比浊法操作手册.docx

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1、比浊法操作规程一、预备工作：一培育基的制备：1、III 号培育基的制备胨5 g葡萄糖1 g牛肉浸出粉1.5 g磷酸氢二钾3.68g磷酸二氢钾1.32 g氯化钠3.5 g酵母浸出粉3 g水1000ml除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调整pH 值使灭菌后为 7.07.2，在 115灭菌 30 分钟。2、养分琼脂培育基的制备依据养分琼脂培育基上标注的比例系数，进展养分琼脂培育基和纯化水配制。或者依据药典进展配制。胨10 g氯化钠5 g琼脂1520 g肉浸液1000 ml除琼脂外，混合上述成分，调整 pH 值使比最终的pH 值略高 0.20.4， 参与琼脂，加热溶化后滤

2、过，调整 pH 值使灭菌后为 7.27.4，分装，在115灭菌 30 分钟，趁热斜放使凝固成斜面。3、留意事项（1） 含有葡萄糖的培育基应在各成分加热溶解后再参与，其目的是防止葡萄糖加热被破坏。（2） 配制的培育基必需调整pH 值，保证培育基灭菌后其pH 值在规定范围之内；测定硫酸庆大霉素的培育基pH 值灭菌后最好在 7.157.20。11pH 值的测定使用酸度计或其它准确度较高的仪器，使用 20%的氢氧化钠溶液或浓盐酸进展调整；调整pH 时应避开反复调整。（3） 配制的培育基应透亮、无沉淀。应先调整pH 再分装后灭菌。（4） 配制好的培育基应储存在冷处，消灭浑浊后不能连续使用。二缓冲液的制备

3、：1、pH7.0 磷酸盐缓冲液 BP磷酸二氢钾 13.6 g氢氧化钠 2.37 g灭菌水 2023 ml2、pH7.8 磷酸盐缓冲液磷酸氢二钾 5.59g磷酸二氢钾0.41 g水1000ml3、留意事项（1） 所用化学药品规格不低于二级试剂(AR)规格。（2） 配制后假设消灭沉淀或浑浊应用耐酸滤过漏斗滤过，使溶液澄清。（3） 缓冲液配制后应澄明无色、无菌、无浑浊沉淀，应避开被毛点、纤维污染。（4） 配制后应灭菌保存使用。三试验菌：菌悬液的制备：金黄色葡萄球菌悬液 取金黄色葡萄球菌的养分琼脂斜面培育物， 接种于养分琼脂斜面上，在 3537培育 2022 小时。临用时，用灭菌水或 0.9%灭菌氯化

4、钠溶液将菌苔洗下，备用。大肠杆菌悬液 取大肠杆菌的养分琼脂斜面培育物，接种于养分琼脂斜面上，在 3537培育 2022 小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下， 备用。白色念珠菌悬液 取白色念珠菌的改进马丁琼脂斜面的颖培育物， 接种于 10 ml号培育基中，置 3537培育 8 小时，再用号培育基稀释至适宜浓度，备用。四试验器具：1、比色皿及大口吸管的清洗、灭菌：用自来水冲洗比色皿 5 次以上，再用去离子水将每个比色皿清洗三次， 放入恒温枯燥箱，150160干热灭菌 12 小时。加培育基和菌液用大口吸管依次用自来水、洗涤液、自来水冲洗干净，用纯化水冲洗三次，用 牛皮纸逐支包好，150160干热灭菌

5、12 小时，备用。2、容量瓶、移液管、刻度吸管等周密计量器具的清洗、灭菌：依次用自来水、洗涤液、自来水洗涤，用纯化水冲洗三次，必要时于150160干热灭菌 12 小时。3、留意事项比浊法所用器具应避开抗生素及微生物污染，必要时周密计量器具应进展灭菌。五抗生素溶液的配制：周密称取标准品或供试品适量制剂产品可依据剂型选择适当的方 法于容量瓶中，配制成浓度为1000u/ml 的溶液，选择适当的方法稀释至规定浓度。二、比浊法操作过程：1、标准品溶液及供试品溶液的制备可按各品种的具体规定，稀释制备，也可以进展预试验，选择适宜的浓度比，假设试验菌的灵敏度高可以选择低的剂间比，如 1.25:1；假设试验菌的

