医学专题一抗体与免疫球蛋白.ppt

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1、第三章第三章 抗体抗体(kngt)(kngt)与免疫球蛋白与免疫球蛋白Antibody and ImmunologyAntibody and Immunology海南医学院微生物学海南医学院微生物学海南医学院微生物学海南医学院微生物学(wi shn w xu)(wi shn w xu)与免疫学教与免疫学教与免疫学教与免疫学教研室制作研室制作研室制作研室制作Copyright 2009Copyright 2009第一页，共三十三页。内内 容容 与与 要要 求求1 1、免疫、免疫(miny)(miny)球蛋白的结构（掌握）球蛋白的结构（掌握）2 2、免疫球蛋白、免疫球蛋白的功能的功能的功能的功能(

2、gngnng)(gngnng)（掌握）（掌握）（掌握）（掌握）3 3、各类、各类IgIg的特性的特性(txng)(txng)与功能（掌握）与功能（掌握）4 4、单克隆抗体（了解）、单克隆抗体（了解）第二页，共三十三页。抗体抗体(Antibody Antibody，Ab Ab）是是B细胞识别抗原后细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，能增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫与相应抗原特异性地结合，具有免疫(miny)(miny)功功能，主要存在于血清等体液中。能，主要存在于血清等体液中。免疫球蛋白（免疫球蛋白（ImmunologyImmunology，

3、IgIg）具有抗体具有抗体(kngt)(kngt)活活性或化学结构与抗体性或化学结构与抗体(kngt)(kngt)相似的球蛋白。相似的球蛋白。第三页，共三十三页。抗体是否等于抗体是否等于(dngy)免疫球蛋白？免疫球蛋白？第四页，共三十三页。抗体抗体(kngt)(kngt)的发现与命的发现与命名名 3030年年年年代代代代 血血血血清清清清中中中中具具具具有有有有防防防防御御御御作作作作用用用用的的的的保护保护保护保护(boh)(boh)成分统称为成分统称为成分统称为成分统称为抗体抗体抗体抗体抗体抗体抗体抗体(kngt)(kngt)是血清丙种球蛋白，是血清丙种球蛋白，是血清丙种球蛋白，是血清丙

4、种球蛋白，4040年代被命名为年代被命名为年代被命名为年代被命名为-球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白抗体是异质性球蛋白抗体是异质性球蛋白抗体是异质性球蛋白抗体是异质性球蛋白,60,60年年年年代代代代 免疫球蛋白（免疫球蛋白（免疫球蛋白（免疫球蛋白（IgIg）替代替代替代替代-球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白第五页，共三十三页。第一节第一节 免疫免疫(miny)(miny)球蛋白的结构球蛋白的结构一、基本一、基本一、基本一、基本(jbn)(jbn)结构：四肽链结构结构：四肽链结构结构：四肽链结构结构：四肽链结构 由两条相同的由两条相同的由两条相同的由两条相同的轻链轻链轻链轻链（L Light Chainigh

5、t Chain）和两条和两条和两条和两条相同的相同的相同的相同的重链重链重链重链（HHeavy eavy chainchain）通过通过通过通过(tnggu)(tnggu)链间二链间二链间二链间二硫键连结形成。硫键连结形成。硫键连结形成。硫键连结形成。分子式为：分子式为：分子式为：分子式为：HH2 2L L2 2四条肽链两端游离的四条肽链两端游离的四条肽链两端游离的四条肽链两端游离的NHNH2 2和和和和COOHCOOH方向一致分别命名方向一致分别命名方向一致分别命名方向一致分别命名为为为为N N端和端和端和端和C C端端端端第六页，共三十三页。（一）轻链和重链（一）轻链和重链轻链（轻链（L链

