酶组织化学-刘学光资料优秀PPT.ppt

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1、酶组织化学酶组织化学刘学光刘学光复旦高校基础医学院病理学系复旦高校基础医学院病理学系glxg69shmu.edu 酶是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质酶是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质 一般催化剂的共性：一般催化剂的共性：1.1.用量少而催化效率高用量少而催化效率高 2.2.不改变更学反应的平衡点不改变更学反应的平衡点 3.3.可降低反应的活化能可降低反应的活化能 作为生物催化剂的特性：作为生物催化剂的特性：1.1.催化效率高：催化效率高：比其他催化反应高比其他催化反应高107-1013107-1013倍倍 2.2.高度专一性高度专一性 3.3.易失活易失活 4.4.酶活力受调整限制酶活力受

2、调整限制 5.5.酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关 酶的分类、命名酶的分类、命名1.1.习惯命名法：底物，所催化的反应性质，来源，其他特点习惯命名法：底物，所催化的反应性质，来源，其他特点2.2.国际系统命名法：酶的底物国际系统命名法：酶的底物+催化反应的性质催化反应的性质3.3.主要分类：催化反应的性质，六个大类主要分类：催化反应的性质，六个大类（1 1）氧化还原酶）氧化还原酶:氧化还原反应氧化还原反应（2 2）移换酶：功能基团的转移反应）移换酶：功能基团的转移反应（3 3）水解酶：水解反应）水解酶：水解反应（4 4）裂合酶：从底物上移去一个基团而

3、形成双键，或其逆反应）裂合酶：从底物上移去一个基团而形成双键，或其逆反应（5 5）异构酶：同分异构体的相互转变）异构酶：同分异构体的相互转变（6 6）合成酶：连接酶）合成酶：连接酶 催化一切必需与催化一切必需与ATPATP分解相偶联且由两种物质（双分子）合成一种物质的反应分解相偶联且由两种物质（双分子）合成一种物质的反应酶组织化学酶组织化学(Enzyme Histochemistry)通通过过细细胞胞内内固固有有的的酶酶催催化化底底物物的的作作用用，并并借借助助显显色色反反应应，在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及定位在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及定位。特点特点 （1

4、）原位检测）原位检测：组织定位组织定位 （2）显示显示酶活性酶活性 发展历史发展历史 Klebs(1868)Klebs(1868)年年&Struve(1872)&Struve(1872)证证明明中中性性多多核核白白细细胞胞过过氧化酶存在氧化酶存在19391939年前，探讨细胞内的氧化反应年前，探讨细胞内的氧化反应19391939年年，TakamatsuTakamatsu、Gomori Gomori 碱碱性性磷磷酸酸酶酶（硫硫化化钴钴反反应应 、银反应）、银反应）随后：磷酰胺酶、随后：磷酰胺酶、ATP ATP酶、酶、脂酶、酯酶等脂酶、酯酶等 金金属属盐盐法法，硫硫化化钴钴法法，偶偶氮氮色色素素法

5、法，偶偶氮氮色色素素四唑盐法，磷酸化酶组织化学证明法四唑盐法，磷酸化酶组织化学证明法 电镜酶组织化学：酶更精准的定位电镜酶组织化学：酶更精准的定位 1955 1955年年 Scheldon Scheldon、Brandes Brandes 金属沉淀法金属沉淀法 1967 1967年年 Seligman Seligman 锇黑化法锇黑化法 免疫组织化学：抗原抗体反应免疫组织化学：抗原抗体反应+酶反应酶反应 1970 1970年年 Sternberger Sternberger 酶标抗体法酶标抗体法 基础学问基础学问（一）细胞内的酶的特性（一）细胞内的酶的特性 *水水溶溶性性，易易扩扩散散，难难溶