6、灵敏度低则可选择较高的剂间比，如2:1 或 4:1 等。2、标准品溶液及供试品溶液的分装取备好的大试管 16 支，安排dS14 支，dS24 支，dT14 支及 dT24 支，分别作好标记，依据拉丁方挨次排列。将标准品溶液 d 、d及供试品溶液SlS2T1T2d 、d 各 1.0 毫升按编号参与相应的大试管中。留意：参与溶液时，均在有标记处沿管壁移入，以便在分装培育基时，可沿此处管壁流入，将沾在试管壁上的抗生素充分洗入培育基内如有自动加样装置，则可免去此手工法操作。 比浊法大试管拉丁方排列示意图3、比浊法试验用培育基的接种接种试验菌的量，需作推想试验，使 S1、S2 管，经培育后(37，一般

7、4 小时)，吸取度AD 光密度以 0.30.7 为适当。4、培育基的分装比浊法试验用的培育基，接种试验菌后用大口吸管或其他自动加样 器，分装至大试管中，每管分装 9.0ml，每管分装量应尽量全都，其差异越小试验的周密度越高。移入培育基时，按参与样品溶液的标记处稍上方， 沿管壁流入，马上振摇，使抗生素溶液与培育基混合均匀。5、培育依据各品种规定的条件进展培育。6、测量取同条件下接种的比浊试验用培育基9.0ml，加稀释剂 lml，12甲醛液 0.5ml 摇匀，作为空白，使用分光光度计进展测量。使用 WBS-100 微生物比浊仪可进展恒温振荡培育并在线快速测量，在波长 530nm 处，测量各大试管内

8、培育物的吸取度。短时间内完成的在线测量，既能保证更高的精度，又避开了与甲醛的过多接触。7、计算结果及误差统计分析比浊法效价测定二剂量法结果的计算，可照管碟法效价测定二剂量法 结果的计算方法计算，并用误差统计分析方法进展牢靠性检验，求出效价、偏离平行及可信限率等，以检验试验结果的牢靠性。使用 WBS-100 微生物比浊仪可进展自动计算比浊法操作留意事项1、防止抗生素污染：比浊法测定抗生素效价抗生素溶液的浓度格外低，抗生素在培育基中的最终浓度约为 0.010.1u/ml，因此测定时所用的试验器具应严防抗生素残留和污染。比方，培育用比色皿至少用自来水冲洗6 次、用纯化水冲洗三次，洗涤比色皿和大口吸管

9、的水池与洗涤抗生素溶液的水池分开。2、防止微生物污染：微生物污染比照浊法测定效价有很大影响，假设试验用器具、材料被微生物污染，将导致生物反响紊乱，各管形成的吸取度周密度变差，可信限率显著增高，测定结果的周密度和准确度变差，所以试验过程中应严防微生物污染。因此，试验用比色皿、大口吸管、培育基、缓冲液等应灭菌后使用，稀释用周密计量器具必要时进展灭菌。3、菌种：试验用菌种应保持颖、纯洁，对抗生素反响应灵敏。菌种对测定影 响很大，假设菌种不适合，将得不出正确结果甚至得不出结果。假设菌种不 鲜，其生长速度慢，在规定时间内浊度吸取度达不到要求；假设菌种不 纯，各管形成的吸取度周密度差，可信限率高；假设菌种

10、对抗生素反响不灵 敏，凹凸剂量抗生素形成的吸取度距离减小，测定结果可信限率显著增高。4、培育基：试验用培育基的灵敏度应高，应严格把握培育基的pH 值。假设培育基的灵敏度不高或培育基的 pH 值不适合，细菌生长速度慢，在规定时间内浊度吸取度达不到要求。硫酸庆大霉素培育基消毒后 pH 值最好把握在 7.157.20。5、抗生素溶液的配制、稀释与参与：配制、稀释抗生素溶液时应准确、周密；参与1.00ml 抗生素溶液时应周密，从某一记号处参与，目的是用培育基将粘在管壁的抗生素溶液冲下； 参与 9.0ml 带菌培育基应周密。6、培育：培育温度应均匀，应依据随机排列的方式进展培育二剂量法和三剂量法依据拉丁