6、）链）链链 链链轻链决定轻链决定(judng)型别型别 型型 型型正常人：2 ：1重链（重链（重链（重链（HH链）链）链）链）:根据其抗原性的差异根据其抗原性的差异根据其抗原性的差异根据其抗原性的差异(chy)(chy)，人类，人类，人类，人类IgIg的的的的HH链分为链分为链分为链分为 链链链链 链链链链 链链链链 链链链链 链链链链重链决定重链决定重链决定重链决定(judng)(judng)IgIg类别类别类别类别 IgG IgA IgM IgD IgE IgG IgA IgM IgD IgE第七页，共三十三页。（二）可变区和恒定（二）可变区和恒定(hngdng)(hngdng)区区（Va

7、riable region and Constant region）V区：区：VL、VH 可变区（可变区（V区）区）：氨基酸种类氨基酸种类(zhngli)、排列顺序差异较大，、排列顺序差异较大，构成抗体的多样性构成抗体的多样性。恒定区（恒定区（C区）区）氨基酸种类氨基酸种类(zhngli)、排列顺序恒定、排列顺序恒定C区：区：CL、CH 第八页，共三十三页。高变区高变区（hypervariable region，HVR）抗体与抗原结合的位置抗体与抗原结合的位置(wi zhi)，又称为决定簇互，又称为决定簇互补区补区(complementarity-determinant region,CDR)

8、，也是抗体分子，也是抗体分子的的独特型决定簇独特型决定簇的主要的主要存在部位存在部位。骨架骨架(gji)区区(Framework,FR)第九页，共三十三页。(三）铰链三）铰链(jiolin)(jiolin)区（区（hinge region）位于位于位于位于CHCH1 1和和和和CHCH2 2之间，富含脯氨酸，易发生伸展和一之间，富含脯氨酸，易发生伸展和一之间，富含脯氨酸，易发生伸展和一之间，富含脯氨酸，易发生伸展和一定程度定程度定程度定程度(chngd)(chngd)的移动，的移动，的移动，的移动，便于抗体更好地与抗原结合便于抗体更好地与抗原结合便于抗体更好地与抗原结合便于抗体更好地与抗原结合

9、。第十页，共三十三页。二、免疫二、免疫(miny)(miny)球蛋白的功能球蛋白的功能区区IgIg分子通过分子通过分子通过分子通过(tnggu)(tnggu)链内二硫键链内二硫键链内二硫键链内二硫键折叠或若干个球形单位，折叠或若干个球形单位，折叠或若干个球形单位，折叠或若干个球形单位，每个球形单位为一个每个球形单位为一个每个球形单位为一个每个球形单位为一个功功功功能区。能区。能区。能区。L L链：链：链：链：VLVL区区区区 CL CL区区区区HH链：链：链：链：VHVH区区区区 CH CH1 1区区区区 CH CH2 2区区区区 CH CH3 3区区区区 CH CH4 4区区区区(IgM,I

10、gE)(IgM,IgE)第十一页，共三十三页。V V区区区区C区区V VL L+V+VHH功能区：功能区：功能区：功能区：抗抗抗抗原原原原(kngyun)(kngyun)结合部位结合部位结合部位结合部位CH3CH3功能区功能区功能区功能区：是：是：是：是IgIg与其与其与其与其FcFc受体结合的部位受体结合的部位受体结合的部位受体结合的部位(固定固定固定固定(gdng)(gdng)细胞）细胞）细胞）细胞）C CL L和和和和C CH H 区区区区：具有同种异：具有同种异：具有同种异：具有同种异型抗体的遗传型抗体的遗传型抗体的遗传型抗体的遗传(ychun)(ychun)标标标标记。记。记。记。C

