也说说体外诊断试剂标准品、校准品、质控品那些事（9）.docx

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1、也说说体外诊断试剂标准品、校准品、质控品那些 事（9）第九篇纷繁复杂的企业参考品上一篇讲了质控物/品,这一篇来说说企业参考品。企业参考品在试剂盒 的研发中处于比较重要的分量，关系到试剂盒开发的质量和整体进度。企业参考品往往有以下几个用途：产品研发环节，用于原材料选择和 确定，产品反应体系、反应条件的确认和优化，产品生产工艺的确认和优化; 产品生产环节，依据体系文件的规定，使用企业参考品的全套或部分，用 于产品放行；产品注册报批或上市后监督抽验环节，在没有国家标准品、 国家参考品的情况下，依据产品技术要求，厂家可以使用企业参考品进行型 式检验；使用环节，可以提供给用户用于方法和产品的选择、验证或

2、确认, 检验结果质量控制等。关于企业参考品，有以下几点想要阐明：一、企业参考品一般是对定性产品而言的我们往往将定性产品的质控物质称为参考品，这是有历史缘由的，在 第一篇里提到，WHO对定量测定倾向于使用标准品一词，对定性测 定侧重于使用参考品”这个术语。二、企业参考品与试剂盒里的质控品不是一定性试剂盒里往往还带有质控品/对照品，本文所说的企业参考品不是 指这些质控品/对照品，两者的用途不一样。试剂盒里的阳性质控品、阴性 质控品一般用于结果判定或试验有效性的判断，例如某乙肝表面抗原试剂 盒（ELISA方法），试剂盒里有阴性质控品和阳性质控品，其用途在说明 书里有明确规定，每一板实验，都要加质控品

3、，说明书结果判定项下 有4点规定”试验有效性：阳性对照孔平均值21.00 ；阴性对照平均值 0.10 ;临界值计算：临界值二阴性对照孔平均值+ 0.15 ;阴性判定： 样品OD值临界值为乙肝表面抗原阴性；阳性判定：样品OD值2临 界值为乙肝表面抗原阳性。再举例某新冠病毒核酸检测试剂盒（荧光 PCR法），试剂盒里有阳性对照和阴性对照各1支，随样品参与核酸提 取、扩增过程，在结果判读栏规定“阴性对照各检测靶标应无Ct值，阳 性对照各检测靶标Ctw30,需同时满足，否则本次实验无效。PCR试剂盒通常还会有内标（Internalcontrol , IC ） 0内标是指在同 一反应管中与靶序列共同扩增的

4、一段非靶序列分子。内标与企业参考品、 上述提到的试剂盒里的阳性、阴性质控品/对照品也不是一回事。内标的最 大特点是与靶序列共同扩增，可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量 控制。而其他的质控品处理过程与样品一致，都是独立扩增。内标有两种 形式，一种是使用天然样品中含有的内参基因作为内标，另一种是人工添 加的内标。企业参考品是对产品的各项性能进行确认或验证的质控品，IVD产品 的性能包括正确度、精密度、灵敏度、特异性、检测范围等各项指标，所 以参考品的组成往往不是一只，是一个panel。三、企业参考品的研发是IVD试剂盒研发的一部分企业参考品的用途是全面评价和确认产品的各项性能，发挥标尺、祛码作

5、用，是IVD研发、生产及应用全过程中进行产品安全有效性评 价的必备核心耗材。在研制试剂盒的同时，一般没有现成的参考品，研发人 员要根据所研制的试剂盒的方法原理、预期用途、拟达到的性能指标以及研 发计划和节点安排，进行企业参考品的设计和实施。因此，企业参考品的研 发是IVD试剂盒研发的一方面，有的时候，可能花在企业参考品研制上的 成本和时间不会比试剂盒本身要少。以新冠病毒检测试剂为例，研发时需要 做交叉反应的确认，包括与其他人类冠状病毒、甲流和乙流各种流感病毒、 呼吸道各种病毒、肠道各种病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、相关细菌和真 菌的交叉反应，据了解，这些毒株、菌株的可获得性成为新冠产品研发中的

