免疫组化真题.docx

《免疫组化真题.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《免疫组化真题.docx（10页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、免疫组织化学考题2004级考题1 简述原位杂交组织化学的基本原理。P84.简述免疫组化染色ABC法的基本原理。P522 .组织块进行固定的原理是什么?常用的固定方法和固定剂有哪些?P10.何为细胞培育术?举例说明其在生物学医学讨论中的应用.3 ,细胞凋亡的形态学检测方法有哪些？4 .何为色温?在显微摄影中常用日光型胶片在灯光下拍照,您将用何种方法调整色温?P1847,何为像素？在数码摄影中常考虑的参数是什么？ P136;P1988 .酶标抗体免疫细胞化学间接法的基本原理是什么？此法的优缺点是什么？按此方法选择 抗体时应留意什么问题？ P51.结合本专业的讨论方向，自行设计一个双重免疫荧光细胞化

2、学染色的试验，并写出试验流 程，简述免疫荧光细胞化学染色中的留意事项。9 .学过此门课程后有何感想？为使此课程开设的更好，请留下您珍贵的意见和建议。2007级考题.简述形态学讨论有哪些主要常用技术？这些技术能解决哪些问题？1 .试述石蜡切片和HE染色的基本制备过程，并指出制备免疫组化的石蜡切片和用于HE染 色的石蜡切片有何不同。Pll;P207;P208.上课留的作业2 .何谓免疫荧光染色，用何种方法消退非特异荧光？ P44;P74.ANN VASSAY检测细胞凋亡的原理、试验流程和结果分析。答：原理：主要是依据细胞凋亡过程中的形态特征转变，细胞膜的转变是这些特征中较早消 失的一种。在凋亡细胞

3、中，细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外 侧。Annexin-V是一种35-36KD的钙离子依靠的磷脂结合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。 细胞凋亡时，可以和外翻的PS结合，从而可以检测凋亡的细胞。发生死亡的细胞其细胞膜 上的PS也外翻，因而也会阳性。因此，还会加一种DNA染料，常用的有P1。由于死亡的 细胞膜通透性增高，染料可以进入细胞内和DNA结合，从而可以发荧光，区分出死细胞。 试验流程：1)细胞收集：悬浮细胞直接收集10ml的离心管中，而贴壁细胞先用滴管轻轻 吹打。凋亡细胞一经吹打可能脱壁,收集到10ml的离心管中，没脱壁的细胞用0.02%的EDTA 消化使之脱壁，

4、每样本细胞数为(1-5) X106, 5001000r/min离心5min弃去培育液。2) 用孵育缓冲液洗1次，5001000i7min离心5min。3)用100 口 1的标记溶液重悬细胞，室温 下避光孵育1015min。4) 500光00r/min离心5miri沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。5)加 入荧光溶液4c下孵育20min,避光并不时振动，上机检测。6)流式细胞仪分析：流式细 胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm透带滤器检测FTTC荧光,另一波长大于560nm 的滤器检测Pl。结果分析：凋亡细胞对全部用于细胞活性鉴定的染料如Pl有抗染性，坏 死细胞那么不能。细胞膜有损伤的细胞

5、的DNA可被P1着染产生红色荧光，而细胞膜保持完 好的细胞那么不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期P1不会着染而没有红色荧光信 号，正常活细胞与此相像。6何谓像素？简述数码相机摄影的基本原理。P198.影响曝光的因素有哪些？什么状况下使用光圈优先？什么状况下使用快门优先？什么状 况下考虑胶片的感光度或相当感光度？ P1807 .谈谈你学习这门课的感想和体会？并提出对这门课的建议。作业：设计一个自己讨论领域的小试验(方法要有免疫组化技术)标本的保存和固定：未染色培育细胞可常规冻存。不需排解死细胞可进行染色前固定。假设要 排解死细胞、染色后长时间存放、或标本具有传染性，需要染色后固定。阴性比

