者或者健康人粪便标本 尽量在患者使用抗生素前无菌采集新鲜粪便标本 3 g5 g（或者黄豆至蚕豆大小），将标本直接置于便盒中，冷藏保存（不可冷冻），当天送检。粪便量小于 3 g（黄豆大小）、便拭子或者肛拭子，可放入 Cary-Blair 运送培养基中，冷藏运输，当天送检。便拭子或者肛拭子也可直接放入弯曲菌的增菌液中，冷藏运输，当天运送实验室或 24 h 内进行增菌培养。注：腹泻患者标本采集时，黏液便尽量挑取有脓血和黏液部分。使用便拭子采集时，尽量将沾有标品的棉签部分浸入在运

7、输培养基或者保存液的液面以下，采集标本后应迅速拧紧管口或者盖口。5.1.2 家禽、家畜及其泄殖腔中粪便标本 直接将标本置于便盒中运输，或者无菌挑取黄豆粒大小标本直接放入装有 1.5 mL 的无菌生理盐水或者 PBS 缓冲液中，冷藏保存及运输，24 h 内进行检测。5.1.3 整禽胴体及分割肉样品 使用无菌均质袋采集整只禽胴体，冷藏运输回实验室，加入适量的样品漂洗液淹没样品（一般每 1 kg 样品加入 500 mL 样品漂洗液），置于振荡器上，100 r/min 震荡 15 min，反复揉搓禽胴体 5 min（注意各个部位均要揉到）。无菌操作取出禽胴体，取 2 mL 漂洗液进行检测。如果当天不能

8、检测可将禽肉样品浸润在漂洗液中，放置 4 冷藏过夜，24 h 内再次充分揉搓后，取 2 mL 漂洗液进行增菌培养。取分割肉 1 块（大于 25 g）放入无菌均质袋中，冷藏保存运输至实验室，加入适量样品漂洗液淹没样品，100 r/min 震荡 15 min,反复揉搓样品 5 min，无菌操作取出禽肉，取 2 mL漂洗液进行增菌培养。5.1.4 蔬菜、水果等样品 采集一定量的蔬菜或者水果（样品的采集量可以根据要求确定或者采集 100 g150 g），将样品放入无菌均质袋中，加入样品漂洗液后充分浸润、漂洗（一般每 100 g150 g 样品加入 100 mL 样品漂洗液），置于振荡器上，100 r/

9、min 震荡 15 min，取出样品，取漂洗液进行直接检测或者 4 低速(1500 g1900 g)离心 10 min，富集污染病原于 2 mL 增菌液中，进行增菌培养。5.1.5 水样品 废水取 20 mL50 mL，地面水取 100 mL200 mL，饮用水取 1 L4 L。无菌容器采集水样，将水样用 0.22 m 的无菌滤器过滤富集污染病原，或者将水样 4 低速(1500 g1900 T/CPMA 0062019 4 g)离心 10 min，富集污染病原于 2 mL 增菌液中进行增菌培养。5.2 细菌培养 5.2.1 培养条件 空肠弯曲菌、结肠弯曲菌皆为微需氧菌，在微需氧（5%氧气，10

10、%二氧化碳，85%氮气）气体环境下生长最好。空肠弯曲菌、结肠弯曲菌最适宜的培养温度为 42 1。空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的增菌培养和过滤培养都可在上述微需氧的环境下，42 1，培养 24 h48 h。5.2.2 粪便标本增菌培养 从便盒中挑取黄豆粒大小粪便标本（水样便 300 L500 L），加入到 2 mL4 mL 的增菌液中，充分混匀后进行增菌培养；将便拭子或者肛拭子直接放入 2 mL4 mL 的增菌液中，充分挤压混匀，取出棉签后进行增菌培养；松动增菌液的管口（目的是让微需氧环境的气体进入增菌液培养管中），在微需氧环境下，42 1 增菌培养 24 h36 h。5.2.3 禽肉、蔬菜、水果等样