6、溶或或不不溶溶于于有机溶剂有机溶剂 *有有机机溶溶剂剂不不同同程程度度降降低低酶酶的的活活性性 *易受温度影响，对热耐受性弱易受温度影响，对热耐受性弱 *对干燥耐受性强对干燥耐受性强（二）酶的定位（二）酶的定位 在细胞内或超微结构中存在于特定部位在细胞内或超微结构中存在于特定部位 浆膜浆膜 5-核苷酸酶核苷酸酶 细胞膜细胞膜 ATPase 线粒体线粒体 1.酶酶促促反反应应 细细胞胞内内的的酶酶催催化化分分解解合合适适的的底底物物，生生成成中中间间产产物，即：初反应物物，即：初反应物(primary reaction product,PRP)。2.显显色色反反应应 其其中中之之一一再再与与协协

7、助助物物经经一一步步或或二二步步反反应应，生生成成有有色色不不溶溶水水的的终终反反应应物物(final reaction product,FRP)沉沉积积在原位以显示酶的存在和活性大小。在原位以显示酶的存在和活性大小。酶组织化学的基本原理酶组织化学的基本原理Artifact PRP弥散弥散 定位不精确定位不精确 受受3个因素影响：个因素影响：1.底物在酶催化下水解的速度底物在酶催化下水解的速度 快快 2.PRP在缓冲液中的弥散系数在缓冲液中的弥散系数 小小 3.PRP与协助物反应的速度与协助物反应的速度 快快 协助物浓度一般协助物浓度一般1 mg/ml 一般原则一般原则 最最大大限限度度保保存

8、存酶酶活活性性、防防止止弥弥散散、保保证证反反应应产物的特异性产物的特异性 1.标本处理及制片不能影响酶活性和分布标本处理及制片不能影响酶活性和分布 2.底底物物对对酶酶有有特特异异性性：酶酶抑抑制制剂剂/激激烈烈剂剂检检测测特异性特异性 3.底物和协助试剂渗透好：快速，同步底物和协助试剂渗透好：快速，同步 4.协协助助试试剂剂不不能能影影响响酶酶活活性性和和其其它它反反应应剂剂的的渗透渗透 5.PRP与协助试剂反应要快与协助试剂反应要快 FRP必需是水不溶、有色且稳定的物质必需是水不溶、有色且稳定的物质 6.全全部部试试剂剂不不能能与与组组织织细细胞胞有有非非特特异异性性的的吸吸附附主要步骤

9、1.组织处理：不固定（冷冻切片，簇新）组织处理：不固定（冷冻切片，簇新）固固 定（特殊固定剂，低温包埋）定（特殊固定剂，低温包埋）2.孵育孵育3.显色显色4.显微镜下视察显微镜下视察各步骤须要留意的问题：各步骤须要留意的问题：1.组织处理：组织处理：“最大限度保存酶活性最大限度保存酶活性”最常用：簇新组织，快速冷冻，冰冻切片最常用：簇新组织，快速冷冻，冰冻切片 长期保存需密封，长期保存需密封，-70 丙酮固定，低温脱水、包埋（丙酮固定，低温脱水、包埋（eg.-谷氨酰转肽酶）谷氨酰转肽酶）常规方法（极少数酶类：氯乙酸酯酶）常规方法（极少数酶类：氯乙酸酯酶）染色前的预固定染色前的预固定 保持组织良

10、好形态保持组织良好形态 丙酮丙酮:氯仿氯仿=1:1 4oC，510 分钟分钟 多聚甲醛，甲醛，戊二醛多聚甲醛，甲醛，戊二醛 Note:含有抑制酶活性含有抑制酶活性/细胞化学成分活性的重金属盐细胞化学成分活性的重金属盐Hg/Cr/Pb等等 不用做固定剂不用做固定剂 固定方法：浸泡固定固定方法：浸泡固定 灌流固定灌流固定 细胞涂片、培育细胞细胞涂片、培育细胞:干燥、密封、低温干燥、密封、低温2.2.切片制作切片制作:一般一般8 812m 12m 3.3.缓冲液：缓冲液：用于配置固定液，漂洗液，酶反应孵育液用于配置固定液，漂洗液，酶反应孵育液 配制酶反应孵育液配制酶反应孵育液 （1 1）清洗器皿，过