6、照细胞非染色细胞：直接染色法时，用PBS代替荧光单克隆抗体。间接染色法时，PBS代替第一 抗体和荧光其次抗体。同型比照：非特异性抗小鼠膜外表免疫球蛋白（Mslg）代替特异性单克隆抗体。选择与试 验用单克隆抗体亚类全都的Mslg,即MsIgG或MsIgMo直接染色法时，荧光结合Mslg代替荧光单克隆抗体。间接染色时，无荧光Mslg代替第一抗体。要求：1 .要解决的问题.技术必需有免疫组化技术2 .预试验结果L简述广义的组织化学均包含那些主要采纳技术？这些技术能解决科研中的哪些问题？ 广义的组织化学包括传统的组织化学，免疫组织化学、电镜组织化学、免疫电镜组织化学和 原位杂交组织化学。组织化学用于检

7、测细胞内核酸脂类糖类和酶类等应用很广。免疫组织化 学由于特异性强敏感度高所以应用广泛，但凡组织或细胞中能作为抗原或半抗原的物质，如 蛋白质，多肽氨基酸多糖磷脂受体酶急速核酸记病原体都课用相应的特异性抗体进行检测， 因此成为生物医学各学科领域的重要讨论手段。电镜组织化学主要用于检测一些酶的活性及其在超微结构的定位虽然目前酶的种类超 过2200余种蛋电镜只能观看100种，其原理是酶组织化学反响过程，酶底物反响的特异性, 捕获反映（金属盐城点发嗜钺性物质生成法。免疫电镜是依据抗原与抗体特异性结合的原理,采用电子密度标记抗体或经免疫化学反响能 产生高电子产物的标记抗体在超微结构水平对抗体进行定性定位。

8、原位杂交是将分子杂交技术与组织化学相结合而在核酸原有的位置上进行细胞内核酸定性 定位的一种技术。更多用于定位细胞内mrna它可为讨论单一细胞中编码各种蛋白质和多肽 （前体）的相应MRNA定位以及讨论细胞内基因表达有关因素的调控供应有效地手段此外 像遗传学病毒学神经内分泌学病理学免疫学及发育生物学等个领域2.试述石蜡切片和HE染色基本制备过程？并指出制备免疫组织石蜡切片和HE染色的石蜡 切片有何不同？石蜡切片基本制备：取材，固定，脱水，透亮，透蜡，包埋，切片，贴片，染色,透亮，封藏。取材：材料的好坏直接影响到切片的质量，取材时给定位麻醉药量适中，去组织是尽可能不 损伤所需部位取材必需新奇，这一点

9、对于从事细胞生物学讨论尤为重要,应当尽可能割取生活着的组织块, 并随即投入固定液。切取材料时刀要锋利，避开因挤压细胞使其受到损伤。切取的材料应当小而薄，便于固定剂快速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5 X5mm2o固定：常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铭酸、重倍酸钾和钺酸。其中，苦味 酸、升汞、铭酸既能凝固细胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能 凝固核蛋白；甲醛、饿酸和重铭酸钾对这两种蛋白质都不凝固。简洁固定剂的局限性较大，如将其适当混合，制成复合固定剂可以取得更好的效果。常用的 混合固定剂有：Bouin液（70份苦味酸饱和水溶液+25份4%甲醛+5份冰

10、醋酸）、Zenker液 （升汞5g+重铭酸钾2.5g+硫酸钠1.0g+5ml冰醋酸+100ml蒸锦水）、Carnoy改良液（3 份无水乙醇+1份冰醋酸）等。固定剂的种类甚多，我们必需依据各种固定剂的性能及制片 的不同要求来加以选择。固定时，须留意以下几点：（1）固定剂应有足够的量，一般为组织块体积的1015倍。（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物质，可将材料先在含乙醇的溶液中固定几分钟， 再移入水溶性的固定液。（3）材料固定后如不马上下沉，可将其中气泡抽出。（4）固定时间依材料大小、固定剂种类而异，可从1小时到儿十小时，有时中间需要更新 固定剂。某些固定剂对组织的硬化作用较强，作用时间应严加

