【精品】基因的定位与克隆(可编辑.ppt
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1、基因的定位与克隆GenomicsEra一段一段DNADNA序列序列怎样研究基因的功能?怎样研究基因的功能?突变体Reveres geneticsIn human cell,the immunophilin protein(亲免蛋白)family,which play a role in immunoregulation and basic cellular processes involving protein folding and trafficking.Arabidopsis genome:52 genes have been found to encode putative immun
2、ophilins。To identify their functions,we can use reverse genetics-knock down/out,or over express the genes.Forward genetics正向遗传学有目的的寻找或创造突变体有目的的寻找或创造突变体 突变体遗传背景分析突变体遗传背景分析 基因定位克隆基因定位克隆What is a mutation?n突变突变(Mutation)是指DNA水平的可遗传的变异,不管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改变。突变产生的变异是自然选择的基础。可遗传的突变在群体中扩散从而产生多态性。n多态性多态
3、性(Polymorphism)群体内同一DNA序列的两种或多种变异形式,统计表明:群体内任何两个生物个体平均每100010000个碱基对有一对有差别,这种差别就是多态性。获得突变体的方法获得突变体的方法:1.1 自发突变(少,尤其是有重要功能的基因)1.2 物理、化学诱变 1.3 插入突变法:T-DNA 插入法;转座子法 突变体AlistofsomesequencedeukaryoticgenomesOrganismTypeGenome sizeNumber of genes predictedOrganizationYear of completionArabidopsis thaliana
4、拟南芥拟南芥119 Mb31,670(UniProt)31,670(UniProt)Arabidopsis Genome Initiative2000Oryza sativa水稻水稻420 Mb32-50,00032-50,000Beijing Genomics Institute,Zhejiang University and the Chinese Academy of Sciences2002Ostreococcus tauri绿藻绿藻12.6 Mb7,969(UniProt)7,969(UniProt)Laboratoire Arago2006Drosophila melanogast
5、er果蝇果蝇165 Mb13,60013,600Celera,UC Berkeley,Baylor College of Medicine,European DGP2000Homo sapiens人人3.2 Gb20,251(UniProt)20,251(UniProt)Human Genome Project Consortium and Celera GenomicsComplete 2006到底是哪个基因突变而引起对应性状的改变呢到底是哪个基因突变而引起对应性状的改变呢?就需要进行图位克隆(?就需要进行图位克隆(map based cloning)西北大学(北校区)地址:中国西安太白北路
6、229号基因图位克隆(map based cloning)基因定位基因定位基因精细定位基因精细定位测序基因克隆基因克隆基因确认基因确认互补实验Gene Mapping(基因定位)基因定位是指利用遗传标记,通过遗传作图的方法,基因定位是指利用遗传标记,通过遗传作图的方法,确定目的基因在染色体上的位置。确定目的基因在染色体上的位置。基因定位的前期条件突变的遗传背景清楚(单基因,显隐性等)突变物种有高密度遗传图谱(染色体连锁图谱),如需克隆基因还需物理图谱 遗传图谱遗传图谱(genetic map)(genetic map),即确定基因(或遗传标记)之间的遗传,即确定基因(或遗传标记)之间的遗传学距
7、离,用学距离,用cM(centimorgen)cM(centimorgen)表示表示 物理图谱物理图谱(physical map)(physical map),即确定基因(或遗传标记)之间的绝对,即确定基因(或遗传标记)之间的绝对物理学距离,通常用物理学距离,通常用Mb(Mb(百万碱基对百万碱基对)或或Kb(Kb(千碱基对千碱基对)来表示来表示作图群体(F2,RI等)遗传背景分析:圆粒遗传背景分析:圆粒vs.vs.皱粒皱粒F0XF1XF2547418502.96:1X X2 2(3 3:1 1)=0.26 P =P =0.61 遗传图谱某一物种的遗传图谱(染色体连锁图谱),显示所知的基因和遗传
8、标记的相对位置。基因或标记间的距离单位是cM,其遗传图的距离为1厘摩。(centimorgan,cM)交换值交换值(RF)(%)=重组型的配子数重组型的配子数/总配子数总配子数100%1cM=1重组值越大,两基因间的距离越远。重组值越大,两基因间的距离越远。一个基本的染色体连锁框架图要求一条染色体上的遗传标记平均不超过20cM。玉米高分辨率遗传图谱玉米高分辨率遗传图谱大豆大豆A2分子连锁群分子连锁群(molecular linkage group)遗传标记遗传标记(genetic markergenetic marker)性状标记性状标记 色泽,色泽,形态形态 细胞学标记细胞学标记 倒位,易位
9、,倒位,易位,G/N/CG/N/C带带 生化标记生化标记 同功酶同功酶 分子标记分子标记 RFLPRFLP、RAPDRAPD、SSRSSR、AFLPAFLP、SNP SNP 基础基础基础基础-基因表达基因表达基因表达基因表达结果结果结果结果表现型表现型表现型表现型DNADNA碱基碱基碱基碱基序列变异序列变异序列变异序列变异形态标记n遗传学上稳定、可见的外部特征遗传学上稳定、可见的外部特征-遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。l如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。v特点:直观简单特点:
