酶切若干问题.docx

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1、酶切现象及影响因素详解1先说一下酶切对象(1)质粒 要是对质粒进行酶切，那么质粒的纯度挺重要，污染有DNase和残留质粒提取中的 酚以及高盐对DNA酶切都不利，还有RNA要去除洁净。以上所提的这些这都会影响酶切效果。 解决方法DNase污染：质粒提取的试剂都要进行灭菌，提取时不要拖拉，电泳缓冲液要长换, 以免电泳液造成DNA降解，电泳液的pH不要偏酸，简单降解DNA,在最终溶解DNA时，可以采纳 TE和水，建议用TE, TE可以鳌合金属离子，使DNase失活。酶切时，TE也会有肯定影响，但你 可以将溶解DNA时的TE少加点。酶切时，取的DNA的体积就可以削减，经水稀释，就问题不了。 RNA的去

2、除：一般将RNase加到TE中，经过37度温育一段时间就可以将RNA很好的去除12 个小时就行。酚的污染：首先在用酚仿抽提时，就要留神不要吸到下面的有机溶液，要是为了保险可以再用氯 仿单独抽提一下，就可以很好的避开酚的残留。高盐的去除：提取质粒时一般盐的浓度很高，假设有人在70%乙醇洗盐这步不做，也会影响后面 酶切。(2) PCR产物PCR产物经电泳检测是单一目的条带可以直接酶切，假设是杂带许多，就要将目的片段回收再酶切。一般在设计引物的时候，会在5端引入酶切位点，但是不要忘了在酶切 位点外面加几个保护碱基。加入4个比拟保险，假如没有保护碱基，内切酶是无法切断DNA的, 即使加入保护碱基，酶切

3、效率也会较低，需要长时间酶切。(3)基因组DNA将基因组做酶切一般是在southern blot时常用，这时酶切体系一般较大, 由于基因组中目的基因的比例是很小的，酶切之后转膜又会有损失，因此多做一点酶切产物，才会获 得较好的杂交效果。内切酶也要多加一些，一般都要酶切一夜，才能完全酶切。2、用自己的质粒连接的转化产物可以送出测序吗？还是肯定要做T载体连接?1) MBI的内切酶还可以，Xbal用过，酶切效率不高，酶切过的质粒做的比照也有转化子,我想确定没有切完全或酶切后没有胶回收。2)用自己的质粒连接的转化产物可以送出测序，并不是肯定要做TA克隆，PCR产物酶切后可以直接连接到你的载体上。wol

4、fdance wrote:EcoRI和BamHI是能够同时进行酶切的，我做过，效果很好。用的是NEB的美和Buffer。双酶切时应当用EcoRI的buffer.我现在遇到的一个问题是：PC R产物连接到p G EMT载体后测序觉察，我当时引物 设计时加上的一个E c o r I的酶切位点不见了，末端少了 两个碱基，G Ao 我用的酶 是生工的T a q plus, 最初我坚信是引物的问题，可后来我看到T a q酶有5，一 3外切酶活性，不知是不是在PC R 是引物的5,端被切掉了两个碱基，导致了酶切位点的消逝。的消逝。恳请大虾教导迷津。我想你的猜测有道理，T a q plus的保真效率高，适合

5、长片段(io-3okb)扩增，公司的说明书上有这样的描述:(1) high fidelity with an error frequency 1.6 / 106 (or 0.0016/103) during DNA synthesis.(2) Taq Plus increases the efficiency of polymerization reaction, resulting in a greatpercentage of extenuation reaction completion up to 10 kb to 30 kb. Pfu has atemperature optimum