11、品漂洗液增菌培养 直接取 2 mL 样品漂洗液或者样本富集液，加入到 4 mL 的增菌液中，充分混匀后进行增菌培养。5.2.4 水样品富集液增菌培养 将富集后的 0.22 m 滤膜用 2 mL 的无菌生理盐水或者 PBS 缓冲液反复冲洗，将冲洗液加入到 4 mL 的增菌液中，充分混匀后进行增菌培养；使用无菌剪刀将滤膜剪碎后直接放入4 mL 增菌液中，充分混匀后进行增菌培养；或者直接将富集的沉淀悬浮于 2 mL 的无菌生理盐水或者 PBS 缓冲液中，充分混匀后加入到 4 mL 的增菌液中，充分混匀后进行增菌培养24 h36 h。5.2.5 过滤培养 取出冷藏保存的 Karmali 平板和哥伦比亚

12、血琼脂平板，室温平衡 40 min60 min。无菌操作，用镊子取一片 0.45 m 的滤膜，将滤膜轻轻贴在平板的中央表面（光滑面朝上），使滤膜与培养基的表面充分贴合，注意不要产生气泡。如有气泡，可用镊子弯头背面或者无菌玻璃棒轻轻抚平。或者使用商用试剂盒时，按照试剂盒的说明操作，制备带有滤膜的 Karmali和哥伦比亚血琼脂平板。取出增菌培养物，拧紧管口，轻轻混匀，拧开管口，取 300 L500 L 的增菌培养物（样品不做增菌，直接过滤培养时，可直接取稀释后的样品 300 L500 L），分成 46T/CPMA 0062019 5 点，呈梅花样滴加于滤膜上，注意滴加的液体不能超过滤膜的边缘。在

13、生物安全柜中，等待滤膜上的液体充分透过滤膜（约 45 min60 min）,迅速揭掉滤膜，翻转培养平板，置于微需氧环境中 42 1，培养 24 h48 h（细菌培养 24 h 后如细菌生长缓慢或者菌落很小，可增加培养时间至 48 h，72 h 后仍无疑似菌落判断为阴性）。注：不同种类标本、样品运输至实验室后，可采用商用的空肠弯曲菌、结肠弯曲菌培养检测试剂盒（过滤法）进行分离培养，培养步骤按照试剂盒的说明进行。5.3 菌种鉴定 5.3.1 菌落形态及革兰氏染色鉴定 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌典型菌落形态一般有两种，一种呈圆形透明，光滑，针尖状或 水滴状，直径 1 mm3 mm，边缘整齐、有光泽的单个

14、菌落；另一种呈浅灰白色，半透明，扁平或稍突起，形状常呈不规则圆盘状，直径 2 mm5 mm 的单个菌落，培养时间增加，菌落直径变大。对疑似菌落进行革兰氏染色，空肠弯曲菌和结肠弯曲菌革兰氏染色阴性，革兰氏染色菌体形态弯曲，有如半个括号状，或者呈 S 形、螺旋状或海鸥展翅状。5.3.2 生化试验鉴定 5.3.2.1 氧化酶试验 挑取 35 个疑似菌落，划线接种到 Karmali 或者哥伦比亚血琼脂平板进行分纯培养 24 h48 h 后进行生化试验鉴定。用无菌棉签蘸取疑似菌落，将氧化酶试剂直接滴加到棉签的菌上，如果在 10 s 内出现紫红色、紫罗兰色或深蓝色为阳性。5.3.2.2 过氧化氢酶试验 挑

15、取 35 个菌落，加到干净玻片上的 3过氧化氢溶液中，如果在 30 s 内出现气泡则判定结果为阳性。空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和海鸥弯曲菌为阳性。5.3.2.3 马尿酸盐水解试验 挑取单菌落纯培养物（10 L 取菌环约半环），加到盛有 0.4 mL 的 1马尿酸钠的试管中制成菌悬液。混合均匀后在 36 1 水浴中温育 2 h 或培养箱中温育 4 h。沿着试管壁缓缓加入 0.2 mL 茚三酮溶液，不要振荡，在 36 1 的水浴或培养箱中再温育 10 min 后判读结果。若出现深紫色则为阳性；若出现淡紫色或没有颜色变化则为阴性。5.3.2.4 吲哚乙酸酯水解试验 挑取多个菌落至羟基吲哚醋酸盐纸片上，再