11、掌握，不能过长。（5） 一般固定剂都以新配制的为好，用过的不能再用。有些混合固定剂由甲、乙两液合并 者，肯定要在使用前才混合。（6）固定完毕，依据所用固定剂的不同，用水或乙醇冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成 沉淀，影响以后组织块的染色。3 .脱水生物组织中含有大量的水分，它和石蜡是不能相溶的，致使在包埋时石蜡无法渗入组织内部, 因此须使用脱水剂将水分除尽，这就是脱水的作用。脱水剂必需能与水以任何比例相混合。脱水剂有两类：一类是非石蜡溶剂，如乙醇、丙酮等, 脱水后必需再经过透亮，才能透蜡包埋；另一类是兼石蜡溶剂，如正丁醇，脱水后即可直接透蜡。常用的脱水剂是乙醇，由于它价格廉价，易于得到。为了避开

12、猛烈的集中引起的组织的猛烈 收缩，脱水步骤应从低到高以肯定的浓度梯度来进行，一般组织从30%乙醇开头，经过50%、 70%、80%、95%、100%至完全脱水；对于一些松软的组织应从15%开头。脱水时间依据 组织的类型和大小而定，一般各级乙醇中放置45min到lh,假如中间须停顿，应使材料停 留在70%乙醇中，由于低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放 置时间不能过长，此外，脱水必需在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇汲取空气中水分导致 浓度降低而使脱水不彻底。需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存, 可加入等量的甘油。丙酮也是很好的脱水剂，其作用和用法与乙醇

13、相同，不过其脱水力和收缩力都比乙醇强。 甘油常用于藻类、菌类及柔弱材料的脱水。二氧六环为无色的石蜡溶剂，对组织没有收缩及硬化等不良后果，但其蒸气有毒，使用时须 留神。正丁醇可与水及乙醇混合，亦为石蜡溶剂，其优点是很少引起组织块的收缩与变脆。 叔丁醇的性质、作用和用法同于正丁醇，但因其价格昂贵而很少使用。4 .透亮组织块用非石蜡溶剂脱水后必需经过透亮。透亮剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺当地渗入组织。透亮剂的种类许多，较常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。二甲苯作用较快，透亮力强，但组织块在其中停留过久，简洁收缩变脆变硬，同时假设脱水不净，就会引起不良后果，

14、在应用时必需特殊留神。通常将组织块先经纯乙醇与二 甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，这样可削减上述的缺点。透亮时间应由组织大小而定，一般各级停留时间在30min至2h,在纯二甲苯中应更换2次，总时间那么以 不超过3h为宜。材料经过透亮，会显示出前一步脱水的效果如何，假设脱水彻底,组织那么显现透亮状态，如组织中有白色云雾状，说明脱水不净，须返工处理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透亮时，应避开其挥发和汲取空气中的水分,并保持其无水状态。20 甲苯的一般性质与二甲苯相像。用法亦同，唯沸点较低，透亮较慢，但不会使组织变脆。苯的用法同于二甲苯，对组织的收缩作用小，但须警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯

15、仿适于 大块组织的透亮。5 .透蜡和包埋包埋用的石蜡，熔点在5060之间，应依据材料本身的硬度、切片的厚薄和当时的气温 条件来选用。一般动物材料最常用的石蜡熔点为5256C,植物材料的用5458c的；切 片薄的用5860的，切片厚的那么用5254的；室温1019时选用5254。的石蜡可 顺当切片，冬季可用熔点4648c的石蜡，夏季可选5658的。石蜡的优劣与切片的成败亲密相关。鉴别石蜡质量的方法是：将石蜡熔化后倒入纸盒使其凝 聚且无气泡和裂痕，3035放置24h且无气泡和不透亮的晶状小点消失，蜡块裂面不呈颗粒状，切成薄片不碎成细粒。这种石蜡即为品质优良。含有杂质的新蜡或用过的 废蜡可清洁后再用