6、 between 72-78 and remains 95% actie following 1-hourincubation at 95 .5端碱基可能与你的酶有关系，最好换其它的酶，假如你要扩增长片段的DNA,可以试一试Takara的Taq Ex。不过高保真与外切酶活性是一个冲突。我查了一下，还没有说Ta q酶能切掉引物5,端碱基的报道。不知主任是否遇到过这种状况。我想该用p f U, 但他不能直接用于TA克隆。 我的片段有1 4 0 0 b p , 测序后除了引物上有三个碱基错误(两个缺失， 一个错配)外，只有一个碱基与GENEbank不一样。老板让我在重复一次，说不准就没有错误了由于错

7、配饰随机的。不知这种可能性大不大。感谢主任的回答wolfdance wrote:EcoRI和BamHI是能够同时进行酶切的，我做过，效果很好。用的是NEB的美和Buffer。双酶切时应当用EcoRI的buffer.我现在遇到的一个问题是：PC R产物连接到p GE M T载体后测序觉察，我当时引物 设计时加上的一个E c o r I的酶切位点不见了，末端少了 两个碱基，G Ao 我用的酶 是生工的T a q plus, 最初我坚信是引物的问题，可后来我看到T a q酶有5，一 3外切酶活性，不知是不是在PC R 是引物的5,端被切掉了两个碱基，导致了酶切位点 的消逝。恳请大虾教导迷津。我想你说

8、的状况比拟少见，一般正常的PCR不会消失，另一个关键市，TAQ酶在最终加个 T,假如真是你说的，能连到T-ECTOR上，说明T还在，所以Ta q酶有5，一3,外切酶活 性的可能性不大。你可以考虑以下缘由；（1）引物末端不配对碱基是不是太长，两个保护碱 基加6个碱基，引物起码要在20以上。（2）序列平读是否正确，认真看一下测序图，机读 有时会落掉。至少，你的怀疑理论上是存在的，但是实际中很少，否那么，公司怎么敢卖这样 的酶。再答楼上问题：一般册序是不用TAQ酶来扩增的，而用PFU,具体做法是，先用PFU正常扩 增，结束后，每管加o。3-0o 5微升TAQ酶加尾，72度保温1。分钟。即可。感谢三七

9、花地回答，这么看来确实是引物合成的问题了，测序峰图我看过了，没错。真是难以想象，一条24个碱基的引物竟然有三个错误。我的引物末端没有家保护碱基，也就是说只有六个剪辑时不配队的。PS:PCR产物确定连到T载体上了，测序结果正常。讲得太棒了!盼望高手们多些总结建议给wangjun2002274加分，确实不错请问假如一条PCR产物长500bp,被一内切酶切开后变为两个片段，这两个片段的长度加起来肯定等于soobp吗？感谢主任，我的酶切产物是胶回收过的，我现在50微升的体积用了 2微升Xbal 和1微升HpaL1、是不是下次切时应当增加酶量，延长时间；有人说假如酶切不全，就回收后再加酶反复切，这样好吗

10、？2、特别不幸的是，试验室停了两天电，我的酶还能用吗？老板舍不得买啊。我 好想哭啊！假如PCR产物上只有这一个酶切位点，切开后为两个片段，加起来就等于原PCR 产物，即5oobp。1 .假如PCR产物扩增后直接克隆到T-EASY载体上，是否在设计引物时就不用考虑加保护性碱基的问题了2 .假如所扩增的片段本身就是高GC（7。）,用一些引物设计软件都没有在抱负的位点找到合适位点，是否可以不严格遵守引物扩增的基本原那么，如3端不能是高GC,这样扩出来的效果回不回很差？盼望各位战友予以指导.在此先谢过了.对了还有，假如是用高保真的TAQ酶是不是在引物设计时自己就加上A（宝生物的 LATAQ 酶）.1