11、方排列，以消退局部培育温度不均匀对结果的影响。7、培育时间：培育时间不行过长，吸取度不行过高，凹凸剂量吸取度到达 0.3 以上即可。假设觉察某种剂量下细菌生长缓慢或停顿生长应停顿试验，否则测定结果变化较大。比浊法常见的特别现象及其解决方法特别现象缘由解决方法细菌生长的浊度大，阳性对菌种不纯；抗生素的浓更换菌种；提高抗生素1 照、凹凸剂量距离小，可信度不适宜低溶液的浓度限率高2 阳性比照、凹凸剂量细菌生菌种不颖，活力差；更换或纯化菌种； 长的浊度值均小。培育基不灵敏更换培育基3 阳性比照浊度大，凹凸剂量抗生素的浓度不适宜 降低抗生素溶液的浓浊度小高度阳性比照浊度大，阳性对 比色皿被抗生素污染；清

12、洗比色皿；更换菌种照、凹凸剂量浊度均符合要菌种不纯或器具被杂 或对器具进展清楚灭4 求，阳性比照、凹凸剂量间菌污染；加样不周密 菌；提高加样的周密度的距离符合要求，各管间的浊度值周密度差，可信限率高阳性比照、低剂量浊度值符抗生素的浓度不适宜 降低剂间比5 合要求，高剂量浊度值低，剂间比过大 凹凸剂量距离过大阳性比照、凹凸剂量浊度值抗生素的浓度不适宜 提高剂间比6 均符合要求，阳性比照与低剂间比过小 剂量距离符合要求，凹凸剂量距离过小某一管或几管特别过高或 漏加或错加溶液；比色加强操作，削减错误；7 过低皿方向放置错误；抗生加强操作，削减错误； 素污染器具清洗消毒8 结果明显不正确，偏离平行四组

13、剂量依据拉丁方 加强操作，削减错误特别高排列放置时位置错误操作实例分析1、以下是一组有问题的试验报告：由其中的一些试验数据我们可以得出一些问题。具体分析如下：品名：硫酸庆大霉素原料编号：00005试验日期：2023.11.16碟号ds1ds2dt1dt2ymNo.10.4920.4790.4970.4881.956No.20.4840.4690.4820.4631.898No.30.4950.4740.4920.4701.932No.40.4890.4760.4910.4701.927No.50.5070.4910.5120.4861.996No.60.5030.4770.4990.4711.

14、950No.70.4810.4870.5000.4851.954No.80.4960.4840.5040.4801.964yk3.9463.8383.9783.81415.576阳性比照：0.521培育时间：3.5 小时试管型号：2 试品间F1 =0.0695回归F2 = 78.3748偏离平行F3 =3.1699剂 间F6 =27.2044组间F7 = 7.0663组数m =8估量效价 At = 100剂间比r = 1.5浓度比D =1对数值I =0.1761t 表t =2.08样品方差S2 = 0自由度f =21R 的对数M = 0.0052回归系数 g = 0.0552标准误差 Sm =

15、 0.0205对数比值R = 0.9880R 上限Rh = 1.089R 下限Rl = 0.8951测定效价Pt = 98.8002Pt 上限 Ph = 108.9019Pt 下限 Pl = 89.5091平均可信限率Pt 的 FL% = 9.81试验说明：菌液：III 号培育基培育 18 个小时。溶液配制：由 1000 单位100 单位5 单位0.4 单位和 0.6 单位。培育过程：在WBS-100 微生物比浊仪中 37恒温振荡培育 3 小时 30分。问题与争论:符合第一条特别现象。该结果可信限没有通过，回归数值太小，主要缘由是凹凸剂量没有拉开，另外阳性比照数值根本上和低剂量之间的差异不是很