16、，方法是将石蜡放入锅内，加热到开头冒白烟，然后用小火连续加热30min (留意别超过发火点)，使其去除水分和挥发性杂质，并在温箱中过滤以去除灰尘等颗粒。透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调整至高于石蜡熔点3度，使经过透亮的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。纯石蜡应处理23次，透蜡的时 间依材料性质而定，一般每次需1530min。透亮的关键是掌握温度的恒定，切忌忽高忽低，温度过低石蜡凝固无法渗透，温度过高使组织收缩发脆。包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。详细做法是；先预备好纸盒(详细折法见图1-3及 说明)，将熔蜡倒入盒内，快速用预温的镀子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再

17、轻 轻提起纸盒，平放在冷水中，待外表石蜡凝固后马上将纸盒按入水中，使其快速冷却凝固， 30min后取出。包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度，保证组织块与四周石蜡完全融为一体。石蜡的快速冷却 也很重耍，否那么包埋块中将会产生结晶。以后切片时引起碎裂。6 .切片(1)石蜡块的固着与整修在包埋以后，就可进行切片。包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修。 固着:一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的金属小盘，这也可用同样大小的台木替代。 用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上，并使组织块朝外，便于以后快速切出所需的片子。 整修：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，常保

18、存组织 四周附着宽23mm的石蜡，而修好的蜡块呈长方形。还可削去一角以便于在蜡带上识别 切片。(2)切片机和切片刀切片机是用来作各种组织切片的一种特地设计的精密机械，常用的是旋转式切片机，它的夹 物局部是上下移动前后推动的，而夹刀局部那么固定不动。主要部件是安装切片刀的刀台、安 装包埋块的标本台和掌握切片厚度的微动装置。切片时切片刀固定不动，转动转轮，标本台 上下运动并按调好的切片厚度向前推动肯定的距离，组织块上下运动一次，便在刀片上得到 一张合乎厚度要求的切片。切片刀与切片的质量直接相关。切片前必需磨刀，方法是：将切片刀装上刀柄、刀背夹、滴 少许石蜡油在平滑的磨刀石上，将刀贴着磨刀石以背向刀

19、口方向磨，使用完毕后应准时用二 甲苯将石蜡油擦净。(3)切片方法切片前，将刀口置放大镜下观看，选择刀口平整无缺刻的局部来进行切削。将所要切的包埋 块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。将刀台推 至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15。左右的夹角， 包埋块上下边与刀口平行。在微动装置上调整切片要求的厚度，调整时应留意指针不行在两 个刻度之间，否那么简洁损伤切片机，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触, 这时就可以开头切片了。方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子, 并托住切下的蜡带，待蜡带形成肯定长度后，

20、右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起, 平放于衬有黑纸的纸盒内，留意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应匀称，防止切片机震惊 厉害引起切片厚薄不匀称，还应留意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。切片完毕, 应准时用氯仿将切片机的有关局部擦净。7 .贴片切好的切片必需贴附于载玻片上才能作进一步处理，但是切片常有细小的横纹，必需经展平 后才能贴附，否那么影响染色和观看。贴片一般有捞片法和烫板法。捞片法比拟简洁，首先将切片分割开，投入到48的温水浴中，这时切片都浮在水面上， 由于外表张力的作用使切片自然展平，然后用涂有甘油蛋白溶液（将鸡蛋一个打破入杯中， 去除蛋黄留下蛋白，用筷子充分调打成雪花状