11、.假如PCR产物扩增后直接克隆到T-EASY载体上，是否在设计引物时就不用考虑加保护性碱基的问题了2 .假如所扩增的片段本身就是高GC（7。）,用一些引物设计软件都没有在抱负的位点找到合适位点，是否可以不严格遵守引物扩增的基本原那么，如3端不能是高GC,这样扩出来的效果会不会很差？盼望各位战友予以指导.在此先谢过了.1 .假如PCR产物扩增后直接克隆到T-EASY载体上，是否在设计引物时就不用考虑加保护性碱基的问题了2 .假如所扩增的片段本身就是高GC（7。）,用一些引物设计软件都没有在抱负的位点找到合适位点，是否可以不严格遵守引物扩增的基本原那么，如3端不能是高GC,这样扩出来的效果会不会很

12、差？3 .假如用的高保真的TAQ酶是不是连到T载体上的A就由自己在设计引物时加上去？盼望各位战友予以指导.在此先谢过了.1）假如PCR产物扩增后直接克隆到T-EASY载体上，可以在设计引物时不用考虑保护性碱基，比拟PCR酶切，克隆到T载体效率较高，但我一般都设计保护碱基。2）可以不严格遵守引物扩增的基本原那么，但最好不要有错配，这还要看你的模板来源，之前可以做比照。引物的3端最好为A、G、C,避开是T,但避开3个连续的G或C消失，尤其在在3端。3）用的高保真的TAQ酶不能在平端双链DNA的3末端加一个碱基腺首，最好不用这种酶，假如是长片段产物，可以用其它的Taq酶。4）关于PCR产物克隆问题，

13、我觉得可以两条途径进行，TA克隆是一条路，PCR酶切产物克隆是另一途径。感谢斑竹，可是我克隆的是一个启动子序列，然后拿到报告载体中进行表达，所以一般要求是高保真的酶进行扩增。PCR酶切产物克隆，是不是将产物直接连到目的载体上，还是通过一别的中间载体（如PUC载体）定向连接克隆后再连接到目的载体。（由于刚接触，所以有些问题或许很弱。）我没有做过启动子序列的克隆，但具体状况具体分析，选择酶切位点很重要，你应当依据你的载体及promotor序列进行综合考虑。感谢啦!我把我的一个引物输入到一个引物设计软件中，说其不行用，说3端自身互补，且过于稳定，请斑竹看看并予以指导.下游引物 5AAG CTT AG

14、G GCT TCC CAC GTG CGC AG 3形成发卡结构关系不大，后续优化PCR反响条件应当能扩出来，我设计的一对 引物只有22个base,与目的基因互补的序列只有13个base,打分只有60分, P的产量很高，特异性也很高（质粒为模板）。假如你引物的其它一般原那么都具 备，先试一试，先合成20D,合成引物也不是很贵嘛！感谢感谢!那我就先试一试啦.有结果肯定会通知您！对了还是想请问一下，在合成引物时，你们通常用不用HPLC纯化.由于我要扩启动子区,GC含量高，所以较为困难.没有吧，引物都是PAGE纯化的，纯度可以到达99%!请教一个问题，请大师们教导。我用Ecol和Xhol进行双酶切鉴

15、定重组质粒时，切了好几次都没切开，请问有 什么缘由影响酶切。我用PCR能从重组质粒中扩出目的片段，质粒酶切时我用 了 15微升，两种酶切用了 2小时半，选的是两种酶的通用buffer。各位帮帮我吧：我的PCR产物回收后，用EcoRI和Xhol双酶切，然后和EcoRI 和Xhol双醉切的载体PET30a连接，转化BL-2KDE3）感受态细胞，想进行蛋 白的表达，可是做了快一个月了，转化后，一个菌都不长，感受态细胞用空载体 检测过，转化率挺高的。PCR用的两条引物，分别加了 EcoRL Xhol得酶切位 点，并有三个保护碱基，PCR产物的大小为2.1Kb,由于酶切过只有少数几个碱基去掉，所以不知道

