医学专题一免疫细胞功能检测技术.ppt

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1、免疫细胞功能免疫细胞功能(gngnng)(gngnng)检测技术检测技术第一页，共四十三页。一一 淋巴细胞的功能淋巴细胞的功能(gngn(gngn ng)ng)检测检测 淋巴细胞功能淋巴细胞功能(gngn(gngn ng)ng)测定可分为体内实验和体外测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定细胞毒性试验及淋巴细

2、胞分泌产物的测定 第二页，共四十三页。淋巴细胞淋巴细胞T T细胞（负责细胞免疫功能）细胞（负责细胞免疫功能）B B细胞（执行细胞（执行(zh(zh x x ng)ng)体液免疫功能）体液免疫功能）NKNK细胞（非特异性免疫作用）细胞（非特异性免疫作用）第三页，共四十三页。一、一、T细胞细胞(xbo)功能的检测功能的检测T T细胞增殖试验细胞增殖试验T T细胞分泌细胞分泌(fnm(fnm)功能测功能测定定T T细胞介导的细胞毒试细胞介导的细胞毒试验验体内试验体内试验第四页，共四十三页。（一）（一）T T淋巴细胞增殖淋巴细胞增殖(zngzh(zngzh)试验试验1.1.原理原理(yunl)(yun

3、l)：淋巴细胞淋巴细胞DNADNA合成合成(hchng)(hchng)分化分化母细胞母细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核染色质疏松核染色质疏松第五页，共四十三页。未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞 过渡型细胞大小(直径m)1220121668核大小、染色质增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、14个有或无无有丝分裂有或无无无胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色浆内空泡有或无有或无无伪足有或无有或无无第六页，共四十三页。2.2.淋巴细胞转化淋巴细胞转化(zhunhu(zhunhu)的刺激物的刺激物非特异性刺

4、激物：非特异性刺激物：PHA -TPHA -T细胞细胞 ConA-TConA-T细胞细胞 PWM-TPWM-T、B B细细胞胞 LPS -BLPS -B细胞细胞特异性刺激物：特异性刺激物：异种抗原异种抗原(k(k ngyungyu n)n)同种组织抗原同种组织抗原 第七页，共四十三页。3.3.检测检测(jin c(jin c)方法方法 形态法：刺激物 淋巴细胞（4-6天）母细胞化 同位素法：PHA 淋巴细胞（54h）DNA合成期 +3HTdR掺入 收集细胞(xbo)检测射线 测定测定(cdng)(cdng)细胞内的细胞内的3H3HTdRTdR第八页，共四十三页。（1 1）形态学检查法）形态学检

5、查法第九页，共四十三页。方法学评价方法学评价(p(p ngjingji)：优点：形态学方法优点：形态学方法(fngf)(fngf)简便易简便易行，普通光学显微镜便能观察结行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。果，适于基层实验室应用。缺点：是依靠肉眼观察形态学缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。响，重复性和准确性较差。第十页，共四十三页。培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性（2 2）3H-TdR3H-TdR掺入法掺入法第十一页，共四十三页。优点：优点：3H-TdR3H-TdR掺入法敏感性高

6、，客掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时缺点：但需一定设备条件，同时(t(t ngshngsh)还存在放射性核素污染问题。还存在放射性核素污染问题。第十二页，共四十三页。培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性MTT测吸光度(gungd)(3)MTT(3)MTT 比色法比色法第十三页，共四十三页。(二二)T)T细胞分泌功能细胞分泌功能(gngn(gngn ng)ng)测定测定 体外培养体外培养(p(p iyng)iyng)的的T T细胞经各种丝裂原或抗细胞经各种丝裂原或抗原刺激后原刺激后,分泌各种细胞因子分泌各种细胞因子,可借助

7、免疫学、可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映含量、生物学活性或基因表达水平，以反映T T细细胞功能。胞功能。第十四页，共四十三页。（三）（三）T T细胞细胞(x(x bo)bo)介导的细胞介导的细胞(x(x bo)bo)毒试验毒试验1.1.原理原理(yunl)(yunl)：靶细胞抗原靶细胞抗原(kngyun)(kngyun)T T细胞细胞观察杀伤活力观察杀伤活力致敏致敏CTLCTL靶细胞靶细胞第十五页，共四十三页。形态学方法：淋巴细胞形态学方法：淋巴细胞+肿瘤肿瘤(zhngli)(zhngli)