16、大，其缘由主要是：细菌年龄老化，细菌老龄化造成了对抗生素不敏感，凹凸剂量之间的距离过小。消灭这种状况只能更换菌种，下次做试验时最好用颖的菌种。选择的抗生素溶液浓度过低，应提高溶液的浓度，必要时提高剂间比。2、以下是某药品检验所用WBS-100 微生物比浊仪做出的一份试验结果：试验数据如下：品名：硫酸庆大霉素原料编号：00006试验日期：2023.11.2碟号ds1ds2dt1dt2ymNo.10.2520.0990.2420.0950.688No.20.2280.0890.2370.0910.645No.30.2260.0870.2370.0850.635No.40.2340.0910.232

17、0.0890.646No.50.2560.0950.2460.0950.692No.60.2550.0900.2490.0920.686No.70.2530.0920.2420.0880.675No.80.2530.0940.2530.0940.694yk1.9570.7371.9380.7295.361阳性比照：0.436试品间剂 间F1 =F6 =0.7115回 归 F2 = 5758.27771919.7024 组 间F7 = 4.5630偏离平行F3 =0.1181组数m =8估量效价 At = 100剂间比r = 1.5浓度比D =1对数值I =0.1761t 表t =2.08样品方

18、差S2 = 0.0032自由度f =21R 的对数 M =0.0052回归系数 g = 0.0552标准误差Sm = 0.0205对数比值 R = 1.0045R 上限 Rh = 1.0158R 下限Rl = 0.9934测定效价 Pt = 100.4517Pt 上限 Ph = 101.5752Pt 下限Pl = 99.3413平均可信限率Pt 的 FL% = 1.11试验说明：菌液： III 号培育基培育 18 个小时。加样操作：由 1000 单位100 单位5 单位0.4 单位和 0.6 单位。培育过程：在WBS-100 微生物比浊仪中 37恒温振荡培育 3 小时 30分。问题与争论:符合

19、第三条特别现象1、测定效价准确，可信限也格外低；但是凹凸剂量浊度值低而且差距太大，主要是由于抗生素对细菌的抑制太明显，细菌生长缓慢。2、造成这种状况的缘由是抗生素浓度过高。3、左右效价差距大约在一个效价单位左右，精度很好。3、以下是本公司试验室工作人员做出的一些报告：品名：硫酸庆大霉素原料自身比照编号：00006试验日期：2023.11.2碟号ds1ds2dt1dt2ymNo.10.5580.3750.5540.3791.866No.20.5510.3720.5510.3651.839No.30.5390.3670.5320.3581.796No.40.5500.3570.5560.3681.

20、831No.50.5650.4040.5590.3911.919No.60.5360.3740.5320.3811.823No.70.5490.3820.5580.3801.869No.80.5690.3790.5810.3831.912yk4.4173.0104.4233.00514.855阳性比照：0.692培育时间：4 小时试管型号：1 试品间F1 =0.0004回归 F2 =3369.3252偏离平行F3 =0.0511剂 间F6 =1123.1250组间 F7 = 7.0663组数m =8估量效价 At = 100剂间比r = 1.5浓度比D =1对数值I =0.1761t 表t =

21、2.08样品方差 S2 = 0.0001自由度f =21R 的对数 M =0.0001回归系数 g = 0.0013标准误差Sm = 0.0205对数比值 R = 0.9999R 上限 Rh =1.0145R 下限Rl = 0.9854测定效价 Pt = 99.9856Pt 上限 Ph = 101.4499Pt 下限Pl = 98.5425平均可信限率Pt 的 FL% = 1.45试验说明：菌液：斜面培育基培育 20 小时，加 2 毫升菌液。加样操作：由 1000 单位100 单位5 单位0.4 单位和 0.6 单位。培育过程：在WBS-100 微生物比浊仪中 37恒温振荡培育 4 小时。问题

22、与争论：1、总体结果良好，凹凸剂量之间的差距拉开明显，并且符合药典规定吸光度的范围。估量效价及可信限率均不错。2、只要每个比色皿中参与的抗生素准确、周密，菌液及培育基参与也准确，这种做法培育出来的结果可以到达不错的效果。4、以下试验是在某省所做出的回收率试验报告：该报告左半局部拉丁方阵是测定 90%的含量，右半局部是测定 110%的含量。品名：硫酸庆大霉素原料自身比照 编号：00006试验日期：2023.11.29左侧：90%含量测定碟号ds1ds2dt1dt2ymNo.10.4280.2790.4500.3141.480No.20.4320.2700.4380.3101.450No.30.4

