REACH法规第四卷译稿-13说课材料.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。REACH法规第四卷译稿-13-B.10.诱变(性)体外哺乳动物染色体变异测定1.方法这种方法是对1997年进行的试管中哺乳动物染色体异常测定的（theOECDTG）的复制。1.1.引言体外哺乳动物染色体异常实验的目的是证实在人工培养的哺乳动物细胞（1）（2）（3）中能诱发染色体结构异常的媒质的存在。结构性异常存在两种方式：染色体异常，或者染色单体异常。大多数诱导有机体突变的物质会引起染色单体异常，但是染色体异常也会发生。多倍体的增加也可以证明一种化学物质有诱发染色体数目异常的潜力。然而，这种方法不是为

2、了测定数目异常而设计的，也不常用于此目的。染色体变异以及相关变化是很多人类遗传病的起因，并且有确实的现象证明染色体变异及其相关变化导致的体细胞中治癌基因和肿瘤抑制基因的变化与人类和动物样品的癌症反应有关。体外哺乳动物染色体异常实验要进行移植的细胞层，细胞株和初级细胞群的培养。所选用的细胞应从培养中的生长能力，染色体组型平衡能力，染色体数目，染色体多样性，和染色体异常的自发频率几方面进行挑选。在体外进行的测定通常需要借助于外加的代谢活化系统。在体外的测定条件下，不可能完全模拟出哺乳动物样品的新陈代谢系统。要小心控制条件，以避免无法表现内在诱变的阳性的结果出现，及PH值、同渗重摩、细胞内高毒素量（

3、）（）的增长。这个实验是用来辨认可诱导哺乳动物内有机体突变的物质和致癌物质。哺乳动物体内的致癌物质多数在这个测定中起正反应；但是此测定并不能完全测定出体内的致癌物。联系是建立在化学物质的种类之上的。不断的事实证明，那些用此测定未被测定出的致癌物是通过机械机制作用，而不是通过直接的DNA破坏来作用的。可参看综合引言B.1.2.定义染色单体变异：通过单个的染色单体分解和染色单体的重组表现的结构性染色体损伤。染色体变异：表现为同一位置的两条染色单体的分解，或者分解后又重组染色体结构损伤。核内复制：在DNA复制的一个S时期后，核没有进入有丝分裂，却开始另一个S时期的过程。结果是带有4，8，16，染色单

4、体的染色体的出现。缝隙：在一个染色单体范围内的最小程度的染色单体未对准错误。有丝分裂指数：细胞转位期在一个细胞群中被总的细胞数目所分隔开的比率；是对该细胞群的增生扩散程度的反映。数目异常：染色体数目相对于细胞正常数目的变化。染色多体：单倍染色体（n）的复制而不是双倍数染色体的复制（例如3n，4n等等）；结构性异常：可由显微镜观测到的有丝分裂细胞分化过程中的染色体结构变化，能观察到碎片，及内在改变或交换。1.3.实验原理细胞株要在有代谢活化作用和无代谢活化作用下与测定物接触。在细胞株与测定物接触后的一定预定时间间隔后，用中间体捕获物质（如Colemid或秋水仙素）处理，来捕获过渡期的细胞。过渡期

5、的细胞要在显微镜下分析其染色体异常表现。1.4.实验步骤1.4.1.准备1.4.1.1.细胞可选用各种细胞列，细胞株和细胞群包括人的体细胞（如中国鼠类的纤维原细胞、人类或其他哺乳动物淋巴中的淋巴细胞）。1.4.1.2.介质和培养条件应采用合适的培养媒介及培养条件（培养皿，CO2浓度，温度及湿度）来保存细胞群。需在染色单体数目的稳定性和是否存在支原体污染两方面对选定的细胞列和细胞株进行定期测定。如已被支原体污染，应不再选用。应该知道正常的细胞存活周期及存活条件。1.4.1.3.培养准备选定细胞列和细胞株：从普通的细胞群繁殖细胞，在培养媒介中，以一种在采样前不会产生细胞群混合的浓度和370C的条件

6、下进行培育。淋巴球:血液用抗凝结剂（如肝磷脂）进行处理，后将从建康体中分离出的淋巴球中加入含有分裂素（如植物血球凝集素）的培养基，并在37下培育。1.4.1.4.新陈代谢活性细胞应在存在代谢活性和不存在代谢活性的条件下与测定药物接触。最常用的活化系统是经诱导酶介质处理的，从啮齿类动物肝脏制备的cofactor-supplementedpost-motochondrialfraction。所用的诱导酶介质如Aroclor1254（6）（7）（8）（9）获苯巴比酮与萘黄酮（10）（11）（12）的混合物。在最终的测定媒介中，末段线粒体片段常被应用于浓度范围110%v/v之间。代谢活化系统的条件决定