16、PCR产物是否被切出粘性末端。我现在该怎么办呀，那一步出问题我都找不到，PCR产物酶切时间是过夜lanzr wrote:请教一个问题，请大师们教导。我用Ecol和Xhol进行双酶切鉴定重组质粒时，切了好几次都没切开，请问有什么缘由影 响酶切。我用PCR能从重组质粒中扩出目的片段，质粒酶切时我用了 15微升，两种酶切用 了 2小时半，选的是两种酶的通用。你的状况基本上与酶切buffer,体系，时间关系不大。假如能切开，2各小时足够了，只回 存在酶切不完全。你考虑以下缘由；1根本没转入。菌落PCR假阳性特别多，2载体提取 的不，乙醇或蛋白抽提不净，你可再出提一次，用7。乙醇洗两次，待乙醇挥发洁净。

17、三七花你好！感谢，我刚要重新提取质粒。我做PCR不是用的菌落，是用接种针挑很少的菌 落接种LB,培育后取1微升的菌液做为模板进行PCR鉴定的，不知这种状况下 的假阳性有多高。以前我转化不胜利时PCR基本都是阴性。anxueli wrote:各位帮帮我吧：我的PCR产物回收后，用EcoRI和Xhol双酶切，然后和EcoRI和Xhol双酶切的载体PET30a连接，转化BL-21(DE3)感受态细胞，想进行蛋白的表达，可是做了快一个月了，转化后，一个菌都不长，感受态细胞用空载体检测过，转化率挺高的。PCR用的两条引物，分别加了 EcoRL Xhol得酶切位点，并有三个保护碱基，PCR产物的大小为2.

18、1Kb,由于酶切过只有少数几个碱基去掉，所以不知道PCR产物是否被切出粘性末端。我现在该怎么办呀，那一步出问题我都找不到，PCR产物酶切时间是过夜见你的问题我就想掉泪，我已做了三个月。我们状况熟识，相互沟通一下，或许大有裨益。 有几个建议，1你把PCR后的片段先与T载体相连，然后再做酶切，这样就可以解决你讲 的问题。2 PET30a酶切也存在这个问题，你可做单切作比照，假设也做不出来，那就只能是 连接酶的缘由了。3酶切时间是过夜到不必，切长了反而不好，假设你始终这样做，或许问题 在这，时间应掌握在4小时之内。盼望你能把你的感受发出来，相互借鉴。lanzr wrote:三七花你好！感谢，我刚要重

19、新提取质粒。我做PCR不是用的菌落，是用接种针挑很少的菌落接种LB, 培育后取1微升的菌液做为模板进行PCR鉴定的，不知这种状况下的假阳性有多高。以前 我转化不胜利时PCR基本都是阴性。菌落PCR是指直接用菌作摸板，所以你的做法也属于此。假阳性很高，我最初作这个试验, 看到这便筛，结果一个也没有。你可以用以前的摸板作比照，扩出的片段亮度应相同，才可 以初步确定。三七花wrote:菌落PCR是指直接用菌作摸板，所以你的做法也属于此。假阳性很高，我最初作这个试验, 看到这便筛，结果一个也没有。你可以用以前的摸板作比照，扩出的片段亮度应相同，才可 以初步确定。我用以前的模板做比照的，我用菌液和提取的

20、质粒做PCR,扩出的片段亮度基本都比我用模板扩出的条带亮度高，有的高许多。那你的PCR在你的转化子里边占多大比例，假如转化胜利，这个比例应在9。以上。假如确实，说明你的这一步没问题感谢三七花，我补充一点：1） lanzr ,调整菌落PCR条件，直接挑转化后的单个菌落放到PCR管中，没必 要用LB培育，留意把预变性时间调到7-10分钟，而且挑后沾到含抗性的LB平 板上，并做好标记，一次可以挑10来个菌斑。假如还不胜利，测序看看！2）anxueli ,你可以先将纯化的PCR产物克隆到T载体上，酶切后的片段再与你的pET30a （同时双酶切）连接；也可以将PCR产物（假如你的产物特异性强切产量高）双

