PCR常见问题、原因分析及其对策.ppt

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1、PCRPCR常见问题、原因分析及其对策常见问题、原因分析及其对策北京天为时代科技有限公司北京天为时代科技有限公司主讲人：欧阳志荃主讲人：欧阳志荃PCR技术简介技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案常见问题、原因分析及其解决方案提高提高PCR反应特异性的策略反应特异性的策略主讲内容主讲内容PCR技术简介技术简介PCR标准反应体系标准反应体系DNA模板模板引物引物反应缓冲液反应缓冲液dNTPddH2O耐热聚合酶耐热聚合酶反应体系对反应体系对PCRPCR扩增的影响扩增的影响DNA模板模板纯度纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCRPCR反应反应完整性完整性 模板降解

2、会导致模板降解会导致PCRPCR扩增无产物扩增无产物浓度浓度 加量过多导致非特异性扩增增加加量过多导致非特异性扩增增加特异性特异性 长度适当长度适当、避免二级结构和二聚体避免二级结构和二聚体完整性完整性 避免反复冻融避免反复冻融浓度浓度 应适当应适当,过高导致非特异性增加过高导致非特异性增加,过低则过低则引引物物扩增产物太少扩增产物太少反应体系对反应体系对PCRPCR扩增的影响扩增的影响反应反应BufferBufferpH值值,盐离子浓度盐离子浓度稳定剂稳定剂,增强剂增强剂Mg2浓度浓度过高非特异性严重过高非特异性严重过低无扩增产物过低无扩增产物dNTPdNTPMixtureMixture浓度

3、适当浓度适当避免反复冻融避免反复冻融ddH2OpH值适当值适当避免污染避免污染PCR标准反应体系标准反应体系DNA模板模板引物引物反应缓冲液反应缓冲液Mg2dNTPddH2O耐热聚合酶耐热聚合酶如何选择如何选择最合适最合适的的DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶的特性聚合酶的特性PCR实验的不同需求实验的不同需求如何选择如何选择最合适最合适的的DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶的特性聚合酶的特性纯纯 度度稳定性稳定性酶活性酶活性如何选择如何选择最合适最合适的的DNA聚合酶聚合酶PCR实验的不同需求实验的不同需求长片段扩增长片段扩增PCR试剂盒试剂盒 扩增效率扩增效率 保保 真真 性性 特特 异异 性性

4、基因组扩增、RT-PCR 基因筛选、测序、基因克隆 复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）构建基因图谱、测序、分子遗传学 复杂模板扩增、大规模基因检测特异性特异性热启动热启动Taq酶酶原原 理理 蜡封蜡封 抗体抑制抗体抑制 化学修饰化学修饰特特 点点 避免非特异性扩增避免非特异性扩增 提高提高PCR反应的反应的特异性特异性用用 途途 基因组扩增基因组扩增 RT-PCR热启动热启动Taq酶酶特异性特异性产产品品类类型型产产品品名名称称产产品品性性能能化学修饰化学修饰天为时代天为时代:HotStartTaqRoche:FastStartTaqAbgene:Thermo-startDNAPolymer

5、aseStratagene:SureStartTaq大大提高大大提高PCRPCR反应的特异性反应的特异性 化学修饰不化学修饰不影响后续实验影响后续实验抗体抑制抗体抑制Invitrogen：AccuPrimeTMTaqPlatinumTaqTaKaRa：ExTaqTMHotStartVersion蜡封蜡封Promega：TaqBeadTMHotStart保真性保真性高保真酶高保真酶原原 理理用用 途途 35核酸核酸 表达基因的克表达基因的克隆隆基因的定点突基因的定点突变变 细胞内基因点细胞内基因点突变分析突变分析（SNPSNP）外切外切酶酶活性活性 降低碱基错配率降低碱基错配率 保真性保真性高保