16、滴加一滴灭菌蒸馏水。如果吲哚乙酸脂水解，T/CPMA 0062019 6 则在 5 min10 min 内出现深蓝色；若无颜色变化则表示没有发生水解。5.3.2.5 生化试验结果判定 根据表 1 中的生化反应结果判定菌种。表 1 重要食源性弯曲菌生化试验结果 特征 空肠弯曲菌 结肠弯曲菌 海鸥弯曲菌 乌普萨拉弯曲菌（C.jejuni）（C.coli）（C.lari）（C.upsaliensis）氧化酶试验 过氧化氢酶试验 或微弱 马尿酸盐水解试验 吲哚乙酸脂水解试验 注：表示阳性；表示阴性。注：根据生化鉴定可报告生化鉴定结果，PCR 核酸检测鉴定方法可作为第二法或者核实鉴定的方法。5.3.3

17、核酸检测鉴定 5.3.3.1 DNA 模板制备 无菌接种环挑取适量纯培养细菌，在 200 L 无菌纯水中充分混匀，于 100 金属水浴加热 10 min 后，13000 g 离心 3 min，取上清液作为菌株鉴定的 DNA 模板。或者取一定量的纯培养细菌，按照商品化试剂盒的操作说明，使用 DNA 提取试剂盒提取纯培养细菌 DNA，作为菌株鉴定的模板。所有提取的 DNA 模板可在-20 条件下保存备用。5.3.3.2 多重 PCR 鉴定 a)多重 PCR 引物序列、产物大小及菌种判定见表 2。表 2 多重 PCR 鉴定的引物序列、产物大小及菌种判定 引物名称 推荐序列（53）产物长度（鉴定菌种）

18、16S-F ATCTAATGGCTTAACCATTAAAC 857 bp（空肠弯曲菌、结肠弯曲菌）16S-R GGACGGTAACTAGTTTAGTATT mapA-CJF CTATTTTATTTTTGAGTGCTTGTG 589 bp（空肠弯曲菌）mapA-CJR GCTTTATTTGCCATTTGTTTTATTA ceuE-CCF ATTTGAAAATTGCTCCAACTATG 462 bp（结肠弯曲菌）ceuE-CCR TGATTTTATTATTTGTAGCAGCG b)多重 PCR 反应体系（20 L）的设置见表 3。多重 PCR 鉴定体系需要设置阳性对照（空肠弯曲菌标准菌株ATCC7

19、00819,结肠弯曲菌标准菌株 ATCC33559的DNA 模板或者相T/CPMA 0062019 7 应克隆靶基因）、阴性对照(其它非弯曲菌菌株的 DNA 模板）以及空白对照。表 3 多重 PCR 反应体系（20L）试剂成分 终浓度 2 PCR 反应液 1 16S-F 0.4 mol/L 16S-R 0.4 mol/L mapA-CJF 0.2 mol/L mapA-CJR 0.2 mol/L ceuE-CCF 0.2 mol/L ceuE-CCR 0.2 mol/L DNA 模板 约 50 ng H2O c)多重 PCR 反应程序：95 预变性 5 min，95 变性 1 min，55 退

20、火 1 min，72 延伸 1 min，35 个循环后 72 延伸 5 min,4 保存。d)琼脂糖凝胶电泳：用 0.5TBE 制备1.5的琼脂糖凝胶（含0.5 g/mL的Goldview）。取 5 l 的 PCR 产物（可包括适量的上样缓冲液），用 DNA 分子量标记物做参照，电压 110 V，电泳 45 min50 min（根据实验室仪器情况确定具体电泳条件）。使用凝胶成像系统对电泳结果进行保存和分析。e)结果判定：阴性对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下，如待检菌落出现857 bp大小和589 bp大小的扩增条带，则可判定该菌落检验结果为空肠弯曲菌；如待测菌落出现 857