21、酶切回收，胶回收后直接连到PET30,我建议你先构建好表达载体，转入高拷贝的克隆菌DH5a或JM109效率高，抽提质粒鉴定后再转入BL21o帖子太棒了，使我醍醐灌顶，茅塞顿开你的意见很好，感谢你的补充。用DH5a还有一个好处，它的转化率高。厉害啊，真佩服你的工作。厉害啊，真佩服你的工作。你是这方面高手,能进入我的数据库吗，能把你的资料发信给我吗核蛋帝国wrote:你是这方面高手,能进入我的数据库吗，能把你的资料发信给我吗感谢，我不是高手，只是有些体会，大家相互争论一下可以，你需要什么资料？ 一般的资料 你可以到NEB网站下载，感谢支持核酸基因技术争论版。目的：酶切后回收目的片断连接体系：dH2

22、0 4iulbuffer B 5ulplasmid（ioong/ul） 3ulHind 3 0.511I （5 个单位）Pst I o,5ul （5 个单位）总体积50 ul37度，3个小时，电泳酶切完全，但条带很弱问题：回收后溶解在25ulTris-Hcl中，检测竟然没有东西！ ！求助，是否由 于酶切体系中质粒浓度太低？ ？ ？曾看到一同学的体系，同样50ul, plasmid竟然加到34 ul! !载体用的量少了，所以你酶切后的片段条带较弱，而且胶回收的能到达3。就 不错了。建议：1）3。皿的体积，质粒的量可以加到lug,浓度达不到可以先浓缩。双蒸水加少 点或不加都没有问题。2）内切酶用1

23、U1足够。3）加大上样量，以便能回收较多的目的片段，可以使用宽梳子或将两个梳齿用 透亮胶连在一起倒胶。4）回收尽量少切下琼脂糖，回收效率有所增加。5）回收后跑电泳未见条带，可能是浓度太低，可以先测定0D260看看浓度，假如能到达50ng对后面的试验没有多大影响。我想请教版主和DX们一个问题，我要把老外给我的pGL-3 Basic质粒MCS上 游人工添加的一段调控序列和Tk启动子P下来，替换掉PC-DNA3上的CM启 动子。设计的酶切位点是Ndei和Hind3，其中Hind3本身就位于PGL3 MCS 下游，而Ndei那么必需加在上游PCR引物的5端。我查了一下NEB的说明，Ndei 的保护序列

24、加上酶本身的序列长达20个bp,加上3的互补序列一共是30个bp （3端的十个互补序列是pGL-3上游测序引物的3端序列距离MCS有4。个bp 的距离），而下游引物那么只有18个bp,不知这样能否P出我要的序列，还是应 当不加保护序列，而先克隆到T载体中后在进行下一步的亚克隆，请版主予以 教导，感谢了。很支持foxsports ：1） Ndei的保护序列加上酶本身的序列，假如是GGAATTCCATATGGAATTCC, 只需要加一侧的保护序列就可以了，酶切效率不高，延长酶切时间。2）两个引物相差太大不大好，一般不超过3个碱基。你可以将下游引物延长点! 3）加保护碱基是为了便利后面的酶切，假如你

25、先克隆到T载体，可以不加！wangjun2OO2274版主，特别感谢您的回复，还有两个问题想向您请教一下。1、 我用TaKaRa公司的Ndei和Hinds同时进行双酶切，用的是该公司供应的通用 KBuffer,公司说明书上说在K Buffer中这两种酶的效率都能到达100%,我切 了 34个小时后跑电泳觉察没有切开，不知道是时间不够，还是这两种酶最好 分开切或是其他什么缘由。2、试剂名目上还说，用Ndei酶切后形成的AT粘端 在进行连接时，效率很低，要用平末端的连接条件才行。在这种状况下假如将 PCR的酶切位点设计为该酶的同尾酶Xspi来进行连接不知是否效率能有所提 高，此方案是否可行，请予以