11、HCH2 2区区区区：IgGIgG的补体结合点的补体结合点的补体结合点的补体结合点和通过胎盘的部位和通过胎盘的部位和通过胎盘的部位和通过胎盘的部位功能区的作用功能区的作用第十二页，共三十三页。VL+VH功能区：抗原功能区：抗原(kngyun)(kngyun)结合结合部位部位第十三页，共三十三页。IgG CHIgG CH3 3区区区区：可于单核：可于单核：可于单核：可于单核-M-M 细胞、细胞、细胞、细胞、B B细胞、细胞、细胞、细胞、NKNK细胞、细胞、细胞、细胞、中性粒细胞上的中性粒细胞上的中性粒细胞上的中性粒细胞上的IgG-FcIgG-Fc受体受体受体受体结合结合结合结合(jih)(jih

12、)调理吞噬、调理吞噬、调理吞噬、调理吞噬、ADCCADCC。第十四页，共三十三页。三、免疫三、免疫(miny)(miny)球蛋白的水解片段球蛋白的水解片段木瓜木瓜木瓜木瓜(m u)(m u)蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶-水解水解水解水解裂解部位裂解部位裂解部位裂解部位(bwi)(bwi)：铰链区近：铰链区近：铰链区近：铰链区近N N端端端端裂解片段：裂解片段：裂解片段：裂解片段：2Fab+Fc 2Fab+Fc FabFab结合价结合价结合价结合价 ：单价：单价：单价：单价 FabFab为抗原结合片段（为抗原结合片段（为抗原结合片段（为抗原结合片段（F Fragment of ragment of

13、a antigen ntigen b bindinginding）FcFc为可结晶片段（为可结晶片段（为可结晶片段（为可结晶片段（F Fragment of ragment of c crystallinerystalline）第十五页，共三十三页。胃蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶(wi dn bi mi)(wi dn bi mi)-水解水解水解水解裂解裂解裂解裂解(li ji)(li ji)部位：铰链区端部位：铰链区端部位：铰链区端部位：铰链区端裂解裂解裂解裂解(li ji)(li ji)片段片段片段片段 F(ab)F(ab)2 2+pFc+pFc FabFab结合价：二价结合价：二价结合价

14、：二价结合价：二价第十六页，共三十三页。IgG水解水解(shuji)(shuji)木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 胃蛋白酶胃蛋白酶裂解部位裂解部位 铰链区近铰链区近N端端 铰链区近铰链区近C端端裂解片段裂解片段 2Fab+Fc F(ab)2+pFcFab结合价结合价 单价单价(dnji)(dnji)二价二价同种型抗原同种型抗原决定簇决定簇 存在存在 消失消失免疫动物免疫动物 产生抗产生抗IgG 不产生抗不产生抗IgG超敏反应的超敏反应的可能性可能性 大大 小小第十七页，共三十三页。J链链由浆细胞合成(hchng)SC链由粘膜上皮细胞合成和分泌四、四、J链和分泌链和分泌(fnm)(fnm)片（片（SP）J

15、oining chain and secretory piece第十八页，共三十三页。单体单体(dn t)(dn t)、二聚体、五聚体、二聚体、五聚体单体(dn t)结构二聚体结构(jigu)五聚体结构IgG、IgA、SIgA IgM IgD、IgE 分子式:H2L2 (H2L2)2SCJ (H2L2)5J第十九页，共三十三页。第二节第二节 免疫免疫(miny)(miny)球蛋白的功能球蛋白的功能 （一）特异性结合抗原（一）特异性结合抗原（一）特异性结合抗原（一）特异性结合抗原(kngyun)(kngyun)（二）激活补体（二）激活补体（二）激活补体（二）激活补体 （三）与细胞表面（三）与细胞

16、表面（三）与细胞表面（三）与细胞表面FcFc受体结合（固定细胞）受体结合（固定细胞）受体结合（固定细胞）受体结合（固定细胞）IgE IgE FcFc受受受受体体体体（FcFc R R）：存存存存在在在在于于于于肥肥肥肥大大大大细细细细胞胞胞胞和和和和嗜嗜嗜嗜碱碱碱碱性性性性粒粒粒粒 细胞膜上。细胞膜上。细胞膜上。细胞膜上。IgG FcIgG Fc受体（受体（受体（受体（FcFcR R）：存在于单核存在于单核存在于单核存在于单核-吞噬细胞、吞噬细胞、吞噬细胞、吞噬细胞、NKNK细胞、细胞、细胞、细胞、B B细胞上细胞上细胞上细胞上。（四）通过胎盘和粘膜（四）通过胎盘和粘膜（四）通过胎盘和粘膜（四

