菌种传代与保藏研究优秀PPT.ppt

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1、菌种的传代与保藏菌种的传代与保藏内蒙自治区药品检验所内蒙自治区药品检验所 菌种是从事微生物学及生命科学探讨的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性探讨，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种.微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种保藏是一项重要的基础工作，是微生物学基础工作的一项重要内容，也是药品微生物工作中的一项常用技术。一、菌种保藏的意义一、菌种保藏的意义 如药品中的限制菌检查运用的阳性比照菌须如药品中的限制菌检查运用的阳性比照菌须防止因多次传代而使阳性比照菌的典型生物学特防止因多次传代而使阳性比照菌的典型生物学特征发生变更及菌株

2、的死亡，保证达到菌种长期正征发生变更及菌株的死亡，保证达到菌种长期正确的形态；确的形态；如药品微生物学检验过程中，检出的可疑致病菌须妥当保藏，以达到进一步鉴定的目的，保证用药平安。二、菌种代号的意义二、菌种代号的意义l国内药品微生物检验所用的菌种代号是国内药品微生物检验所用的菌种代号是lCMCC（F）或）或CMCC（B）lCMCC中国医学菌种保藏中心中国医学菌种保藏中心lB代表细菌，代表细菌，F代表真菌。代表真菌。l大肠杆菌大肠杆菌CMCC(B)44102l乙型副伤寒沙门杆菌乙型副伤寒沙门杆菌CMCC(B)50094l铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌CMCC(B)10104l金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球

3、菌 CMCC(B)26003l生孢梭菌生孢梭菌CMCC(B)64941l白色念珠菌白色念珠菌CMCC(F)98001三、常用菌种保藏方法三、常用菌种保藏方法(一一)菌种保藏的原理菌种保藏的原理依据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创建的依据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创建的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率。低温、干燥、缺于死亡，以减低菌种的变异率。低温、干燥、缺氧、缺乏养分等环境条件都有抑制微生物的代谢氧、缺乏养分等环境条件都有

4、抑制微生物的代谢作用。作用。低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。选择保藏方法时，首先应考虑方法能否长期地保持菌种原有的特性，同时也应兼顾到方法的经济和简便。在实际工作中，往往多种条件同时运用,以提高保藏效果。（二）菌种保藏步骤 选择特征典型的纯菌菌落；确定保藏的合适菌体形态；选择最适宜的保藏方法；定期对保藏菌种进行检查，视察是否发生变更，若有变更，须变更保藏方法。保藏期满应刚好进行移种。1.1.琼脂斜面低温保存法琼脂斜面低温保存法 l（1 1）方法：将常常运用的菌种的典型菌落接）方法：将常常运用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培育

5、基）上，种在斜面（某些特殊菌种可用液体培育基）上，按规定的温度和时间培育，待充分生长后，把按规定的温度和时间培育，待充分生长后，把培育好的簇新菌种用牛皮纸保好，为减缓培育培育好的簇新菌种用牛皮纸保好，为减缓培育基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在管的棉花塞换成橡胶塞。放在44左右的冰箱左右的冰箱中保藏。每隔中保藏。每隔 23 23个月移种一次，接着进行保个月移种一次，接着进行保藏。若用半固体高层培育基穿刺培育，一般可藏。若用半固体高层培育基穿刺培育，一般可保藏半年保藏半年 一年。有的甚至更长时间。一年。有的甚至更长时间。l（

6、2 2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。大肠杆菌斜面大肠杆菌斜面 金黄色葡萄球菌斜面金黄色葡萄球菌斜面 生孢梭菌生孢梭菌 白色念珠菌白色念珠菌需气菌、厌气菌培育基需气菌、厌气菌培育基 真菌培育基真菌培育基各类菌种保藏条件刚好间各类菌种保藏条件刚好间菌菌种种培培养养基基保存温保存温度度传传种种时时间间细细菌菌一一般般多多用用于于营营养养琼琼脂脂或或根根据据菌菌种种规规定定选选用用培养基培养基46芽芽孢孢杆杆菌菌36个个月月，其它细菌每个月其它细菌每个月酵母菌酵母菌一一般般用用麦麦芽芽汁汁琼琼脂脂或或麦芽汁酵母膏琼脂麦芽汁酵母膏琼脂46一般一般46个月个月丝状

7、真丝状真菌菌一般用PDA琼脂、蔡氏琼脂或麦芽汁琼脂等46每每4个个月月移移植植一一次次（每每2个月移植一次个月移植一次）（3）特点：）特点：优点是优点是简便，易于推广；一般不须简便，易于推广；一般不须要另选择保藏用培育基；对大多数微生物都要另选择保藏用培育基；对大多数微生物都适用。适用。缺点是缺点是保藏期太短；传代次数多，保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。易发生变异及污染。（4）留意事项：）留意事项：保保藏藏的的菌菌种种应应是是生生命命活活力力旺旺盛盛的的簇簇新新培培育育物物，至至少少应应是第三代的培育物。是第三代的培育物。保保藏藏时时，破破伤伤风风杆杆菌菌可可用用庖庖肉肉培培育育基基

