【精品】基因工程操作的基本程序（可编辑.ppt

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1、基因工程操作的基本程序 目前被较广泛提取使用目前被较广泛提取使用的目的基因有：的目的基因有：苏云金杆苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。基因等。(种类见种类见P P9 9)基因操作的基本步骤基因操作的基本步骤一、目的基因的获取一、目的基因的获取 将需要的基因从供体生物将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。的细胞内提取出来。供体生物细胞供体生物细胞取出取出DNADNA用限制酶剪用限制酶剪去多余部分去多余部分目的基因目的基因限制酶限制酶一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基

2、因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因。编码蛋白质的结构基因。请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2、获取目的基因的常用方法：、获取目的基因的常用方法：（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成(一一)从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因什么是基因文库？什么是基因文库？什么是基因组文库？什么是基因组文库？什么是部分基因文库？什么是部分基因文库？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？目的基因的有关信息与什么相联系？目的基因的有关信息与什么相联系？

3、1 1、概念概念：将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段片段,导入受体导入受体菌的群体中储存菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称称为基因文库为基因文库。基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如cDNAcDNA文库）文库）基因组文库基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基这种基因文库叫做基因组文库。因组文库。部分基因文库部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做这种基因文

4、库叫做部分基因文库。部分基因文库。见P10“生物技术资料卡”2 2、基因文库种类基因文库种类1 1、概念：概念：PCR PCR全称为全称为_，是一项在生物，是一项在生物_复制复制_ _ _的核酸合成技术通过这项的核酸合成技术通过这项技术可在技术可在短时间内大量扩增目的基因短时间内大量扩增目的基因 因为整个过程是在体外进行，所以又叫做因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体体外外DNADNA扩增技术。扩增技术。聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段2 2、原理：、原理：DNADNA复制复制（二）利用（二）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因四种脱氧核苷酸四种脱

5、氧核苷酸(dNTP)(dNTP)一对引物：一对引物：热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNA(DNA(需含有目的基因需含有目的基因 )4 4、条件：、条件：一对寡核苷酸序列：与目的基因一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补的起始段互补 一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。合成引物。3 3、前提：、前提：温度控制温度控制IMNIMN变性变性变性变性复性复性复性复性延伸延伸延伸延伸5 5/3 3/G GG GT TC C3 3/5 5/G GA AC CC C5 5/3 3/引物引物G GG G变

6、性变性复性复性延伸延伸1 1、变性、变性(90-95(90-95度度)：目的基因：目的基因DNADNA受热变性，解链为单链；受热变性，解链为单链；2 2、复性（复性（55-6055-60）：引物与两条单链通过碱基互补配对原则结合；）：引物与两条单链通过碱基互补配对原则结合；3 3、延伸（延伸（70-7570-75）：在）：在DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）作用下，从酶）作用下，从55端端33端端进行延伸。进行延伸。5 5/3 3/A AG G引物引物5 5、扩增过程、扩增过程利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因（三）通过（三）通过DNA合成仪用化学方法人工合成合成仪

7、用化学方法人工合成DNA合成仪合成仪蛋白质的氨蛋白质的氨蛋白质的氨蛋白质的氨基酸顺序基酸顺序基酸顺序基酸顺序mRANmRAN核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列基因基因基因基因DNADNA的的的的核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列目的目的目的目的基因基因基因基因推推测测推推测测合合成成 当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。酸序列已知时，可采用此种方法。DNADNA合成仪合成仪合成仪合成仪二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心（1 1）用一定的）用一定的_切割质切割质粒，使其出现一个切口

8、，露出粒，使其出现一个切口，露出_。（2 2）用）用_ _切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。（3 3）将切下的目的基因片段插）将切下的目的基因片段插入质粒的入质粒的_处，再加入适量处，再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同1 1、过程过程:质粒质粒目的基因目的基因限制酶限制酶DNA连接酶连接酶重组重组DNA2 2、基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：3 3、目的：目的：a a、目的基因、目的基因b b、启

9、动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因e e、复制原点、复制原点 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是

10、：件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1 1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；利于基因的表达；（2 2）通过通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；无法转录；（3 3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4 4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强为了增强目的基因的表达水平，往

11、往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；子等；（5 5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。蛋白基因等。常用的受体细胞：常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。

12、的途径。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法特点特点:能感染能感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物,对对单子叶植物无感染能力单子叶植物无感染能力TiTi质粒质粒的的TDNATDNA可转移至受体细胞可转移至受体细胞并整合到其染色体上并整合到其染色体上转化过程转化过程:TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建构建表达表达载体载体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNADNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌（2 2）基因枪法）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的

13、动力，将包基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体裹在金属颗粒表面的表达载体DNADNA打入受体细胞中，使目的基因与打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。其整合并表达的方法。（3 3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加剪去柱头，然后，滴加DNADNA（含目的基因），使目的基因借助花粉（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道

14、进入受体细胞。管通道进入受体细胞。2、将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞方法方法:显微注射技术显微注射技术操作程序操作程序:提纯含目的基提纯含目的基因表达载体因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞常用法常用法：CaCa2+2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：CaCa2+2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNADNA(四四)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNA-DNADNA-DNA分子杂交分子杂交DNA-RNADNA-RNA分子杂交分子杂交抗原抗原-抗体杂交抗体杂交