21、泡沫，然后用双层纱布过滤至容器中，加入等 量的甘油，混合，最终加入百分之一体积的麝香草酚（thymol）作防腐用，可保存几个月到 一年。）或5%明胶水溶液的载玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合 适位置，于室温下放置一昼夜后使其彻底干燥。烫板法，是将涂有粘片剂的载玻片上涂上水，把已分割好的切片贴上去，再置载玻片于35c 恒定的烫板上让切片摊干，并倾斜或用吸水纸吸去水分，最终将载玻片再度放烫板上晾干。 要留意，不管是使用捞片法还是烫板法，所用的载玻片必需干净，不能有油污（检验法：已 涂有粘片剂的载玻片上滴加数滴蒸储水，假设觉察水不匀称分散而聚成滴状，即表示载玻片不 清洁，有残留油

22、脂等物在上面）；切片的光面应朝下，否那么染色过程中切片简洁脱落。8 .染色石蜡切片苏木素一伊红染色法的基本步骤：（1）二甲苯I-15分钟,（2）二甲苯II一- 10分钟，（分 无水酒精I2分钟, （4）无水酒精n-2分钟，（5） 95%酒精2分钟,（6） 80%酒精2分钟,（ 7）自来水洗片刻，（8）蒸储水片刻，（9）苏木素液染核一5分钟，（10）自来水洗片 刻，（11） 1%盐酸酒精分化-0.5分钟，（12）流水冲洗片刻，（13）弱氨水水溶液反蓝 一一1分钟，（14）流水冲洗一15分钟，（15）复染0. 5%伊红水溶液（比照染色）- -7分钟，（16）自来水洗（分化伊红）片刻，（17） 95

23、%酒精I-2分钟，（18） 95%酒 精II-2分钟，（19）无水酒精I-2分钟，（20）无水酒精n-2分钟，（21）二甲苯I _一_5分钟（22）二甲苯H-5分钟，（23）盖玻片下封固。免疫组化的石蜡切块所需的石蜡必需是滴熔点的石蜡防止破坏组织的抗原性。免疫组化染色 是用一抗与被检测组织中目的蛋白抗原结合，然后HRP等标记的二抗与一抗进行结合，最 终通过DAB显色反响，进而确认所要检测蛋白抗原的定位、半定量等目的。2、HE染色是用苏木素和伊红分别染上胞核和胞浆，可以区分出一般细胞的形态，在实际 应用中可以鉴定组织细胞坏死、水肿、变性和炎性细胞浸润等特别病理学转变，在临床上是 诊断恶性肿瘤和肿

24、瘤的很好的方法。3、免疫组化染色和HE染色的不同之处可能是HE染色比拟粗略地识别不同细胞形态学转 变；而后者能够针对特异性细胞标志物来检测特异性细胞的转变（数量）、也可检测细胞内 细胞因子的转位（如active-caspase3和cleaved-caspase3的胞核和胞浆分布状态）、组织中一 些特异性蛋白的表达的量转变（通过图像分析系统分析颜色深浅、分布的面积等综合分析）。 3.何谓免疫荧光染色常用的免疫荧光素有哪些？请列出两种能与DNA结合的荧光素？三种 与蛋白质结合的荧光素，并分别说明他们的汲取波长和放射波长以及荧光颜色？荧光是指某些物质被肯定波长的光（如紫外线）照耀后能发出一种比激光更

25、长的光， 荧光物质也称荧光素，荧光色素或荧光探针是指能够汲取光并能在较短时间内放射荧光，而 且能作为染料的化学物，荧光素提出都具有芳香环结构。荧光色素的荧光光谱和量子产率受 荧光素染液的PH影响PH在8.5-9-5是银光强度较强。PH低于6。4不发光。温度,荧光 素的乙醇溶液在0度以下没降低10度荧光量子产率增加3%降至-80度荧光量子率接近100% 反之那么弱。30度开头荧光强度降低，37度对异硫氟酸荧光素无影响。溶剂性质对荧光也有影响浓度也对荧光有影响。常用的荧光素有：最常用的染料有FITC和藻红蛋白类(PE)及罗丹明等。FITC (异硫鼠酸荧光素)(fluorescein isothio