6、 重要和关键的环节。再例如，肿瘤相关突变基因检测试剂，其参考品的研制 也比较复杂，包括来源（例如临床样本、永生化细胞系、基因编辑细胞系、 基因工程构建产品、质粒），基因及突变位点、突变类型、片段长度、突变 频率的设计，参考品的制备（例如细胞克隆、核酸提取、纯化、制备）、定 性鉴定和表征、定量测定等等都是系统性的复杂工程。四、企业参考品设计时应遵循的一些原则企业参考品的设计应客观合理，应能充分评价产品的质量，帮助发现产 品在设计或者生产中的一些缺陷和问题，这是根本目的，这样可以避免在临 床试验阶段甚至上市后才发现问题，从而少走弯路。在实际工作中，会经常 有同仁问道：阳性参考品是3支就满足要求，还

7、是5支满足要求？全用质 粒或细胞系可以吗？不覆盖所有的型别，可以吗？其实对于这些问题，我们 要深刻认识到企业参考品相当于是对产品考评的考卷，如果你想产品60分 就ok ,那可以只出满分是60分的考卷，如果你想产品到90分以上，那你 可以出100分的试卷。企业参考品通常包括阳性参考品、阴性参考品、精密度参考品、检出 限参考品等。在企业参考品的基质选择上，企业参考品的基质应可能与临 床被检样本相同或接近（例如血清、血浆、组织切片）。阳性参考品主要评估产品的敏感性，应具有代表性、满足临床样本的 分布类型、遗传标记代表性，应包括强阳性参考品、中等阳性参考品、弱 阳性参考品，其中应以中等阳性参考品为主。

8、如被测物包括不同的型别及 亚型，一般情况下应覆盖。阴性参考品主要评估产品的特异性，阴性参考品除了有不含被测物的 正常患者样本外，还应设置一定数量的含有可能会产生交叉反应物质的样 本，包括分析物的结构类似物、具有同源性序列的核酸片段、易引起相同 或相似的临床症状的其他病原体、采样部位正常寄生或易并发的其他微生 物等。建议还应设置干扰评价的参考品，如常见的内源性干扰物质、常用 药物及其代谢物、样本添加剂等。重复性参考品一般设置包含中阳性和弱阳性至少两个浓度水平的参考 品。检出限参考品是评价产品检出能力的重要工具，对于定性产品尤为重 要。检出限参考品的浓度水平可采用90 95%阳性检出水平或略高于试

9、剂 盒检出限的水平，如100%阳性检出水平。五、企业参考品制备企业参考品制备一般包含以下过程：原材料来源：样本来源途径，企业可以自行收集并建立，也以购 买商业化盘，可以委托专业机构进行定制；定性表征：化学结构、组份或生物学特征的确证，例如抗原性分 析、免疫原性分析，生化分析、基因序列测定，肽图、活菌计数、效价（效力）试验、纯度试验等； 处理加工过程：过滤、灭活、添加、调整、配制、分装等； 定值过程：应使用适当的方法或金标准方法对被测物的浓度、滴 度、效价、突变频率、DNA含量等进行确认； 稳定性研究：要对保存期稳定性、使用稳定性（开瓶、冻融等） 等进行研究，确定效期。企业要建立自己的参考品，并

10、固定化下来。举例来讲，对于定性试剂 盒而言，检出限这个指标非常关键，因此检出限参考品的合理设置也就显 得尤为重要，但在实际工作中，我们会发现有的企业设置该参考品时不太 科学，往往随意选择一个临床的强阳性样本，然后进行倍比稀释，对系列 稀释的参考品进行检测，直至检测到结果为阴性，并将上一个稀释度参考 品设置为检出限参考品，这样并不能清楚的确定参考品中的被测物的具体 浓度（或滴度、效价等），从而也无法保持参考品批次间的一致性。相对于定量试剂，定性试剂显得更为多样和复杂，体现在企业参考品 也是如此。企业在参考品的设计、制备上，考虑的因素也比较多，既要考 虑合规性、科学合理性、技术可行性、现实可获得性，又要结合产品上市 注册的进度、经济成本等因素，所以还是需要总体平衡、统筹安排的。但 无论如何，大家都要记住一点，那就是不要忘了我们做企业参考品、质控 品、标准品的初心：为IVD产品质量控制保驾护航。