米氏常数测定优秀PPT.ppt

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1、试验十六试验十六底物浓度对酶促反应速度的底物浓度对酶促反应速度的影响影响米氏常数米氏常数的测定的测定目的要求目的要求（1）了解底物浓度对酶促反应）了解底物浓度对酶促反应的影响。的影响。（2）驾驭测定米氏常数）驾驭测定米氏常数Km的的原理和方法原理和方法试验原理 Km定义：Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度。Km的意义 Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同。Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲和力大。测定Km值是酶学探讨的一个重要方法。米氏方程：VS v=Km+S v :反应初速度 （

2、微摩尔浓度变更/min)V:最大反应速度（微摩尔浓度变更/min)S：底物浓度 （mol/L)Km:米氏常数 （mol/L)此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底物浓度 之间的定量关系。双倒数作图法测定Km值：1 Km 1 1 v V S V 胰蛋白酶的性质胰蛋白酶的性质 胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解，产生自由氨基端。氨基的测定氨基的测定 甲醛滴定法甲醛滴定法CH2NH2 HCHOCOO-CH2NHCH2OH HCHOCOO-CH2NH(CH2OH)2 COO-试剂和器材试剂和器材1.1040g/L酪蛋白溶液（pH8.5）：四种不同S的酪

3、蛋白标准溶液。2.中性甲醛溶液：75mL分析纯甲 醛加15mL 0.25%酚酞乙醇溶液，以0.1M NaOH滴至微红，密闭于 玻璃瓶中。（自己配制）3.0.25%酚酞乙醇溶液：4.标准0.1M NaOH溶液。5.胰蛋白酶溶液（已配好）试剂试剂器材器材：碱式滴定管1取取50mL三三角角瓶瓶4个个，加加入入5mL甲甲醛醛与与1滴滴酚酚酞酞，以以0.1M标标准准NaOH滴滴定定至至微微红红色色，4个个瓶瓶颜颜色色应应当当一一样样，编编号。号。2量量取取40g/L酪酪蛋蛋白白50mL，加加入入一一150mL三三角角瓶瓶，37保保温温10分分钟钟，同同时时胰胰蛋蛋白白酶酶液液也也在在37保保温温10分分

4、钟钟，然然后后吸吸取取5mL酶酶液液加加到到酪酪蛋蛋白白液液中中。（同同时时计计时时！）充充分分混混合合后后马马上上取取出出10mL反反应应液液（定定为为0时时样样品品）加加入入一一含含甲甲醛醛的的小小三三角角瓶瓶中中（1号号）加加10滴滴酚酚酞酞；以以0.1MNaOH滴滴定定至至微微弱弱而而持持续续的的微微红红色色。在在接接近近终终点点时时，按按耗耗去去的的NaOHmL数数，每每mL加加一一滴滴酚酚酞酞，再再接接着着滴滴至至终终点点，登登记记耗去的耗去的0.1M标准标准NaOHmL数。数。操作方法操作方法 3 3在在2 2分钟、分钟、4 4分钟、分钟、6 6分钟时，分别取出分钟时，分别取出1

5、0mL10mL反应反应 液，加入液，加入2 2号、号、3 3号、号、4 4号小三角瓶，同上操作，登记耗号小三角瓶，同上操作，登记耗 去去NaOH mLNaOH mL数。数。以滴定度（即耗去的以滴定度（即耗去的NaOH mLNaOH mL数）对时间作图，数）对时间作图，得始终线，其斜率即初速度为得始终线，其斜率即初速度为V40V40（相对于（相对于40g/L40g/L 的酪蛋白浓度）。的酪蛋白浓度）。然后分别量取然后分别量取30g/L30g/L、20g/L20g/L、10g/L10g/L的酪蛋白溶的酪蛋白溶 液，重复上述操作，分别测出液，重复上述操作，分别测出V30V30、V20V20、V10V

6、10。利用上述结果，以利用上述结果，以1/v1/v对对1/s1/s作图，即求出作图，即求出V V与与 Km Km值。值。（1 1）试验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，）试验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度渐渐下降。缘由有多种，随着反应时间的延长，酶促反应速度渐渐下降。缘由有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应的进行，酶在确定逆反应的进行，酶在确定pHpH及温度下部分失活等。因此，探及温度下部分失活等。因此，探讨酶的活力以酶促反应的初速度为准。讨酶的活力以酶促反应的

7、初速度为准。（2 2）本试验是一个定量测定方法，为获得精确的试验结）本试验是一个定量测定方法，为获得精确的试验结果，应尽量削减试验操作中带来的误差。因此配制各种底物果，应尽量削减试验操作中带来的误差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的精确性。各溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的精确性。各种试剂的加量也应精确，并严格限制精确的酶促反应时间。种试剂的加量也应精确，并严格限制精确的酶促反应时间。留意事项留意事项思索题思索题试述底物浓度对酶促反应速度的影响。试述底物浓度对酶促反应速度的影响。试述在何种条件下，测定酶的试述在何种条件下，测定酶的Km值可以作为鉴定酶值可以作为鉴定酶的一种手段。的一种手段。米氏方程中的米氏方程中的Km值的实际应用是什么？值的实际应用是什么？本试验中的留意事项是什么？本试验中的留意事项是什么？