26、cyante)：呈黄绿色，最大激发激光长490NM最 大放射光波长525nm；与蛋白质结合四甲基异硫氟酸罗丹明(teramethyl rhodamine isothiocyanate )TRITC也是与蛋白质结合比 FITC性能好生理条件下对PH不敏感最大激发光波长550NM最大放射光波长620NM呈橙 红色荧光与FITC发出的黄绿色荧光形成鲜亮比照常用与免疫荧光组织化学双重染色。四乙基罗丹明(RB200)能与细胞内蛋白质结合易溶于乙醇丙酮性质稳定，应用于双标记示 踪染色，最大发光波570nm最大放射波长595 600nm呈橙红色染色。花青类染料常用的 有CY3, CY5与蛋白质结合CY3最大

27、激发光波长570nm最大放射光波长650nm。CY5最 大激发光波长649nm最大放射光波长680nm呈红色荧光o PE (藻红蛋白)：橙黄色575nm；蛋白质结合PerCP (多甲藻黄素叶绿素蛋白)：深红色675nm；PI (碘化丙咤)：橙红色620nm；488nm波长的氤离子激光激发；APC (别藻青蛋白)：红色660nm；630nm波长的氢窟激光或红色二极管激光激发。口丫咤橙染色(acridine orange)AOyu DNA或RNA结合最大放射光波长525nm或650nm产生 绿色荧光hoechst33258染色和hoechst33342均为非嵌入性荧光染料他们在活细胞中DNA聚AT

28、序列 富集区域的小沟处与DNA结合，活细胞或固定细胞均可从低浓度溶液中摄取该染料，使细 胞核染色，故把此染料叫DNA探针hoechst33342和hoechst33258均溶于水保持稳定， hoechst-DNA的激发和放射波长分别为350nm和460nm。DAPI染色也是与DNA结合。溟 化乙咤染色。4 .免疫荧光组织化学的基本原理方法？免疫荧光组织技术是用免疫荧光技术检测细胞或组织内抗原或半抗原物质的方法。依据 抗原抗体反响原理，先将抗体或抗原标记荧光素制成标记物，再用这种荧光标记物作为 分子探针与组织细胞内的相应抗原或抗体反响，在细胞或组织中形成含有荧光素的特异性抗 原抗体复合物，这种复

29、合物上的荧光素受激发光放射照耀而发出各种颜色，荧光采用荧光显 微镜观看，即可对组织细胞中的抗原进行定性定位乃至定量讨论。蛋白质多肽核酸酶激素磷 脂多糖受体记病原体等，凡能作为抗原或半抗原的物质均可用免疫荧光技术检出。5 .滤片的种类和用途？激发光滤光片位于光源和显微镜之间的光路内其作用是汲取可见光，允许肯定波长的 紫外光和蓝紫光通过。依据观看需要，可将抹一些激发滤片至于光路使肯定的光通过，作为 荧光激发样品中的荧光物质。阻断滤片又称汲取滤片在目镜和武警之间的光路中汲取视野内未被标本内荧光物质汲 取的激发光，已获得清晰地荧光影像和保护观看者的眼睛反光镜上有一层铝铝对紫外线和可见光的蓝紫光汲取少反

30、射率大90%以上，课折射激 发光转变光路是激发光赵汝样品中。隔热滤片汲取热量保护其他光学元件。中性滤片课不同程度的汲取可见光，减弱光强度。.6.激光共聚焦显微镜的原理？激光扫描共聚焦显微镜的原理：传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的 图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM）采纳点光源照耀样本，在焦平面上形成一个轮廓清楚的小的光点，该点 被照耀后发出的荧光被物镜，并沿原照耀光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将 荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探

