漆酶高产菌株的筛选实验方案.docx

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1、漆酶简介漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(Laccase, P-diphenol oxidase, EC.1.10.3.2) ，广泛分布于高等动植物、昆虫、真菌分泌物和少量细菌中，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。漆酶为含铜的糖蛋白，约由 500 个氨基酸组成，多为单一多肽，个别为四聚体。糖配基占整个分子的 10%45%，糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。由于分子中糖基的差异，漆酶的分子量随来源不同会有很大差异，甚至来源一样的漆酶分子量也会不同。通过对漆酶蛋白质晶体构造的争辩觉察,漆酶具有 3 个铜离子结合位点,共结合 4 个铜离子,且这 4 个铜离子处于漆酶的活性部

2、位,在催化氧化反响中起打算作用，假设除去铜离子,漆酶将失去催化作用。漆酶具有较强的氧化复原力量，能催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使分子氧直接复原成水，将酚类和芳胺类化合物复原成醌类物质，没有副产物的生成。由于漆酶具有特别的催化性能和广泛的作用底物，使得漆酶具有广泛的应用价 值。漆酶应用主要集中在制浆造纸，特别是纸浆的生物漂白，环境保护，木质纤维素降解等方面。造纸工业方面，由于漆酶能高效的降解木质素及与木质素具有相像构造的物质，避开造纸工序中所使用的化学物质影响环境。环境保护方面， 漆酶能有效的除去工业废水、化学农药当中的毒物酚、芳胺、单宁和酚醛化合物， 生物消退有毒化合物，使得漆酶在废水处理

3、等环保事业有宽阔的前景。分光光度法测定漆酶活力最常用的底物是 2,2-连氮一双(3-乙基苯并唆毗咯琳-6-磺酸)(ABTS)。1试验一 高产漆酶菌株酶活测定1 主要试剂的配制（1） 0.2 mmol/L pH 4.5 柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液A 液：0.2 mmol/L 柠檬酸溶液：称取柠檬酸 21.014 g，参加蒸馏水溶解定容至 500mL。B 液：0.2 mmol/L 柠檬酸钠溶液：称取柠檬酸钠 29.412 g，参加蒸馏水溶解定容至 500mL。A 液和 B 液混合，搅匀，于 pH 计上调整至 pH4.5。（2） 0.5 mmol/L 的 ABTS 溶液将一片 ABTS 片剂142 mg

4、/片用 0.2 mmol/L pH 4.5 柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液溶解定容至 250 mL，配成1.0308 mmol/L 的 ABTS 母液；再取48.5mL 的ABTS 母液，用 0.2 mmol/L pH 4.5 柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液定容至 100 mL。2 试验方法漆酶活性的测定方法： 从三角瓶中取出适量酶液，离心取上清得到粗酶液，放于样品管中。空白管参加 1ml 液体的 PDA 培育基。 每支离心管中参加 5 倍的柠檬酸柠檬酸钠溶液稀释。 将样品管，空白管，0.5mmol/LABTS 放在恒温水浴锅中，30预热 10min。 参加 2mL 预热好的酶液和 0.5mmol/LABTS

5、 溶液到达 3mL 的反响液，于 1cm 比色皿中，启动反响 5 分钟，测定 420nm 下吸光值随时间的变化值，每分钟读一次数。在上述条件下，取吸光值变化的线性局部，定义每分钟转化 1umol 的底物所需的酶量为一个酶活力单位，用 U/mL 表示。运用以下公式计算酶活。DOD V漆酶酶活力 U/mL =Dt V21 酶液稀释倍数 e 10-6式中： e -ABTS 在 420nm 下吸光系数，为3.6 104 M -1 cm -1 ；Dt1min；DOD -1min 内，吸光度 OD 的变化值；V1酶反响中，反响液的总体积，3mL； V2酶反响中，酶液的体积，2mL。试验二 高产漆酶菌株的酶

6、学特性1 主要试剂的配制1 0.2 mmol/L pH2.08.0 的柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液A 液和 B 液混合，搅匀，于pH 计上分别调整至 pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。20.10.5 mmol/L 的 ABTS 溶液将一片 ABTS 片剂142 mg/片用 0.2 mmol/L pH 4.5 柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液溶解定容至 250 mL，配成1.0308 mmol/L 的 ABTS 母液；再取48.5mL 的ABTS 母液，用 0.2 mmol/L pH 4.5 柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液分别配制 100 mL 的 0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、

7、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L 的 ABTS。2 方法2.1 米氏常数Km 值的测定在 pH3.5 的条件下，配制 0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L 不同 ABTS 底物浓度，30 反响，测定漆酶反响的初速度，求出二者的倒数，以 1/V 对 1/S作图，依据双倒数法LineweaveBurk 法作图，得到斜率为 Km/V 的直线，由此得到米氏常数 Km 值。2.2 漆酶的最适反响 pH 和 pH 稳定性测定将漆酶分别参加到 pH 2.0pH 8.0 缓冲液中，在 30 下，测定漆酶活性