6、真酶高保真酶产产品品类类型型生生物物公公司司性性能能比比较较PfuDNAPolymerase 天为时代天为时代StratagenePromega在目前已发现的所有在目前已发现的所有耐热聚合酶中耐热聚合酶中,PfuPfu保保真度最高碱基错配率真度最高碱基错配率最低最低PyrobestTMDNAPolymeraseTaKaRaTliDNAPolymerasePromega 高保真高保真 高扩增效率高扩增效率原原 理理 混合酶混合酶高扩增效率高扩增效率35核酸外切核酸外切用用 途途 超超长长片段扩增片段扩增 测序测序 构建基因图谱构建基因图谱 复杂模板扩增复杂模板扩增GC含量高含量高二级结构二级结构

7、 高保真高保真 高扩增效率高扩增效率特特 点点产产品品性性能能高扩增效率高扩增效率天为时代天为时代：TaqPlusTaKaRa：ExTaqTM 复杂模板扩增复杂模板扩增高保真高保真天为时代天为时代：TaqPlatinumInvitrogen：PfxPlatinumTaqHighFidelity保真度低于保真度低于PfuPfu聚合酶聚合酶但扩增效率较高但扩增效率较高 长片段扩增长片段扩增天为时代天为时代：LongTaqTaKaRa：LATaqInvitrogen：ElongaseAmplificaitonSystem 特别适用于保真度较特别适用于保真度较高的高的 超长片段扩增超长片段扩增PCRM

8、asterMix原原 理理预配好的预配好的PCR反应液反应液 DNA聚合酶聚合酶 反应缓冲液反应缓冲液 dNTPdNTPPCR增强剂增强剂 PCRMasterMix特特 点点 快速简便快速简便 减少加样误差和污染减少加样误差和污染 灵敏度高灵敏度高 可扩增低至可扩增低至2 2个拷贝的目的模板个拷贝的目的模板 特异性强特异性强 降低降低PCRPCR反应的要求，反应的要求，增强特异性增强特异性 稳定性好稳定性好 长期放置活性无改变长期放置活性无改变适用范围适用范围 大规模基因检测大规模基因检测 目的基因拷贝数极低的样本目的基因拷贝数极低的样本 GC含量高含量高,有二级结构的模板有二级结构的模板 复

9、杂基因组样本复杂基因组样本 可直接检测菌落，基因点突变检测可直接检测菌落，基因点突变检测,或者阳性克隆的筛选。或者阳性克隆的筛选。PCR技术简介技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案常见问题、原因分析及其解决方案提高提高PCR反应特异性的策略反应特异性的策略PCR常见问题、原因分析及其解决方案常见问题、原因分析及其解决方案PCR常见问题常见问题 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性PCR常见问题之一常见问题之一无扩增产物1.1.模板模板:含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低2.2.BufferBuffer对样品不合适对样品不合适3.3.引物设计不当或者发生降引物设计不当或者发生降解解4

10、.4.反应条件：反应条件：退火温度太高，延退火温度太高，延伸时间太短伸时间太短 原原因因对对策策1.1.纯化模板或者使用试剂盒提取纯化模板或者使用试剂盒提取模板模板DNADNA或或加大模板的用量加大模板的用量2.2.更换更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度3.3.重新设计引物（避免链间二聚重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一体和链内二级结构）或者换一管新引物管新引物4.4.降低退火温度、延长延伸时间降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无正对照有条带，而样品则无；PCR常见问题之二常见问题之二 非特异性扩增 现现象象：PCRPCR扩扩增增后后出出现现

11、的的条条带带与与预预计计的的大大小小不不一一致致，或或大大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。PCR常见问题之二常见问题之二1.1.引物特异性差引物特异性差2.2.模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高3.3.酶量过多酶量过多4.4.MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高5.5.退火温度偏低退火温度偏低6.6.循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策1.1.重新设计引物或者使用巢重新设计引物或者使用巢式式PCRPCR2.2.适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度3.3.适当减少酶量适当减少酶量4.4.降低镁离子浓度降低镁离子浓度5.5