8、细胞细胞 计计数残留肿瘤数残留肿瘤(zhngli)(zhngli)细胞细胞2.2.方法方法(fngf)(fngf)意义(yy)：肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力 第十六页，共四十三页。图15-2 T细胞细胞毒试验示意图第十七页，共四十三页。靶细胞51Cr洗涤去除游离的51Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混合培养4-6小时5151CrCr释放释放(shfng)(shfng)法法第十八页，共四十三页。(四四)体内体内(t ni)(t ni)试验试验特异性抗原特异性抗原(k(k ngyungyu n)n)皮肤皮肤试验试验PHAPHA皮肤试验皮肤试验 第十九页，共四十三页。二、二、B细胞细胞(x

9、bo)功能检测功能检测B B细胞细胞(x(x bo)bo)增殖能力的试验增殖能力的试验溶血空斑试验溶血空斑试验B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测体内试验体内试验第二十页，共四十三页。(一一)B)B细胞细胞(x(x bo)bo)增殖能力的试验增殖能力的试验抗抗IgMIgM细菌细菌(xjn)(xjn)脂多糖脂多糖SACSAC的的SPASPAB B细胞细胞(xbo)(xbo)增增殖殖形态学形态学3 3H HTdRTdR掺入法掺入法第二十一页，共四十三页。(二二)溶血溶血(rn xu)(rn xu)空斑试验空斑试验1.1.原理原理(yunl)(yunl)：第二十二页，共四十三页。2.2

10、.方法学：方法学：经典溶血经典溶血(r(r n xun xu)空斑形成试验空斑形成试验被动溶血空斑试验被动溶血空斑试验 第二十三页，共四十三页。3 3临床应用临床应用(y(y ngyngy ng)ng)与评价与评价溶血溶血(r(r n xun xu)空斑试验主要用于空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。机体产生抗体的能力。第二十四页，共四十三页。(三三)B B细胞抗体细胞抗体(k(k ngt)ngt)形成功能的形成功能的检测检测 酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法ELISPO

11、TELISPOT1.原理原理(yu(yu nl)nl)：第二十五页，共四十三页。2 2应用应用(y(y ngyngy ng)ng)与方法学评价：与方法学评价：该方法既可检测抗体分泌细胞，该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。又可检测抗体分泌量。优点：优点：稳定、特异、抗原用量少；稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导可同时检测不同抗原诱导(y(y udo)udo)的不同抗体分泌，的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。第二十六页，共四十三页。(四四)体内体内(t n(t n i)i)试验试验体内抗体产生的特异

12、性抗原有白喉类毒素、体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后免疫前及免疫后1 1周、周、2 2周、周、3 3周分别采血，周分别采血，分离血清分离血清(xu(xu qng)qng)，测定受检者免疫前后相，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内应抗体的效价，判断受检者体内B B细胞的细胞的功能。功能。第二十七页，共四十三页。染色染色(rns)(rns)计数计数离心离心(lxn)(lxn)取上清取上清测测LDHLDH或或AKPAKP离心离心

13、(lxn)(lxn)取沉淀取沉淀测活细胞荧光测活细胞荧光测发光强度测发光强度测测CPMCPM值值形态法形态法酶释法酶释法荧光法荧光法同位素法同位素法化学发光法化学发光法三、三、NK细胞活性测定细胞活性测定靶靶细细胞胞溶溶解解常用靶细胞常用靶细胞:K562细胞株第二十八页，共四十三页。二二 吞噬细胞吞噬细胞(tn sh(tn sh x x bo)bo)功能检测技术功能检测技术 按其形态大小分为按其形态大小分为(fn w(fn w i)i)两类：两类：大吞噬细胞大吞噬细胞单核单核-吞噬细胞系统吞噬细胞系统小吞噬细胞小吞噬细胞中性粒细胞中性粒细胞第二十九页，共四十三页。一、中性一、中性(zhngxn