21、 bp 大小和 462 bp 大小的扩增条带，则可判定该菌落为结肠弯曲菌；如果阴性对照出现条带和/或阳性对照未出现预期大小的扩增条带，本次待测菌落的检测结果无效，应重新进行试验，并排除污染因素。6 结果报告 根据 5.3.2.5 和（或）5.3.3.2 的结果，报告标本/样品中检出或未检出空肠弯曲菌和（或）结肠弯曲菌。7 生物安全 按照我国人间传染的病原微生物名录空肠弯曲菌、结肠弯曲菌皆属于三类病原微生物，生物危险程度为 II 级，活菌的操作以及相关动物实验可在 BSL-2 实验室戴相应基础防护规范操作。T/CPMA 0062019 8 T/CPMA 0062019 9 附 录 A（规范性附录

22、）培养基和试剂的成分及制法 A.1 粪便标本采集液的成分及制法 酪蛋白酶解物 10.0 g 动物组织酶解物 10.0 g 葡萄糖 1.0 g酵母浸膏 2.0 g 氯化钠 5.0 g 亚硫酸氢钠 0.1 g 蒸馏水 1000 mL 将上述各成分溶解于蒸馏水中，校正 pH 值至 pH 7.0 0.2，加入 25%30%的甘油，充分混匀后 121 灭菌 15 min，备用。A.2 食品样品漂洗液的成分及制法 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钠（Na2HPO312H2O）9.0 g 磷酸二氢钾 1.5 g 蒸馏水 1000 mL 将上述各成分溶解于蒸馏水中，校正 pH 值至 pH 7

23、.0 0.2，121 灭菌 15 min，备用。A.3 增菌液的成分及制法 A.3.1 基础培养液成分及制法 牛肉提取物 10.0 g 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 蒸馏水 1000 mL 将上述各成分溶解于蒸馏水中，校正 pH 值至 pH 7.0 0.2，121 灭菌 15 min，备用。T/CPMA 0062019 10 A.3.2 生长添加剂成分及制法 丙酮酸钠 0.25 g 焦亚硫酸钠 0.25 g硫酸亚铁（水合盐）0.25 g 灭菌水 4 mL 将上述成分溶解于灭菌水中。A.3.3 抗生素成分及制法 多粘菌素 B 5000 IU 利福平 10.0 mg 甲氧苄啶 10.0

24、 mg 两性霉素 B 10.0 mg 乙醇-灭菌水（50+50，V+V）4 mL 将上述成分溶解于乙醇-灭菌水混合溶液中。A.3.4 增菌液的成分及制法 基础培养液 1000 mL 生长添加剂 4 mL 抗生素溶液 4 mL 将上述 A3.1A3.4 各成分无菌混匀后加入 5%的脱纤维羊血，分装备用。A.4 哥伦比亚血琼脂平板成分及制法 动物组织酶解物 23.0 g 淀粉 1.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 10.0 g 蒸馏水 1000 mL 将上述各成分溶解于蒸馏水中，校正 pH 值至 pH 7.0 0.2，121 灭菌 15 min，冷却到56 后，加入 5%的脱纤维羊血，摇匀后倒入无菌平皿中，90 mm 平皿或者 60 mm 平皿，22 mL/皿。4 保存，备用。T/CPMA 0062019 11 A.5 Karmali 琼脂平板成分及制法 哥伦比亚琼脂基础 39.0 g 活性炭 4.0 g 氯化血红素 0.032 g 蒸馏水 1000 mL 将各成分溶解于蒸馏水中，校正 pH 值，121 灭菌 15 min，冷却到 56 后，加入无菌平皿中，90 mm 或者 60 mm 平皿，22 mL/皿。4 保存，备用。_