7、于被测定的化学物质。在某些情况下，可以不止一种末段线粒体浓度被选用。数目的增长，包括能表达特殊活化作用的酶的经遗传得到的功能性细胞的构造，可以提供潜在的内部活化作用。应按科学的方法调整对细胞列的选择（如根据细胞色素P450同功能酶对测定物的新陈代谢的适应度）。1.4.1.5.测定物质/准备固体测定物质应该在合适的溶剂或媒介物中被溶解或形成悬浊液，如果高于细胞处理浓度应进行稀释。液体测定物可直接加入测定体系或稀释到高于处理浓度。测定物应是新鲜制成的，除非有确切的实验数据证明储存物的可用性。1.4.2.测定条件1.4.2.1.溶剂/媒介物溶剂/媒介物不应该与待测物发生化学反应，并与细胞的存活和S9

8、的活动相协调。若选用的不是常用的溶剂或媒介物，其成分要有具体的数字表明其的可用性。能用水作溶剂或媒介物的，应首先考虑水。当测定的是对水不稳定的物质时，应首先考虑有机溶剂或媒介物。可用分子筛除去水。1.4.2.2.暴漏浓度在决定最高浓度时，应对标准中的细胞毒素，在测定系统中的溶解度，PH值的改变或同渗重摩效应进行考虑。在用细胞完整性和成长程度作为表征的主要实验中，细胞的毒性，需要由在代谢活化作用和无代谢活化作用下的实验数据共同确定。如细胞合并的程度，成活细胞数，或有丝分裂指数。它对于初步实验中细胞毒性和溶解性的确定是非常有用的。至少应选用三种测定浓度。在产生细胞毒素的地方，浓度范围应从产生最大毒

9、性到产生最小或不产生毒性。这常意味着各浓度间相差从2到间的一个值。在收集观测细胞时，最高浓度的测定条件在细胞的合并程度、细胞数、有丝分裂指数上表现出明显的降低（降低幅度大于50%）。有丝分裂指数是对细胞毒素效应/细胞抑制效应的间接测量实验数据，它决定于处理后的时间。但是，对于其它毒性测定方法较麻烦或不可行的悬浊液体系，有丝分裂指数是适用的。有关细胞循环动力学的实验数据，如平均产生时间（AGT），能够被用作补充信息。但AGT仅仅是总体的平均值，不能揭示延迟产生的细胞的存在，并且其微小的变化不能与细胞最佳异变时间的延迟相联系。对于相关的无毒性物质，最大测定浓度是5l/ml，最低测定浓度是5mg/m

10、l，或0.01M。对于相关的不溶物，比不溶浓度低的浓度无毒性，所选用的最高级量应比处理末期其在最后媒介物中的溶解度高。在某些情况下（如仅仅在比最低不溶浓度高时产生毒性），应该在不止一种浓度下进行测定。在处理之初和结束时估计溶解度是有用的，因为由于细胞，S9，血清等的存在会使浓度在测定系统接触于空气的过程中发生改变。肉眼即可观测到不溶现象。沉淀物不应干扰实验数据。1.4.2.3.阴性和阳性对照并发的阳性和阴性（溶剂或媒质）对照，既要在存在代谢活性又要在不存在代谢活性的条件下进行，每一次实验都要采用。当代谢活性系统被运用时，阳性对照化学物质应该是要求活化才能产生诱导有机体突变物质的。阳性对照应借助

11、于已知的断裂剂，再接触的水平上有望在支配测定系统灵敏度的背景下产生明显的增长。应选择阳性对照浓度，从而得到清晰的效果又不直接向读者揭示编码变化的特性。阳性对照物的例子包括：新陈代谢活化条件物质CASNO.EINECSNO.无外部代谢活化系统甲基磺酸盐66-27-3200-625-0乙基磺酸盐62-50-0200-536-7乙基亚硝基脲759-73-9212-072-2丝裂霉素C50-07-7200-008-6N-氧化物-4-硝基喹啉56-57-5200-281-1存在外加代谢活化系统苯并芘50-32-8200-028-5环磷酰胺环磷酰胺一水化物50-18-06055-19-2200-015-4

12、环其他适合的阳性对照物也可使用。化学等级的阳性对照物如果有效，也可考虑。阴性对照，由单独的溶剂和媒介物形成的实验介质，要和实验培养基一样处理，每次收集时都应包括在内。此外，未处理对照也应当被使用，除非控制过程的历史实验数据表明所选溶剂无毒副作用，也不会发生任何突变。1.4.3.实验步骤1.4.3.1.测定物处理在新陈代谢活化系统存在和不存在情况下，分别以测定物对增殖细胞作用。刺激有丝分裂后约48小时开始淋巴细胞测定。1.4.3.2.在不同浓度培养基下重复培养。强烈建议使用逆向溶剂控制。能证实两次重复培养之间的历史实验数据的变化最小变化（13）（14），其他的适当阳性的对照物质可能被用。化学药品

13、应该被考虑的阳性对照,当可得的.此实验数据即可用于各浓度的单次培养。气态或挥发性物质应采用适当方式测定，如在密封的培养皿中进行（15）（16）。1.4.3.3.培养物收集时间在第一个实验中，无论有无新陈代谢活性，细胞均应接触在测定物中36小时。实验开始后（12），每个约1.5个正常细胞周期取一次样。如果在有无活化剂的情况下，取样结果都是逆向的，就需要在无活化的条件下再做一次。连续处理直至取样周期等于1.5个正常细胞周期。某些物质更容易在处理/取样周期长于1.5个细胞周期是被测定出来。新陈代谢活化条件下的逆向结果应在各次测定结果上加以证实。在无必要进行逆向测定结果确定的情况下，应给出正当的理由。