17、）通过胎盘和粘膜（五）免疫调节功能（五）免疫调节功能（五）免疫调节功能（五）免疫调节功能第二十页，共三十三页。注射破伤风抗毒素之前注射破伤风抗毒素之前(zhqin)需要先做皮试，为什么？需要先做皮试，为什么？抗毒素可以(ky)中和毒素抗毒素是动物(dngw)血清，对人来说是抗原物质，重复注射会引起超敏反应胃蛋白酶水解片段（pFc）抗原性消失应用何种酶水解抗毒素可以应用何种酶水解抗毒素可以防止超敏反应，为什么防止超敏反应，为什么?紧急预防破伤风需要注射紧急预防破伤风需要注射破伤风抗毒素，为什么？破伤风抗毒素，为什么？第二十一页，共三十三页。第三节第三节 各类各类Ig的特性的特性(txng)(tx

18、ng)与功能与功能1 1、由淋巴结和脾脏的浆细胞产生。由淋巴结和脾脏的浆细胞产生。由淋巴结和脾脏的浆细胞产生。由淋巴结和脾脏的浆细胞产生。2 2、在血清中含量最高，在血清中含量最高，在血清中含量最高，在血清中含量最高，占血清占血清占血清占血清IgIg总量的总量的总量的总量的75-80%75-80%。3 3、是是是是血血血血液液液液循循循循环环环环中中中中主主主主要要要要的的的的防防防防御御御御性性性性抗抗抗抗体体体体，能能能能激激激激活活活活补补补补体体体体、中中中中和和和和病病病病毒、中和毒素、调理吞噬。毒、中和毒素、调理吞噬。毒、中和毒素、调理吞噬。毒、中和毒素、调理吞噬。4 4、能通过胎

19、盘能通过胎盘能通过胎盘能通过胎盘，对新生儿抗感染起重要作用对新生儿抗感染起重要作用对新生儿抗感染起重要作用对新生儿抗感染起重要作用。5 5、再次免疫应答再次免疫应答再次免疫应答再次免疫应答(yngd)(yngd)产生产生产生产生IgGIgG，为高亲和力抗体。，为高亲和力抗体。，为高亲和力抗体。，为高亲和力抗体。6 6、可与葡萄球菌蛋白、可与葡萄球菌蛋白、可与葡萄球菌蛋白、可与葡萄球菌蛋白A A（SPASPA）结合，用于免疫诊断。）结合，用于免疫诊断。）结合，用于免疫诊断。）结合，用于免疫诊断。IgG第二十二页，共三十三页。功能功能 亚类亚类 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4特异性结合抗原

20、特异性结合抗原 +激活补体（经典激活补体（经典）+-通过通过(tnggu)胎盘胎盘 +结合结合SPA +结合结合FcrR +-/+/-占血清中占血清中Ig总量总量(%)60-70 15-20 5-10 1-7 人人IgG亚类比较亚类比较(bjio)第二十三页，共三十三页。Ig M 1 1、分子量最大分子量最大分子量最大分子量最大，血清，血清，血清，血清IgMIgM为为为为5 5聚体聚体聚体聚体（巨球蛋白）（巨球蛋白）（巨球蛋白）（巨球蛋白）2 2、由由由由脾脾脾脾脏脏脏脏中中中中的的的的浆浆浆浆细细细细胞胞胞胞产产产产生生生生，是是是是个个个个体体体体发发发发育育育育过过过过程程程程中中中中出