11、酸冲洗）清洗器皿，过酸冲洗 （2 2）现用现配，保持簇新）现用现配，保持簇新 （3)3)严格配比，保持平和严格配比，保持平和 （4 4）防止污染）防止污染 过滤为佳过滤为佳 （5 5）优选试剂，留意纯度）优选试剂，留意纯度4.4.孵育反应孵育反应 a.a.温度刚好间：温度刚好间：37oC37oC，15-30min15-30min b.b.孵育反应：切片孵育；漂移孵育孵育反应：切片孵育；漂移孵育 5.5.酶显示方法酶显示方法 （1 1）同步显示法）同步显示法 （2 2）二步显示法（孵育后偶联法）二步显示法（孵育后偶联法）（3 3）底物自身显示法）底物自身显示法6.6.酶特异性比照试验用酶活性抑制

12、剂用酶活性抑制剂激活剂激活剂接受无底物的孵育液接受无底物的孵育液过固定或加热过固定或加热变更孵育液变更孵育液选择选择PHPH值值细胞内的定位差异细胞内的定位差异对结果分析要考虑的问题经冷冻和原位固定后，酶原委能保存多少经冷冻和原位固定后，酶原委能保存多少?酶是否在原位酶是否在原位?反应酶起了多少作用？反应酶起了多少作用？酶的活性是否代表了细胞生活时的状态酶的活性是否代表了细胞生活时的状态?沉沉淀淀的的产产物物是是否否代代表表酶酶本本身身，时时间间延延长长是是否否会会有有变变更，有没有扩散移位？更，有没有扩散移位？常用酶显示方法常用酶显示方法 （1）同步显示法：）同步显示法：PRP+协助物协助物

13、 有色有色FRP 某某些些金金属属本本身身或或化化合合物物生生成成颜颜色色（eg.金金属属离离子子沉沉淀反应）淀反应）硫化钴（黑色）硫化钴（黑色）硫化铅（棕黑色）硫化铅（棕黑色）（2）二步显示法（孵育后偶联法）二步显示法（孵育后偶联法）酶酶与与底底物物作作用用产产生生的的PRP沉沉积积于于原原位位，随随后后行行显显色色反应反应 适用于：适用于：PH反应差别大；底物反应差别大；底物/协助物易分解协助物易分解 局局 限：要求限：要求PRP弥散度低弥散度低（3）底物自身显示法）底物自身显示法 可溶有色底物可溶有色底物 不溶有色底物不溶有色底物 底物分子重组底物分子重组(1)金属离子沉积法金属离子沉积

14、法 酸性磷酸酶酸性磷酸酶 Gomori反应（反应（1941年）年）以以beta-甘甘油油磷磷酸酸钠钠为为底底物物，在在酸酸性性PH值值(4.4-5.5)下下，被被酸酸性性磷磷酸酸酶酶（ACP）水水解解，释释放放出出磷磷酸酸盐盐。遇遇铅铅离离子子（硝硝酸酸铅铅/醋醋酸酸铅铅）生生成成磷磷酸酸铅铅(PRP)，再再被被S2-置置换换，最最终终生生成成硫硫化化铅棕黑色沉淀。铅棕黑色沉淀。酶促反应酶促反应 R-PO4Na2+H20 R-OH+Pb3(PO4)2 显色反应显色反应 Pb3(PO4)2 +3 S2-3PbS （棕棕黑黑色色沉沉淀）淀）该该方方法法金金属属离离子子简简洁洁反反应应，镇镇静静颗颗

15、粒粒微微细细，反反应应色色调调美美丽，反差明显丽，反差明显。ACPPb 2+激活剂：激活剂：Mn2+抑制剂：抑制剂：NaF定定 位：溶酶体，位：溶酶体，ER，胞浆胞浆该酶活性比较高的器官：肝、肾、肠、脾、肾上腺该酶活性比较高的器官：肝、肾、肠、脾、肾上腺留意事项留意事项:铅离子铅离子 浓度是关键：非特异性吸附，浓度是关键：非特异性吸附，NaF处理解除假阳性处理解除假阳性孵育时间不宜过长：弥散，核非特异着色孵育时间不宜过长：弥散，核非特异着色铅法适用于铅法适用于:ACP；5-核苷酸酶；核苷酸酶；G6P酶；膜酶；膜ATPase；线粒体线粒体ATPase；TTPase(硫氨酸焦磷酸酶）硫氨酸焦磷酸酶