23、110.2650.4700.3151.461No.40.4030.3010.4450.3181.467阳性比照：0.562培育时间：3 小时 50 分试管型号：2 试品间剂 间F1 = 23.7193F6 =133.0591回 归 F2 = 375.4530组 间 F7 = 0.1892偏离平行 F3 =0.0048组数m =8估量效价 At = 100剂间比r = 1.5浓度比D =1对数值I =0.1761t 表t =2.2620样品方差 S2 = 0.0002自由度f =21R 的对数M = 0.0425回归系数 g = 0.0136准误差Sm = 0.0094对数比值R = 0.906

24、7R 上限 Rh =0.9511R 下限Rl = 0.8621测定效价Pt = 90.6721Pt 上限 Ph = 95.1124Pt 下限Pl = 86.2056平均可信限率Pt 的 FL% = 4.91问题与争论：左侧测得的效价与 90%格外接近,凹凸剂量之间根本上也已经拉开确定的距离，可信限也能把握在 5%以内，偏率平行也通过，说明该结果符合要求。右侧：110%含量测定碟号ds1ds2dt1dt2ymNo.10.4120.2580.3850.2191.274No.20.4280.2750.3680.2321.303No.30.3980.2410.3520.2281.219No.40.40

25、00.2610.3900.2311.282阳性比照：0.562培育时间：3 小时 50 分试管型号：2 试品间F1 =33.8013回归F2 = 664.1970偏离平行F3 =0.1525剂 间F6 =232.7171组间F7 = 2.4152组数m =8估量效价At = 100剂间比r = 1.5浓度比D =1对数值I =0.1761t 表t =2.2620样品方差S2 = 0.0001自由度f =21R 的对数M = 0.0415回归系数 g = 0.0077标准误差Sm = 0.0070对数比值R =1.1002R 上限 Rh =1.1421R 下限Rl = 1.0614测定效价Pt

26、=110.0165Pt 上限 Ph = 114.2058Pt 下限Pl = 106.1382平均可信限率Pt 的 FL% = 3.67问题与争论：高剂量抗生素吸取度略微偏低右侧测得的效价与 110%格外接近，凹凸剂量之间也拉开了距离，可信限也把握在 5%以内，偏率平行也通过，说明该结果也符合要求。综合争论： 由以上的左右两组拉丁方阵测得的结果可以看出： 在比浊仪上同时测得两组含量不同的样品，结果也能到达格外好的效果。5、以下是某药品检验所做出的试验结果：该硫酸庆大霉素注射液含量不符合规定品名：硫酸庆大霉素注射液编号：00003试验日期：2023.11.04 初试结果：碟号ds1ds2dt1dt

27、2ymNo.10.4530.3120.4690.3351.569No.20.4480.3250.4580.3541.585No.30.4550.3190.4780.3421.594No.40.4590.3230.4820.3491.613No.50.4400.3180.4780.3411.577No.60.4450.3200.4720.3621.599No.70.4470.3280.4660.3411.582No.80.4330.3050.4700.3481.556yk3.5802.5503.7732.77212.675试品间剂 间F1 = 90.5336F6 = 753.1149回碟归间F2

28、 = 2168.3692F7 = 1.3384偏离平行F3 = 0.4421组数m =8估量效价 At = 100剂间比r =2浓度比 D =1.0016对数值 I =0.3010 t 表t =2.08样品方差 S2 = 0.0059自由度f =21R 的对数 M = 0.0608回归系数 g = 0.0020标准误差 Sm = 0.0066对数比值 R =0.8693R 上限Rh = 0.8970R 下限Rl = 0.8420测定效价 Pt =86.9329Pt 上限Ph =89.7018Pt 下限 Pl = 84.2023平均可信限率Pt 的 FL% = 3.16复试结果：碟号ds1ds2

29、dt1dt2ymNo.10.5680.3540.5990.3611.882No.20.5790.3480.6050.4051.937No.30.5820.3620.6110.4181.973No.40.5590.3470.5940.3851.885No.50.5750.3650.6120.4151.967No.60.5620.3590.6020.4091.932No.70.5670.3640.6140.3961.941No.80.5730.3550.6220.4111.961yk4.5652.8544.8593.20015.478试品间剂 间F1 = 51.1917F6 = 1448.0846