10、直观简单l从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节,表型差异有时难以反映基因型差异。环节,表型差异有时难以反映基因型差异。细胞学标记l染色体数目变异及结构变异,表现在染色体核型(数目、大小、随体、着丝点位置等)和带型(C带、N带、G带等)。l随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展,可在染色体水平揭示更多遗传变异。l特点:直观、快速而经济,但变异十分有限,当染色体数目形态相似时难以分辨。人类染色体核型图生化标记贮藏蛋白和同工酶n贮藏蛋白贮藏蛋白同工酶同工酶v特点:经济、方便、成本较低特点:经济、方便、成本较低v结构基因表达产物,对非结构基因
11、无能结构基因表达产物,对非结构基因无能为力;所检测位点只是基因组一部分;为力;所检测位点只是基因组一部分;数量有限,有时受发育时期和环境影响。数量有限,有时受发育时期和环境影响。铁角蕨属植物铁角蕨属植物的同工酶分析的同工酶分析 分子标记分子标记本质是以核苷酸序列作为标记,来源于DNA水平的突变。能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段,它直接反映不同个体的基因组DNA间的差异。分子标记的特点分子标记的特点(1)直接以DNA的形式表现,在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到,不受季节、环境限制,不存在表达与否等问题;(2)数量极多,遍布整个基因组,可检测座位几乎无限;(3)多态
12、性高,自然界存在许多等位变异,无须人为创造;(4)表现为中性,不影响目标性状的表达;(5)许多标记表现为共显性的特点,能区别纯合体和杂合体。大豆大豆A2分子连锁群分子连锁群(molecular linkage group)分子标记的类型与发展分子标记的类型与发展 1.分子标记的类型分子标记的类型 基于杂交的分子标记基于杂交的分子标记,如RFLP(Restriction fragment length polymorphism,即限制性长度片段多态性)。基于基于 PCR的分子标记的分子标记,它又分为两类:RAPD(Random amplified polymorphic DNA)DAF(DNA
13、amplification fingerprinting)SSCP(Single strand confirmational polymorphism)小卫星小卫星DNA(Minisatellite DNA)微卫星微卫星DNA(Microsatellite DNA),又称SSR(Simple sequence repeat)ISSR(Inter simple sequence repeat)AP-PCR(Arbitrary primer PCR)它主要有SCAR(Sequence characterized amplified region)STS(Sequence tagged site)基
14、基于于PCR技技术术的的DNA扩扩增增方方法法 AFLP(Amplified fragment length polymorphism)AFLP是先酶切,再用特殊设计的引物进行扩增 CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)CAPS是先扩增,再酶切扩增片段PCR与与酶酶切切相相结结合合的的方方法法基于 DNA序列和芯片的分子标记,如SNP(Single nucleotide polymorphism)。几种分子标记介绍几种分子标记介绍1.RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism):限制性片段长度多态
15、性,为第一代多态性记。原理:原理:RFLPRFLP是由于染色体上单核甘酸突变或插入及缺失突变导是由于染色体上单核甘酸突变或插入及缺失突变导致限制性酶切位点的增加或减少,从而导致致限制性酶切位点的增加或减少,从而导致DNADNA酶切片酶切片段长度的变化,这种变化的检测通常是应用同位素或段长度的变化,这种变化的检测通常是应用同位素或酶联免疫标记探针进行检测。酶联免疫标记探针进行检测。RFLP原理示意图GTAGTCGATTGTCGAGAATTCGTCGGTGGTAAGCATCAGCTAACAGCTCTTAAGCAGCCACCATTC EcoRIEcoRI酶切位点单碱基突变导致RFLP多态性2 kb3
16、 kb2 kb3 kb RFLPRFLP是由是由DNADNA一级水平的变异造成的。然而,如果一级水平的变异造成的。然而,如果DNADNA变异的位点不变异的位点不在内切酶位点,变异则很难被检测到,这个缺陷可以用增加内切酶的种类来在内切酶位点,变异则很难被检测到,这个缺陷可以用增加内切酶的种类来弥补。弥补。这在实际工作中,单一酶切产生的多态性极其有限,主要取决于亲这在实际工作中,单一酶切产生的多态性极其有限,主要取决于亲本材料的来源。正常情况下用到本材料的来源。正常情况下用到6 6到到8 8种酶来筛选多态性。不同的酶产生的多种酶来筛选多态性。不同的酶产生的多态性大不相同。态性大不相同。技术路线:不
17、同个体不同个体DNA的提取的提取酶切酶切凝胶电泳分开凝胶电泳分开DNA片段片段转膜转膜 Southern杂交杂交 数据分析数据分析RFLP的特点A 不受环境条件和发育阶段的影响B 是共显性共显性的C 需要对探针进行标记,还要Southern 杂 交,耗时费力耗时费力D DNA需要量大,难以用于大规模的育种2.2.随意扩增多态性随意扩增多态性DNADNA标记标记RAPDRAPDRandom Amplified Polymorphismic DNA由单个短的随机序列引物(9nt)对基因组进行PCR扩增,当两个反向互补引物结合位点间距离满足PCR扩增条件,就可以产生扩增片段。RAPD扩增产物的多态性
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