21、出出出现现现现最最最最早早早早的的的的抗抗抗抗体体体体，胚胚胚胚胎晚期已能合成。如胎晚期已能合成。如胎晚期已能合成。如胎晚期已能合成。如新生儿血清新生儿血清新生儿血清新生儿血清IgMIgM含量增高，则表示宫内感染。含量增高，则表示宫内感染。含量增高，则表示宫内感染。含量增高，则表示宫内感染。3 3、血血血血清清清清IgMIgM：能能能能激激激激活活活活(j(j hu)hu)补补补补体体体体，通通通通过过过过补补补补体体体体裂裂裂裂解解解解产产产产生生生生C C3b3b、C C4b4b发发发发挥挥挥挥调调调调理理理理吞噬吞噬吞噬吞噬作用。抗全身感染的作用较强。作用。抗全身感染的作用较强。作用。抗

22、全身感染的作用较强。作用。抗全身感染的作用较强。4 4、在在在在免免免免疫疫疫疫应应应应答答答答的的的的早早早早期期期期发发发发生生生生，是是是是重重重重要要要要的的的的早早早早期期期期防防防防御御御御性性性性抗抗抗抗体体体体，对对对对感感感感染染染染的的的的早早早早期诊断有意义。期诊断有意义。期诊断有意义。期诊断有意义。成人血清成人血清成人血清成人血清IgMIgM含量增高，则表示有近期感染。含量增高，则表示有近期感染。含量增高，则表示有近期感染。含量增高，则表示有近期感染。5 5、B B细细细细胞胞胞胞膜膜膜膜表表表表面面面面IgMIgM（mIgMmIgM）是是是是B B细细细细胞胞胞胞识识

23、识识别别别别抗抗抗抗原原原原的的的的受受受受体体体体（BCRBCR），为单体为单体为单体为单体IgMIgM。只表达。只表达。只表达。只表达mIgMmIgM是未成熟是未成熟是未成熟是未成熟B B细胞的标志。细胞的标志。细胞的标志。细胞的标志。第二十四页，共三十三页。IgA与与SIgA 血血血血清清清清IgAIgA：由由由由肠肠肠肠系系系系膜膜膜膜淋淋淋淋巴巴巴巴结结结结中中中中的的的的浆浆浆浆细细细细胞胞胞胞产产产产生生生生存存存存在在在在于于于于血血血血清清清清中中中中，含含含含量量量量占占占占血血血血清清清清IgIg总总总总量量量量的的的的10-20%10-20%。为为为为单单单单体体体体。

24、具具具具抗抗抗抗菌菌菌菌、抗抗抗抗毒毒毒毒、抗抗抗抗病病病病毒毒毒毒作作作作用用用用，对支原体和某些真菌也有作用。对支原体和某些真菌也有作用。对支原体和某些真菌也有作用。对支原体和某些真菌也有作用。分分分分泌泌泌泌性性性性IgAIgA（SIgASIgA）：由由由由粘粘粘粘膜膜膜膜固固固固有有有有层层层层的的的的浆浆浆浆细细细细胞胞胞胞产产产产生生生生，在在在在浆浆浆浆细细细细胞胞胞胞内内内内已已已已有有有有J J链链链链连连连连结结结结成成成成二二二二聚聚聚聚体体体体，通通通通过过过过粘粘粘粘膜膜膜膜上上上上皮皮皮皮细细细细胞胞胞胞时时时时获获获获得得得得分分分分泌泌泌泌片片片片.存存存存在在