14、1.4.3.4.染色体的准备有秋水仙素或秋水酰胺处理的细胞培养物一般在13小时即可收集。为了准备染色体，每份细胞培养物应单独收集、处理。染色体的处理包括细胞低渗处理、固定、染色。1.4.3.5.分析所有的固定切片包括阳性和阴性对照，都应该在显微镜分析前进行独立的分析。因为固定的过程，经常带来一定量的中期细胞的分裂和染色体的丧失。标记的细胞因包含很多中心小体，数目几乎与所有细胞类型样式数相当。至少每单位浓度和对照的200个好的细胞经过中期是应被标记；如果正确的话，能被所有复制品均匀的分开。当更多的异变发生时，这个数目会下降。尽管测定目的是测定结构性染色体变异，如果细胞内发生多倍体复制现象，进行记

15、录也是很重要的。2.实验数据2.1.结果的处理测定的单位是细胞，因而应该评估发生结构性染色体变异的细胞的比率。不同类型的结构性染色体变异应同时列出数目、实验频率、对照培养品。裂缝应单独记录，一般不包括在总的变异频率中。还应记录所有阳性和阴性对照中的培养物的细胞毒素量。应提供单个培养物的实验数据。此外，所有实验数据应以表格的形式总结。没有必要对一个清晰的阳性反应进行证明。不确定的结果将在以后的实验中通过精确的改善实验条件而被证实。阴性结果证明的必要性已经在1.4.3.3中讨论过了。扩大确定条件的分类而对研究参数的纠正应该在随后的实验中考虑。应该纠正的研究参数包括浓度、时间间隔、新陈代谢活化条件。

16、2.2.结果评价与分析这里有许多确定的阳性结果的标准，向相关的浓度增加或带有染色体变异的细胞数目的复制性增加。应首先考虑生化关系。统计学方法被用来评估测定结果（3）（B）。但统计学的意义不应该作为判断阳性结果的唯一因素。多倍体细胞数目的增加可以表明测定物质有抑制有丝分裂和引发级数式染色体变异的潜能。细胞内染色体复制的细胞数目的增加，可以证明实验物质有抑制细胞循环进行的潜能（17）（18）。在这一个系统中，结果不符合上述的标准测定物质被认为是非诱导有机体突变的物质。虽然大多数的实验将会给出清楚的阳性的或阴性的结果,但在极少的情况下数据将不能对所测定物质的活性做出明确的判断。无论测定重复进行了多少

17、次，结果仍保持意义不明确的或可疑的。染色体变异测定中阳性的结果指出测定物质导致人工培育的哺乳动物的体细胞内染色体结构变异。阴性的结果指出,在测定情况之下，测定物质不导致人工培育的哺乳动物的体细胞内的染色体变异。3.实验结果报告测定结果报告测定结果报告必需包括下列各项信息:溶剂/媒介物:- 选择媒介物的理有;- 测定物质在溶剂或媒介物中的可溶性和稳定性,如果已知;细胞:- 细胞的类型和来源;- 被用细胞的染色体类型特征和合适性;- 没有支原体，如果适用;- 细胞的周期长短的信息：- 被采血者的性别,全血或分开的淋巴细胞，使用的有丝分裂原- 各种方法的数量,如果使用;- 细胞培养基的保养方法,如果

18、使用;- 染色体类型的数目。测定条件:- 中期发现物质的识别特征，它的密度和细胞接触的忍耐力;- 选择密度和所涉生物物种的数据，例如：细胞毒性的数据和可溶性限制,如果可得的;- 培养基的结构,二氧化碳的集中度，如果可得;- 测定物质的集中度;- 媒介物和所加的测定物质的量;- 孵化温度;- 孵化时间;- 持续处理;- 在播物种的细胞密度,如果合适的;- 变化的活动系统的类型和组成,包括可接受标准;- 阳性的和阴性的对照组;- 准备胶片的方法;- 变异的标准;- 数字分析;- 毒性测量的方法;- 判断研究是阳性的或阴性的标准；结果; 毒性的标志,例如交流汇合的程度，细胞周期的数据,细胞计数,有丝

19、分裂; 沉淀的标志; 在pH和处理介质上的数据,如果可决定的; 变异的定义,包括缝隙; 染色体变异的细胞的数目和染色体变异的类型，这些根据对照组的物种类的不同分开来给出; 倍性的变化，如果可以看到; 剂量回应的关系,在可能的地方; 如果有，就进行统计分析; 并发事件阴性(溶剂/媒介物)和阳性对照数据; 历史上的阴性(溶剂/媒介物)和阳性的对照组数据,藉由范围和方法和标准偏差。结果的讨论。结论。4.参考文献Evans,H.J.(1976).CytologicalMethodsforDetectingChemicalMutagens.In:Chemicalmutagens,Principlesan

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