8、；生生孢孢梭梭菌菌用用流流体硫乙醇酸盐培育基。体硫乙醇酸盐培育基。必必需需定定期期检检查查保保藏藏菌菌种种冰冰箱箱的的温温度度、湿湿度度以以及及菌菌种种管的棉塞是否松动或生霉，如有异样应刚好处理。管的棉塞是否松动或生霉，如有异样应刚好处理。每每次次移移植植后后，应应与与原原菌菌种种的的编编号号、名名称称逐逐一一核核对对，确证培育基特征和纯度无误后再接着保藏。确证培育基特征和纯度无误后再接着保藏。保保藏藏菌菌种种的的培培育育基基应应无无糖糖，其其他他菌菌类类含含糖糖小小于于2%为宜，以免产酸过多，影响菌种存活。为宜，以免产酸过多，影响菌种存活。铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌在在冰冰箱箱中中易易发发生生

9、菌菌体体自自溶溶而而死死亡亡，不不宜用本法保存。宜用本法保存。2、液体石蜡保存法：本法是用石蜡将培育物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。（1）方法：）方法：将菌种接种于斜面或穿刺于将菌种接种于斜面或穿刺于0.30.5%琼脂半固琼脂半固体高层培育基中，培育好备用。体高层培育基中，培育好备用。取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管1015ml，加棉塞，瓶口包上纸，加棉塞，瓶口包上纸，121高压灭菌高压灭菌30min，取出置，取出置37温箱或温箱或110170烤箱中烤箱中12h或干燥器内除去液体石蜡中的水分。或干燥器内除去液体

10、石蜡中的水分。l将将上上述述液液体体石石蜡蜡加加入入培培育育好好的的菌菌种种试试管管内内，液液体体石石蜡蜡液液面面以以高高出出培培育育基基最最上上端端1为为宜宜，将将试试管管直直立立，放入放入4冰箱中保藏。冰箱中保藏。l适适用用范范围围：适适用用于于保保藏藏部部分分霉霉菌菌，酵酵母母菌菌和和放放线线菌菌，对对细细菌菌保保藏效果较差。藏效果较差。液体石蜡对各类菌种保藏效果液体石蜡对各类菌种保藏效果菌菌种种菌株数菌株数保存时间保存时间（年）（年）存活率存活率（%）细菌细菌霉菌霉菌酵母菌酵母菌放线菌放线菌87586400380552420.983.688.991.3（3）特点：）特点：本方法简便易行

11、，是试验室常用的一种保藏方法，本方法简便易行，是试验室常用的一种保藏方法，该法主要使菌种与空气隔绝。该法主要使菌种与空气隔绝。（4）留意事项：）留意事项：保藏时，用簇新培育物接种，应检查纯度和特征保藏时，用簇新培育物接种，应检查纯度和特征后，方可进行保藏。后，方可进行保藏。保藏过程中，需常常视察斜面是否干燥，如干燥，保藏过程中，需常常视察斜面是否干燥，如干燥，需重新移种。需重新移种。运用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一运用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再用接种针挑取培育物接种到簇新斜面上培边，再用接种针挑取培育物接种到簇新斜面上培养，待长出新培育物后，再移种一次到新斜面上养，

12、待长出新培育物后，再移种一次到新斜面上即可运用。即可运用。将将沾沾有有少少量量液液体体石石蜡蜡的的接接种种针针浸浸于于95%酒酒精精中中片片刻刻，再再烧烧灼灼灭灭菌菌，以以免免干干脆脆在在酒酒精精灯灯下下烧烧灼灼时时，液液体体石石蜡蜡四四溅溅，引引起起污染。污染。液液体体石石蜡蜡在在菌菌种种管管中中高高出出培培育育基基的的高高度度要要严严格格限限制制，如如太太多多，会会影影响响菌菌种种交交换换气气体体，使使保保藏藏效效果果不不好好；如如太太少少，斜斜面面简简洁洁干干燥燥，将将缩缩短短保保藏藏期期。一一般般以以高高出出斜斜面面1为宜。为宜。制制备备无无菌菌液液体体石石蜡蜡时时，每每管管装装量量不

13、不能能太太多多，否否则则分分装装到到菌菌种种培培育育基基中中易易造造成成污染。污染。3、半固体琼脂培育基（、半固体琼脂培育基（0.5%）4、40%甘油保存法：甘油保存法：四、试验用菌种的培育传代方法四、试验用菌种的培育传代方法l程序：程序：l冻冻干干菌菌复复苏苏接接种种（斜斜面面）（菌种传代）（菌种传代）l（养分肉汤）（养分肉汤）l制制备备菌菌悬悬液液比比照照菌液菌液l检检定定用用标标准准菌菌种种，由由中中国国药药品品生生物物检检定定所供应，为冷冻干燥菌种。所供应，为冷冻干燥菌种。l菌菌种种的的复复苏苏与与保保存存在在专专用用无无菌菌室室或或超超净净工作台内进行。工作台内进行。1 菌种的复苏