25、在在于于于于外外外外分分分分泌泌泌泌液液液液中，为二聚体。中，为二聚体。中，为二聚体。中，为二聚体。SIgASIgA是重要的局部是重要的局部是重要的局部是重要的局部(jb)(jb)防御性抗体防御性抗体防御性抗体防御性抗体。第二十五页，共三十三页。Ig D 1 1、单体结构，由扁桃腺、脾脏中的浆细胞产生。、单体结构，由扁桃腺、脾脏中的浆细胞产生。、单体结构，由扁桃腺、脾脏中的浆细胞产生。、单体结构，由扁桃腺、脾脏中的浆细胞产生。2 2、血清中含量甚低，只占血清、血清中含量甚低，只占血清、血清中含量甚低，只占血清、血清中含量甚低，只占血清IgIg总量的总量的总量的总量的0.2%0.2%。3 3、是

26、成熟是成熟是成熟是成熟(chngsh)(chngsh)B B细胞膜表面细胞膜表面细胞膜表面细胞膜表面IgD IgD 分子（分子（分子（分子（SmIgDSmIgD）。）。）。）。4 4、血清、血清、血清、血清IgDIgD分子：功能未明确。分子：功能未明确。分子：功能未明确。分子：功能未明确。第二十六页，共三十三页。Ig E 1 1、由由由由鼻鼻鼻鼻咽咽咽咽部部部部、扁扁扁扁排排排排腺腺腺腺、支支支支气气气气管管管管、胃胃胃胃肠肠肠肠道道道道粘粘粘粘膜膜膜膜固固固固有有有有层层层层的淋巴组织中的浆细胞产生的淋巴组织中的浆细胞产生的淋巴组织中的浆细胞产生的淋巴组织中的浆细胞产生(chnshng)(c

27、hnshng)。2 2、在血清中、在血清中、在血清中、在血清中含量最低含量最低含量最低含量最低，0.1-0.40.1-0.4 g/mlg/ml3 3、为单体结构。、为单体结构。、为单体结构。、为单体结构。4 4、亲亲亲亲细细细细胞胞胞胞性性性性：与与与与肥肥肥肥大大大大细细细细胞胞胞胞和和和和嗜嗜嗜嗜碱碱碱碱性性性性粒粒粒粒细细细细胞胞胞胞膜膜膜膜上上上上的的的的FcFc R R结合。结合。结合。结合。5 5、介导介导介导介导型超敏反应型超敏反应型超敏反应型超敏反应。第二十七页，共三十三页。IgG IgA SIgA IgM IgD IgE IgG IgA SIgA IgM IgD IgE全身性

28、防御全身性防御(fngy)(fngy)抗体抗体 +-+-+-+-局部性防御抗体局部性防御抗体 -+-+-早期性防御抗体早期性防御抗体 -+-介导介导型超敏反应型超敏反应 -+-+介导介导、型超敏反应型超敏反应+-+-+-+-B B细胞膜抗原受体细胞膜抗原受体 -+-+-（SmIgSmIg）各类免疫各类免疫(miny)(miny)球蛋白的主要区别球蛋白的主要区别第二十八页，共三十三页。第四节第四节 单克隆抗体单克隆抗体(kngt)(kngt)*每一种浆细胞克隆产生一种特异性抗体每一种浆细胞克隆产生一种特异性抗体(kngt)分子分子*由一个由一个(y)识别一种抗原表位的识别一种抗原表位的B细胞克隆

29、产生的同源抗体称为细胞克隆产生的同源抗体称为单克隆抗体单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）*由多种由多种B细胞克隆产生的针对多种抗原表位的不同抗体，称为细胞克隆产生的针对多种抗原表位的不同抗体，称为多多克隆抗体克隆抗体（Polyclonal antibody，pAb）*单克隆抗体技术单克隆抗体技术 即即杂交瘤技术杂交瘤技术，系将产生抗体的，系将产生抗体的B淋巴细胞与淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行杂交，产生的杂交瘤细胞，既可在体外大量无骨髓瘤细胞进行杂交，产生的杂交瘤细胞，既可在体外大量无限生产繁殖又能合成和分泌抗体。限生产繁殖又能合成和分泌抗体。第二十九页，共三十三页。Pc