8、， 检测漆酶的最适反响 pH。另外，将漆酶分别参加 pH 2.0pH 8.0 缓冲液中，放置 1h 后，在30 ，最适反响pH 条件下，测定漆酶活性，以开头时漆酶活力为比照，计算漆酶的相对活力，得出漆酶的 pH 稳定性。2.3 漆酶的最适反响温度和热稳定性测定在漆酶最适反响 pH 条件下，分别在不同温度20 80 下，测定漆酶活性，得出漆酶的最适反响温度。将漆酶在 pH 3.5 环境中，分别在不同温度20 80 下保温 1 h，在最适反响温度、最适反响pH 条件下测定漆酶活性，以保温前漆酶活力为比照，计算漆酶的相对活力，得出漆酶的热稳定性。2.4 外表活性剂对漆酶活性的影响将漆酶置于含有 1

9、mmol/L 外表活性剂Tris、 EDTA、 Tween80，pH 8.0缓冲液中，测定漆酶活性，以不添加外表活性剂漆酶活力为比照，计算漆酶的相对活力，测定外表活性剂对漆酶活性的影响。试验三 漆酶的固定化一、试验原理壳聚糖是一种生物相溶性好、可生物降解、无毒易得的自然功能高分子材料， 被广泛用来作为固定化酶的载体。壳聚糖分子中 D葡胺糖的-NH2 可与双功能试剂戊二醛的一个-CHO 缩合，戊二醛的另一个-CHO 与酶的游离氨基缩合，从而壳聚糖戊二醛酶构造，即固定化酶。本试验承受以戊二醛为双功能试剂的载体交联法固定化漆酶。二、材料、试剂和仪器1. 材料：壳聚糖，漆酶2. 试剂：1的冰醋酸溶液、

10、甲醛37、1mol/L NaOH、0.8的戊二醛用磷酸缓冲液配制、0.1 mol/L 磷酸缓冲液pH 7.2、2 mol/L NaOH1%冰醋酸溶液；2mol/L 的 NaOH 溶液37%的甲醛溶液；0.1mol/L pH7.2 的磷酸缓冲液；0.8 %的戊二醛溶液；0.1mol/L pH7.5 的PBS 磷酸缓冲液内含0.5mol/L的 NaCL 0.1mol/L 的磷酸缓冲液pH7.2：Na HPO 12HO，25.79g；NaH PO 12H O，2424.37g，用蒸馏水溶解并定容至 1000ml。242 0.1mol/L 的 PBS 磷酸缓冲液pH7.5：Na2HPO412H2O，3

11、0.08g；NaH2PO4 12H2O，4.37g，NaCL，29.22g 用蒸馏水溶解并定容至 1000ml。 0.8%的戊二醛溶液：将 25%的戊二醛用磷酸缓冲液配制而成，现配现用。三、试验步骤1. 壳聚糖凝胶颗粒的制备称取 0.5g 壳聚糖充分溶解于 35mL1的冰醋酸溶液中，参加 3mL 甲醛37快速混匀，在40水浴中静置保温 60min，得到透亮的凝胶，加少量蒸馏水将凝胶挤压裂开，倒出并在研钵中进一步裂开成适当大小的凝胶颗粒，接着在烧杯中使其悬浮于 100mL 蒸馏水中，不断地用 2 mol/L 的 NaOH 将悬浮液的pH 值调至 8.0，放置 10min，然后用蒸馏水在抽滤漏斗上

12、洗涤凝胶颗粒数次，抽去多余水分，备用。2. 壳聚糖凝胶颗粒的活化取上述凝胶颗粒 10g，参加 40mL 0.8的戊二醛，室温放置 60min，用 0.1 mol/L 磷酸缓冲液pH 7.2洗涤凝胶颗粒34 次，以除去多余的戊二醛，抽滤备用。3. 酶的固定化向上述的凝胶颗粒中参加 15mL 漆酶酶液，4下放置 1h，中间搅动数次， 而后用 0.1 mol/L 磷酸缓冲液pH 7.2洗涤凝胶颗粒 34 次，以除去未固定的酶，即得固定化酶。4. 酶活力的测定（1） 溶液酶活力的测定（2） 残留酶活力的测定（3） 固定化酶活力的测定四、数据处理及计算固定化酶总活力数活力回收100 溶液酶总活力数固定化

13、酶总活力数相对活力100溶液酶总活力数残留酶活力数试验四 漆酶及固定化漆酶的应用一、漆酶对染料及果汁内酚类物质的降解溴甲酚绿二、染料最大吸取波长确实定将溴甲酚绿用 pH 4.5 的柠檬酸缓冲液溶解，于 UV2450 紫外可见分光光度计在 200 nm800 nm 范围内进展扫描，确定溴甲酚绿的最大吸取波长max。三、染料脱色率确实定将溴甲酚绿用 pH 4.5 的柠檬酸缓冲液溶解，参加肯定量的漆酶液，反响一段时间后，于最大吸取波特长测定吸光值。依据以下公式计算染料的脱色率，比较不同脱色条件对染料酶解的影响。染料脱色率 R(%)=A A0 A 11000其中：A0 为染料在最大吸取波特长的吸光值。A1 为反响体系参加漆酶以后在最大吸取波特长的吸光值。