14、g)粒细胞功能的检测粒细胞功能的检测 细胞趋化功能的检测细胞趋化功能的检测 吞噬吞噬(tnsh(tnsh)和杀菌功能的检测和杀菌功能的检测第三十页，共四十三页。(一一)细胞细胞(x(x bo)bo)运动功能运动功能趋化功能检趋化功能检测测1.1.原理原理(yu(yu nl)nl)：第三十一页，共四十三页。2.2.方法方法(fngf)(fngf)：琼脂糖平板琼脂糖平板(pngbn)(pngbn)法法 滤膜渗透法（滤膜渗透法（Boyden 小室法）小室法）第三十二页，共四十三页。(二二)吞噬吞噬(tnsh(tnsh)和杀菌功能测定和杀菌功能测定 1 1显微镜检查法：显微镜检查法：第三十三页，共四十

15、三页。2.2.溶菌法溶菌法第三十四页，共四十三页。NBTNBT还原还原(hun yun)(hun yun)试验试验 原理原理(yunl)：N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基（淡黄色）四氮唑基（淡黄色）甲臜（紫黑色）甲臜（紫黑色）3NBT还原(hun yun)试验 第三十五页，共四十三页。中性中性(zhngxng)(zhngxng)粒细胞粒细胞NBTNBT甲臜颗粒甲臜颗粒(kl)(kl)沉积于胞质中沉积于胞质中第三十六页，共四十三页。二、巨噬细胞功能二、巨噬细胞功能(gngnng)检测检测(一一)炭粒廓清炭粒廓清(ku(ku qng)qng)试验试验 正常小鼠肝中枯否细胞可

16、吞噬清除正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%10%炭粒。炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度据此给小鼠定量静脉注射印度(yn d)(yn d)墨汁墨汁(炭炭粒悬液粒悬液)，间隔一定时间反复取静脉血，测，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。清的速度，判断巨噬细胞的功能。第三十七页，共四十三页。(二二)吞噬吞噬(tnsh(tnsh)功能检功能检测测 巨噬细胞对颗粒性抗原物质巨噬细胞对颗粒性抗原物质(w(w zhzh)具有很强的吞具有很强的吞噬功能

17、，常用鸡红细胞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)(CRBC)、白色念珠菌、酵、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。第三十八页，共四十三页。(三三)巨噬细胞溶酶体酶的测定巨噬细胞溶酶体酶的测定(c(c d d ng)ng)1 1酸性磷酸酶的测定酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法硝酸铅法 偶氮法偶氮法2 2非特异性酯酶的测定非特异性酯酶的测定 常用常用(ch(ch n yn y n)n)-萘醋酸萘醋酸法法第三十九页，共四十三页。(四四)细胞毒作用细胞毒作用(zu(zu y y

18、 ng)ng)测定测定 用用IFN-IFN-激活小鼠巨噬细胞，观察其对激活小鼠巨噬细胞，观察其对125125I-UdRI-UdR标记标记(bioj(bioj)的的DBA/2DBA/2小鼠肥大细胞瘤小鼠肥大细胞瘤P815P815的杀伤活性。的杀伤活性。第四十页，共四十三页。(五五)巨噬细胞促凝血活性测定巨噬细胞促凝血活性测定(c(c d d ng)ng)激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固凝血活性因子，加速正常血浆的凝固(n(n nggngg)，为此取已经为此取已经3737预温的正常兔血浆和预温的正常兔血浆和CaClCaCl2 2混

19、合混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置置3737，即时记录血浆凝固时间。，即时记录血浆凝固时间。第四十一页，共四十三页。Thanks！第四十二页，共四十三页。内容(nirng)总结免疫细胞功能检测技术(jsh)。淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。T细胞（负责细胞免疫功能）。未转化和转化淋巴细胞的形态特征。PWM-T、B细胞。LPS -B细胞。肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力。可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量。体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。常用靶细胞:K562细胞株。二 吞噬细胞功能检测技术(jsh)。Thanks第四十三页，共四十三页。