30、AbPcAb McAb McAb产生细胞产生细胞产生细胞产生细胞 多种浆细胞克隆多种浆细胞克隆多种浆细胞克隆多种浆细胞克隆(k ln)(k ln)一种浆细胞克隆一种浆细胞克隆一种浆细胞克隆一种浆细胞克隆(k ln)(k ln)抗体抗体抗体抗体 非均一性非均一性非均一性非均一性 均一性均一性均一性均一性纯度纯度纯度纯度 不高不高不高不高 高高高高特异性特异性特异性特异性 不强不强不强不强 强强强强PcAb与与McAb的主要的主要(zhyo)(zhyo)区别区别第三十页，共三十三页。第三十一页，共三十三页。SkWoZr%v)y0C4F7JbNeQiUmXp!t*w-A2D5H9LcOgSkVnZr

31、$u(y0B3F7JaMeQiTlXp#s&w-z1D5H8KcOgRjVnYq$u(x+B3F6IaMePhTlWo#s&v)z1D4G8KbNfRjUmYq$t*x+B2E6I9LdPhSkWo#r%v)z0C4G7JbNfQiUmYp!t*x-A2E5H9LdOgSkWnZr%u(y0C3F7JbMeQiUlXp!s&w-A1D5H9KcOgSjVnZq$u(y+B3F7IaMeQhTlXo#s&w)z1D5G8KcNfRjVmYq$u*x+B3E6IaLdPhTkWo#s%v)z1C4G8JbNfRiUmYq!t*x+A2E6H9LdPgSkWoZr%v(y0C4F7JbNeQiUmX

32、p!t&w-A2D5H9LcOgSkVnZr$u(y0B3F7JaMeQiTlXp#s&w-z1D5H8KcOfRjVnYq$u(x+B3F6IaMdPhTlWo#s&v)z1D4G8KbNfRjUmYq$t*x+A2E6I9LdPhSkWo#r%v)y0C4G7JbNfQiUmYp!t*w-A2E5H9LdOgSkWnZr%u(y0C3F7JbMeQiTlXp!s&w-A1D5H9KcOgRjVnZq$u(y+B3F7IaMePhTlXo#s&w)z1D5G8KcNfRjVmYq$u*x+B2E6IaLdPhTkWo#s%v)z0C4G8JbNfRiUm!t*w-A2D5H9LcOgSkVn

33、Zr%u(y0B3F7JaMeQiTlXp#s&w-z1D5H8KcOgRjVnYq$u(x+B3F6IaMePhTlWo#s&v)z1D4G8KcNfRjUmYq$t*x+B2E6I9LdPhSkWo#r%v)z0C4G7JbNfQiUmYp!t*x-A2E5H9LdOgSkWnZr%v(y0C3F7JbMeQiUlXp!s&w-A1D5H9KcOgSjVnZq$u(y+B3F7IaMeQhTlXo#s&w)z1D5G8KcOfRjVmYq$u*x+B3E6IaLdPhTkWo#s%v)z1C4G8JbNfRiUmYq!t*x+A2E6H9LdPgSkWoZr%v)y0C4F7JbNeQiU

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35、SkWoZr%v(y0C4F7JbNeQiUmXp!t&w-A2D5H9LcOgSjVnZr$u(y0B3F7JaMeQhTlXp#s&w-z1D5H8KcOfRjVnYq$u(x+B3F6IaMdPhTlWo#s&v)z1C4G8KbNfRjUmYq$t*x+A2E6I9LdPhSkWo#r%v)y0C4G7JbNfQiUmYp!t*w-A2E5H9LdOgSkVnZr%u(y0C3F7JbMeQiTlXp!s&w-A1D5H9KcOgRjVnZq$u(y+B3F6IaMePhTlXo#s&w)z1D4G8KcNfRjVmYq$u*x+B2E6IaLdPhTkWo#s%v)z0C4G8JbN

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