16、）（2 2）偶氮盐偶联反应）偶氮盐偶联反应 人人工工合合成成的的酶酶底底物物在在酶酶的的作作用用下下产产生生PRP，后后者者与与重重氮氮盐盐结合，引起偶联偶氮反应，使其生成不溶性的偶氮色素结合，引起偶联偶氮反应，使其生成不溶性的偶氮色素 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 a-萘基磷酸钠萘基磷酸钠 磷酸氢二钠磷酸氢二钠+a-萘酚萘酚 -萘酚萘酚+Fast Blue 偶氮染料偶氮染料 （蓝色沉淀）（蓝色沉淀）酯酶、转肽酶、肽酶酯酶、转肽酶、肽酶酶酶+水水重重氮氮盐盐种种类类不不同同，其其偶偶氮氮颜颜色色多多样样（蓝蓝色色，紫紫色色，红红色色，褐色等）褐色等）常常用用重重氮氮盐盐:坚坚牢牢兰兰RR 坚坚牢牢兰兰

17、B 坚坚牢牢兰兰RC 坚坚牢牢兰兰TR 坚坚牢兰牢兰B 六偶氮副品红六偶氮副品红 六偶氮新品红六偶氮新品红常用底物：萘酚常用底物：萘酚AS-B1 萘酚萘酚AS-D 萘酚萘酚AS-MX 萘酚萘酚AS-TR应应用用：ALPase,ACPase 酯酯酶酶，转转肽肽酶酶，肽肽酶酶，beta-葡葡糖糖苷酶苷酶方法：同时偶联法方法：同时偶联法 后偶联法：防止重氮盐对酶的抑制作用后偶联法：防止重氮盐对酶的抑制作用(3)四唑反应四唑反应 底物底物 氢离子氢离子 与无色四唑盐结合与无色四唑盐结合常用四唑盐种类常用四唑盐种类:三苯四唑氯化物三苯四唑氯化物 TTC 蓝四唑盐蓝四唑盐 BT 新四唑盐新四唑盐 NT 硝

18、基兰四唑盐硝基兰四唑盐(nitroblue tetrazolium,NBT)四硝基兰四唑四硝基兰四唑TNBT 噻唑兰噻唑兰(3(4,5-dimethyl thiazolyl-2YL)2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)红色红色/蓝色沉淀蓝色沉淀 脱氢酶脱氢酶/氧化酶氧化酶被还原被还原单单胺胺氧氧化化酶酶和和几几乎乎全全部部的的脱脱氢氢酶酶都都可可以以用用四四唑唑反反应显示应显示 例：四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶例：四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶 以以琥琥珀珀酸酸（钠钠盐盐）为为底底物物，在在酶酶的的作作用用下下脱脱氢氢，人人工工合合成成的的硝硝基基蓝蓝四四唑唑（NBT

19、NBT）为为受受氢氢体体，还还原为紫色不溶物以代表琥珀酸脱氢酶的活性原为紫色不溶物以代表琥珀酸脱氢酶的活性 琥琥珀珀酸酸脱脱氢氢酶酶是是线线粒粒体体的的标标记记酶酶之之一一，存存在在于于全全部部有有氧氧呼呼吸吸的的细细胞胞，以以心心肌肌、肾肾曲曲管管上上皮皮、肝细胞含量最丰富肝细胞含量最丰富(4)联苯胺色素法联苯胺色素法过氧化物酶过氧化物酶（联苯胺法）（联苯胺法）NH2NH2酶酶+H2O2NHNH棕色沉淀棕色沉淀2H联苯胺联苯胺蓝 过氧化物酶过氧化物酶催化各种物质被过氧化氢所氧化见于乳腺、甲状腺、唾液腺、肥大细胞等髓过氧化物酶见于中性/嗜酸性白细胞及其前体细胞，对造血系统疾病的鉴别诊断极为重要