30、回碟归间F2 = 4192.0639F7 = 3.5864偏离平行F3 = 0.9981组数m =8估量效价 At = 100剂间比r =2浓度比D =1.0016对数值I = 0.3010t 表t =2.08样品方差S2= 0.0085自由度f =21R 的对数M =0.0565回归系数 g = 0.0010标准误差Sm = 0.0047对数比值R =0.8781R 上限Rh = 0.8981R 下限Rl = 0.8583测定效价Pt =87.8062Pt 上限 Ph =89.8082Pt 下限Pl = 85.8259平均可信限率Pt 的 FL% = 2.27试验说明：菌液：养分琼脂斜面培育

31、基培育 16 小时。加样操作：1000u/ml 硫酸庆大注射液100u/ml5u/ml0.35u/ml 和0.7u/ml 的硫酸庆大注射液。培育过程：在 37下，20X20 的石英比色皿中培育 3 小时 20 分。管碟法结果:初试：83.56%， 复试：90.48%,合并计算结果：86.59%问题与争论：比浊法测定结果周密度好，管碟法测定结果周密度较差，两种方法测定结果合并计算值接近。WBS-100 微生物比浊法测定仪操作规程1、接通仪器电源，长按主机键盘左上角“开关”键2 秒钟或使用电子钥匙开启仪器。2、消灭用户登录界面后，点“确认”按钮进入仪器主菜单。3、在消灭的主菜单中点“工具”按钮，进

32、入工具菜单界面。4、每天第一次试验在时仪器需要预热，按“ 预热培育箱”按钮，进入培育箱预热选项，再按“启动预热”按钮，启动预热。5、室温 25时预热时间约 1.5 小时，然后按“退出”按钮，回到主菜单。6、在消灭的主菜单中点“建”按钮，建立一个的试验。7、选择试验方法中的“二剂量文档”，然后按“下一步”按钮。8、在接下来消灭的试验步骤一中，依据各项提示进展样品信息设定，如需要修改各项内容则需按输入框右面的择相应的输入法进展输入，输入完毕后点写完毕后。按“下一步”按钮。按钮，在消灭的输入界面中选按钮确认输入内容，各项填9、接下来消灭试验步骤二的设定，其设定内容依据样品及标准品的 实际状况设定，其

33、中“起始浓度”与“中心浓度”为一剂量中所用，在此无效，填写完毕后按“下一步”按钮，连续试验。10、在停顿条件界面中，可以对试验停顿条件进展设定，试验停顿条件包括“时间停顿”和“时间+吸光度停顿”两种，中选择时间停赶忙实 验到达规定时间后即停顿，中选择时间+吸光度停赶忙，试验到达相应吸 光度范围或到达所规定的时间时均会停顿。设定完毕后即可按“下一步” 按钮，进入下一步设定。11、接下来进入环境参数设定及振摇参数设定界面，可以进展培育温 度、振摇、实时监控及振摇频率的设置，具体值可依据试验需要进展设定， 一般状况下，振摇间隔时间设定为 5 分钟，单次振摇时间设定为 30 秒，20检测间隔时间设定为

34、 15 分钟，振摇频率设定为 1。设定完毕后按“下一步” 按钮，可进入下一步设定。12、进入比色皿矩阵设置后，可以依据所做的试验状况选择默认的试验参数，其中方法一是单组在左边时的拉丁方排列，方法二是单组在右边的拉丁方排列，方法三是双组拉丁方排列。选择好适宜的排列方法后即可按“下一步”按钮连续试验。13、在文件保存界面中，填写适当的文件名，然后按“下一步”按钮， 连续，在接下来的警告对话框中点“确认”按钮，开头试验。试验完毕后仪器自动打印报告如中途需要提前停顿试验，则应点“提前完成”按钮，此时仪器自动停顿此次试验并将试验结果打印出来，最终保存试验结果。，全部试验完毕后长按主机键盘左上角“开关”键2 秒钟或直接按主界面右上角的 关闭仪器。2123