14、把冻干菌种管、灭菌1ml 滴管、双碟、镊子、养分肉汤培育基、养分琼脂斜面数支，移入接种室或净化工作台。先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取养分肉汤培育基，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌滴管，在火焰旁吸取养分肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至养分琼脂斜面及一般肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的养分肉汤及养分琼脂斜面置35

15、37培育2224 h。取出培育物，细致视察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，呈典型菌落后，转种3 代即可应用。如发觉菌型不典型，可进行平板分别单菌落。2 菌种的传代与保存菌种的传代与保存 方法（1）：菌斜面 菌斜面（保存）培育基应簇新制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再运用。标签上著名菌名及接种日期。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠进火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，来回通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞

16、，将接种环伸人管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰旁。堵上棉塞，左手将菌种管放下，取养分琼脂斜面1支，照上述操作打开棉塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的低部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。取出接种棒，在火焰旁将培育基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。将已接种毕的细菌管置3537培育2224小时，霉菌管一般置2025霉菌培育箱内培育7日。取出后放人冰箱保存，一般 3个月转种一次。方法2：菌斜面 养分肉汤 分别平板 菌斜面 假如菌落形态不典型可纯化，按下列方法传代（分别菌落）：用

17、接种环取上述菌管（斜面）菌苔少许接种置养分肉汤中(5ml/支,已灭菌),置3537培育1824小时后，再用接种环取培育好的养分肉汤菌悬液（浓菌液），接种于分别平板，置3537培育1824小时，用接种针选典型菌落划线于养分琼脂斜面，置3537培育1824小时。一般同时接种几支管，其中一支用于以后菌种传代或接种到半固体琼脂培育基中，其它用做工作菌种。常用分别平板：常用分别平板：大肠埃希菌大肠埃希菌EMB琼脂平板琼脂平板铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌溴化十六烷三甲铵琼脂培育基溴化十六烷三甲铵琼脂培育基l金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌甘露醇氯化钠琼脂培育甘露醇氯化钠琼脂培育基基l沙门菌沙门菌SS琼脂平琼脂平板

18、板 3 菌悬液的制备菌悬液的制备l 取上述培育好的菌种斜面移入接种室或净化工作台，放置室温后,用接种环取菌苔少许接种置养分肉汤中(5ml/支,已灭菌),将已接种毕的细菌管置3537培育1824小时，取出备用。一般于冰箱中保存可用7天。4 比照用菌液制备l 取上述培育好的养分肉汤菌悬液（浓菌液）1ml，加到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液混匀，为10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1 ml加到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液混匀，为10-2 以此类推，稀释至含活菌数在 50 100 个。用平板计数。l 此稀释菌液用于试验后加阳性比照，可在1天内运用。菌种菌种菌种菌种工工作作菌菌种种培培养养基基菌

19、悬液菌悬液对照菌液对照菌液大肠杆菌大肠杆菌营养琼脂斜面营养琼脂斜面营养肉汤营养肉汤0.9%氯氯 化化 钠钠 溶溶液液沙门菌沙门菌营养琼脂斜面营养琼脂斜面营养肉汤营养肉汤0.9%氯氯 化化 钠钠 溶溶液液金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌营养琼脂斜面营养琼脂斜面营养肉汤营养肉汤0.9%氯氯 化化 钠钠 溶溶液液铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌营养琼脂斜面营养琼脂斜面营养肉汤营养肉汤0.9%氯氯 化化 钠钠 溶溶液液生孢梭菌生孢梭菌硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐培培养养基基硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐培培养养基基0.9%氯氯 化化 钠钠 溶溶液液白色念珠菌白色念珠菌真菌琼脂斜面真菌琼脂斜面真菌培养基真菌培养基0.9%氯氯 化化

20、钠钠 溶溶液液五、菌种保管五、菌种保管 菌种保管应有专人负责，保存与加锁的冰箱中或特制的白铁箱中加锁置阴暗处，确保菌种平安。因工作变动时，必需做好交接工作。菌种应有具体登记本，包括名称、分别日期、鉴定日期、鉴定者、主要鉴定性能，并留意记录运用、转移及销毁状况和缘由。各种菌种应按规定时间定期移种。一般每移种3次后作一次全面鉴定。留意菌种有无污染和变异，如发觉污染和变异时，应刚好更换。购置菌种，应有介绍信。全部保存菌种应具备清单，并定期向部门负责人报告。人有了学问，就会具备各种分析实力，明辨是非的实力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富学问，培育逻辑思维实力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培育文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的学问面。有很多书籍还能培育我们的道德情操，给我们巨大的精神力气，鼓舞我们前进。