20、辣根过氧化物酶（HRP）作为大分子示踪剂 DAB 3-二氨基联苯胺(5)靛蓝反应靛蓝反应 底底物物被被酶酶分分解解为为二二个个PRP，其其中中之之一一可可在在确确定定条件下形成不溶的靛蓝条件下形成不溶的靛蓝 酯酶酯酶 吲哚酚酯吲哚酚酯 吲哚酚吲哚酚 +RCOOH 2 吲哚酚吲哚酚 靛蓝靛蓝 胆硷酯酶、磷酸酶、糖苷酶、非特异酯酶胆硷酯酶、磷酸酶、糖苷酶、非特异酯酶 酶酶+水水氧化氧化酶组织化学的应用了解组织、细胞的代谢活动了解组织、细胞的代谢活动细胞类型的推断细胞类型的推断了解细胞定位了解细胞定位用于肿瘤的探讨用于肿瘤的探讨用于免疫组化和杂交组化的显示手段用于免疫组化和杂交组化的显示手段（1）视

21、察组织细胞代谢）视察组织细胞代谢心肌梗死心肌梗死2小时小时 琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶 细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶 HE无变更无变更 异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶 磷酸化酶磷酸化酶Reyes Syndrome又又称称脑脑病病脂脂肪肪肝肝综综合合征征，是是一一种种急急性性脑脑病病和和肝肝脏脏脂脂肪肪浸浸润润综综合合征征,常常常常发发生生于于某某些些急急性性病病毒毒性性传传染染病病以以后后，多多见见于于儿儿童童，临临床床表表现现为为：急急性性致致死死性性脑脑病病、脂脂肪肪肝肝、肝功能衰竭，高血氨肝功能衰竭，高血氨 肝细胞琥珀酸脱氢酶活性下降肝细胞琥珀酸脱氢酶活性下降（2）细胞类型）细胞类型/细胞定

22、位细胞定位 氯乙酸酯酶氯乙酸酯酶 中性粒细胞中性粒细胞 （被抗（被抗CD66C,CD66D,CD88抗体的免疫组化代替）抗体的免疫组化代替）非特异性酯酶非特异性酯酶 Mf f （被抗（被抗CD64、CD68抗体的免疫组化代替）抗体的免疫组化代替）乙酰胆硷酯酶乙酰胆硷酯酶 小肠小肠 神经节细胞神经节细胞 ATP ATP酶酶 皮肤皮肤 郎罕氏细胞郎罕氏细胞（3）癌前病变的标记）癌前病变的标记 以肝癌发生为例以肝癌发生为例 早期，早期，HE无明显变更，但酶组织化学视察到无明显变更，但酶组织化学视察到 糖代谢紊乱糖代谢紊乱肝细胞癌肝细胞癌增生结节增生结节GGTAFPG6P小肝细胞小肝细胞过渡细胞过渡细

23、胞卵圆细胞卵圆细胞肝细胞肝细胞嗜碱嗜酸（4）免疫组化和杂交组化的显示方法）免疫组化和杂交组化的显示方法 与酶组化的不同，在于是检测引入酶与酶组化的不同，在于是检测引入酶 免疫组化常用免疫组化常用HRP（DAB+H2O2）杂交组化常用杂交组化常用AP （BCIP+NBT）驾驭内容酶组织化学的基本原理酶组织化学的基本原理光镜酶组织化学的基本方法光镜酶组织化学的基本方法几种重要的酶组织化学方法几种重要的酶组织化学方法Thanks for your attentions!人有了学问，就会具备各种分析实力，明辨是非的实力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富学问，培育逻辑思维实力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培育文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的学问面。有很多书籍还能培育我们的道德情操，给我们巨大的精神力气，鼓舞我们前进。