12、.适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二阶段温度法二阶段温度法6.6.减少循环次数减少循环次数 非特异性扩增PCR常见问题之三常见问题之三 拖尾 现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态。M 1 2PCR常见问题之三常见问题之三1.1.模板不纯模板不纯2.2.BufferBuffer不合适不合适3.3.退火温度偏低退火温度偏低4.4.酶量过多酶量过多5.5.dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高6.6.循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策1.1.纯化模板纯化模板2.2.更换更换BufferBuffer3.3.适当提高退火温度适当提高退火温度4.4.适

13、量用酶适量用酶5.5.适当降低适当降低dNTPdNTP和和镁离子镁离子的的浓度浓度6.6.减少循环次数减少循环次数 拖尾PCR常见问题之四常见问题之四 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况（筛选转基因、检测基因表达情况)原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物 对策：1.1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.2.除除酶酶及及不不能能耐耐高高温温的的物物质质外外，所所有有试试剂剂或或器器材材均均应应高高压压消消毒毒。所所用用离离心心管管及

14、加样枪头等均应一次性使用。及加样枪头等均应一次性使用。3.3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。PCR技术简介技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案常见问题、原因分析及其解决方案提高提高PCR反应特异性的策略反应特异性的策略提高提高PCR反应特异性的策略反应特异性的策略巢式巢式PCR（Nest-PCR）四种策略四种策略 递减递减PCR（TouchDownPCR）热启动热启动PCR（HotStartPCR）使用使用PCR增强剂增强剂策略之一策略之一巢式巢式PCR（Nest-PCR）P1P2P3P4 巢式巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，

15、因为同多的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。套引物都互补的靶序列很少。巢巢式式PCR可可以以增增加加有有限限量量靶靶序序列列（如如稀稀有有mRNA）的的灵灵敏敏度度，并且提高了困难并且提高了困难PCR（如如5RACE）的特异性。的特异性。策略之二策略之二递减递减PCR（TouchDownPCR）递递减减PCR通通过过在在PCR的的前前几几个个循循环环使使用用严严谨谨的的退退火火条条件件提提高高特特异异性性。循循环环设设在在比比估估算算的的TmTm高高大大约约5的的退退火火温温度度下下开开始始，然后每个循环降低然后每个循环降低1 1-2 2,直到退火温度低于直到

16、退火温度低于Tm Tm 5。特特异异性性最最高高的的目目的的模模板板会会被被优优先先扩扩增增，这这些些产产物物在在随随后后的的循循环中继续扩增占据优势。环中继续扩增占据优势。递递减减PCR对对于于那那些些不不了了解解引引物物和和目目的的模模板板同同源源性性程程度度的的方方法更为有用，如法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。指纹分析等。策略之三策略之三热启动热启动PCR（HotStartPCR）热热启启动动主主要要是是通通过过抑抑制制一一种种基基本本成成分分延延迟迟DNA合合成成，直到直到PCR 仪达到变性温度；仪达到变性温度；现现在在有有很很多多公公司司都都有有HotStartTaq酶酶出

17、出售售，该该酶酶具具有有热热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；热热启启动动PCR是是除除了了好好的的引引物物设设计计之之外外，提提高高PCR特特异异性性最重要的方法之一。最重要的方法之一。策略之四策略之四使用使用PCR增强剂增强剂 甲酰胺，甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。的增强剂。其其可可能能的的机机理理是是降降低低熔熔解解温温度度，从从而而有有助助于于引引物物退退火火并并辅辅助助DNA聚合酶延伸通过二级结构区聚合酶延伸通过二级结构区。增强剂浓度要适当增强剂浓度要适当 谢谢！谢谢！北京天为时代科技有限公司北京天为时代科技有限公司http/www.http/www.twtw-免费咨询：免费咨询：80080081081021772177广东特约代理商广东特约代理商广州英韦创津生物科技有限公司广州英韦创津生物科技有限公司联系电话：联系电话：020-87598867 87534852 87534875020-87598867 87534852 87534875