31、测针孔。 照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共辗的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和放射 针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学 切面，避开了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了一般显微镜图像模糊的缺点，因此能得到 整个焦平面上清晰的共聚焦图像。原理图7.免疫组织化学染色常见的脱片缘由？及防脱片的处理步骤？脱片缘由组织固定脱水透亮不充分，组织切片过厚，组织切片有折叠，过度的热抗原修复（高压微波水煮）处理或抗原修复液的PH偏离炒作观看中冲洗方法不正确。防脱片用重金各酸浓硫酸清洁液浸泡载玻片或那么培育用的小盖片，然后用清水充分再用蒸 储水冲洗3遍以上后置95

32、%乙醇12小时去除擦干或烤干清洁液浸泡只需2小时。检查玻片 是否上胶。把玻片放入用配好的多聚左旋赖氨酸0.01%溶液中数十秒沥干于室温下12-24小 时时候后的多聚L-懒氨酸放在4度的冰箱保存反复使用一个月。8.sp法（链霉素抗生素蛋白过氧化物酶）与直接免疫荧光法的区分？链霉亲和素替代ABC法中的亲和素-生物素复合物，形成链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶 法，SP法链霉亲和素是从链霉菌中分别出的一种蛋白，含有四个亚基，链霉亲和素的四个亚基可 以全部和二抗上的生物素结合，故又称链霉菌抗生物素蛋白；由于该放大系统不含生物素, 可以免除由内源性生物素所造成的背景染色；等电点为5.56.7,接近中性，所带

33、的负电荷少，不简洁与组织中的正电荷发生相互吸弓I, 因而降低背景着色。链霉亲和素不含糖基，不存在与组织中含糖基类物质其反响的现象。9.免疫组织化学染色样品制备特点取材：组织标本取材：基本原那么：取材速度要快，尽量保持组织新奇，以充分保存组织的抗原性。细胞标本取材贴壁生长细胞：取材时，用预热的PBS轻轻冲洗小盖片，而后，即可加入固定液。悬浮生长细胞:制备2X10 5-6细胞/ml悬液,取50-100 UL加入涂片机内，1000i7min. 2min. 细胞即可匀称分布在载玻片上3）涂片法：临床穿刺猎取含有细胞的液体（腹水，胸水和心包液）或气管、宫颈等分泌物可 直接涂片。固定：组织常用固定剂：10

34、%中性缓冲福尔马林（浓甲醛10ml,0.01 M, pH 7.4, PBS 90ml）4%多聚甲醛磷酸缓冲液（pH7.4）sp法留意事项：甲醛固定可引起组织抗原打算簇交联和封闭（可以通过抗原修复方法来 修正组织大小应当小于2cmXL5cm X 0.3cm,尤其厚度必需小于0.3cm；固定液的量，体积一般大于组织20倍以上；固定时间8-24小时，过度固定会使抗原表达假阴性；组织固定后应充分水洗。10.何为二次展片？是指切片在展片过程中，先将组织切片漂移在30%的乙醇溶液中，进 行第一次展片后将切片捞起，再次放入45 50 的水浴锅中进行其次次展片，由于酒精 溶液与水之间有一个张力差，这样处理可得

35、到平整无皱折的组织切片。酒精的浓度和水温可 视组织不同和石蜡熔点的凹凸，自行调整。核酸分子杂交:两条互补DNA或RNA单链之间 以复性的原理形成双链核酸的过程.1L原位杂交组织化学技术进展？原位PCR技术荧光原位杂交技术胚胎原位杂交技术双重和多重原位杂交技术原位杂交结合免疫组织化学技术电镜原位杂交技术肽核酸原位杂交原位PCR技术原理：将PCR技术与原位杂交技术结合起来，不转变四周组织的原有位置，直接在组织、细 胞或病原体原位讨论基因变化的技术。依据在扩增反响中所用的dNTP或引物是否标记，原位PCR可分为：直接法原位PCR间接法原位PCR12 .影响杂交体稳定性的因素杂交双链的碱基组成.杂交双

36、链的长度.碱基错配程度.离子强度.变性剂浓度1类型核酸分子杂交液相杂交固相杂交原位杂交组织化学(ISH)：应用特定标记的核酸探针与组织或细胞中待测的核酸按碱基 配对的原那么进行特异性结合，形成杂交体，杂交后的信号可以在光镜或电镜下进行观看。 可进行细胞内核酸定性、定位的一种技术。核酸分子探针：一种带有标记物的、的、仅与靶分子特异反响的分子。探针的种类DNA 探针cRNA探针寡核甘酸探针原位杂交组织化学基本程序标本制备杂交前处理杂交反响 杂交后处理 检测杂交信号。13 .免疫组织化学染色步骤石蜡切片免疫组化染色步骤1 .烤片:58 2-6h；2,脱蜡和水化：在二甲苯I、II中浸泡15- 3 0

37、min -100%酒精I、II中分别浸泡5min一 95%、90%、80%、70%酒精各浸泡2min-PBS洗3次X3min,置蒸储水中待用；.抗原修复：先将pH=6.0和0.lmol/L柠檬酸缓冲液煮沸，将切片置于已沸缓冲液中进行 高压修复l.5min,室温冷却，PBS冲洗3次X5min；3 .用 0.1% 0.3%TritonX-100 浸泡，RT, 25min, PBS 冲洗 3 次X5min；使抗体渗透进入细胞的方法Triton X-100 ：使细胞膜脂类溶解(2) Np-40：使细胞膜蛋白质破环(3) S叩onin：使细胞膜胆固醇溶解(4) Freezing：使细胞膜穿孔，速冻形成冰

38、晶，溶解后形成小孔。SABC法与免疫组织化学染色其它方法比拟？SP法或SAP法（二）EnVision TM Systems原理是将多个抗鼠和抗兔IgG分子与辣根过氧化物酶结合形成聚合物，以代替传统 方法的二抗和三抗，直接与特异性第一抗体结合，从而放大了抗原抗体结合的信号，使检测 变得简洁而且敏感性增加。（三）Maxvision 法阳性组织比照法无误一抗阴性比照 PBS取代一抗,依据聚合物技术把过氧化物酶与抗鼠或/和抗兔IgG分子结合在多聚肽上形成多聚物 分子，可以避开由于生物素引起的非特异性背景显 免疫组织化学染色结果评价 比照试验方法和结果分析 比照种类 靶组织 试验试剂阳性反响意义组织中含

39、待测抗原按常规操作流程 提示操作系统的试剂和操作方组织中待测抗原未定 用与第一抗体相同种属正常血清取代一抗或用 其余步骤不变。提示有非特异性反响存在 二抗阴性比照 组织中待测抗原未定 用与其次抗体相同种属正常血清取代二抗或用 PBS取代二抗，其余步骤不变。 提示一抗对组织有非特异性吸附或组织内未灭活内源 性酶14 .免疫组织化学技术应用的基本原那么？免疫组织化学技术的局限性：组织细胞内的待测物质要有抗原性；有肯定浓度方可检测出；检测出的阳性蛋白不能被确定是细胞新合成的蛋白还是通过细胞间运输而来的蛋白。确定 细胞类型和形态.识别细胞产物的来源2 .确定细胞的分化程度.追踪神经纤维束和它的投射区3 .在临床病理中的应用如鉴定病变性质，觉察微小病灶，研讨肿瘤起源或分化表型，确 定肿瘤分期，指导治疗和预后，帮助疾病诊断和分类，查找感染病因等。15 .流式细胞术在组织化学与免疫组织化学中的应用？流式细胞术的常用样品制备方法单层培育细胞单细胞悬液的制备实体组织单细胞悬液的制备机械法酶处理法石蜡包埋组织的流式细胞样品制备免疫荧光标记样品直接免疫荧光标记法间接免疫荧光标记法.荧光标记中的留意事项？细胞分选或检测细胞存活率时，要保持细胞新奇