26、教导，再次感谢！1）切了 34个小时没有切开不是时间的问题，假如温度相同可以同时切，换其 他公司的酶试一试，或切其它的质粒做比照，也可以用两个酶分别做单酶切比照 看看酶有没有问题。2）平末端连接确定没有粘末端高，将PCR的酶切位点设计为该酶的同尾酶Xspi 来进行连接，这种方法我没有做过，你可以看看分子克隆。三七花wrote:2）连接，第一，在分子克隆上提到，假设连接困难，可能末段封闭，因此建议连接之前45度保温5分钟。这一步是否必要。其次，体系Goul）,我一般是凭感觉，假设回收的载体中度量（5微生）目的片段微弱，比例如何好。第三，连接酶。我不知到有多长时间了。比照我是否可以用单酶切看连接效

27、果.4）平板常常出问题，有时不长，有时长的不是转化子，问题在于到平板时不能太凉，结果抗生素没混匀。此外，还有一个状况，我前面在做T载体转化时，也是转不出来，是一个老师转的。状况与此差不多。综合这些状况，再请教以下？多劳驾了。1O对于其次个问题我觉得没有必要，我一般都没做过这步。2o per产物的量和质粒的量肯定要大，假如量少我建议你不要往下做了。这往往是起打算作用的，量大分子发生碰撞的机会才多，才能连上。3,连接酶很重要，我们试验室用neb的酶，效果很好。4o平板肯定要过关，本人同意版主的意见，最好是新倒的T载体上Ndel和Sall紧挨着，切这两个酶切位点，连目的片断，就是长不出菌 来。会不会

28、是靠的太近切不开，或是更糟，切乱了。请各位大虾多多指教。一般我们不提倡靠近的两个酶切位点同时切，之间相隔最好3个以上碱基！你切 不开是有可能的，建议重新选择酶切位点。前两天没留意，觉察wangjun2OO2274版主的回复真是准时、专业，受益匪浅, 特此感谢！以后在试验中遇到的问题还望版主和各位高手连续多多指教。太夸张了，相互学习！不知怎么了，各种条件都考虑了，酶也换了，就是不出结果。即使有转化子，接 菌开头长，变白后就不长了。提一下质粒有三条带，可是一切就碎，真真见鬼了。可能与甲基化相关!质粒质量不好！能具体解释一下吗？至于质粒质量不好，我想可能性不大，原质粒（同一批）提 取与酶切好好的，再

29、连接转化就不行了。具体的我也不清晰，实际上你可以转化其它的宿主菌试一试！再抽提质粒！我已经试了 DH5a与JM109，BL21都不行。求助：单酶切产物比未酶切产物跑的快，这种现象应当怎么解释？是酶切没切动，还是 其他缘由？单酶切产物假如是一条带，那么就是质粒DNA的分子量，未酶切的产物不好定 性！线状DNA是要比环状DNA跑的快些。环状DNA在胶里可能阻力大些，而且还 有不同螺旋。大家有没有人用过大连宝生物的内切酶，感觉如何呢?我用了这个公司的内切酶后就是连不上！版主好厉害！小弟偶在做PCR产物NSPI (NEB)单酶切，不知版主有没有用过这个酶？它 的最正确反响温度是37度，我始终用2h,但

30、还没见到有切出特殊好的，不知时间 是不是要延长？可以延长酶切时间,过夜！酶切时间过长对产物片断会有此外影响吗？载体的量很关键，使用完量多的载体。不知哪位大虾有没有试过在PCR反响液里边直接加内切酶消化呢？依据NEB说明书“内切酶在PCR反响产物中的活性”是可以的说。我觉得不很好，PCR反响液里的离子浓度与内切酶是不一样的，而且还有多聚酶的干扰等，建议纯化后再酶切！hi, all,any comments on the usage of mung bean nuclease are most appreciated.higher concnetration / longer duration i

31、s not so good?!thanks.好帖子我也来求教一下我的问题：我是先用宝生物的Notl和Ndel双酶切PCR产物和pET21b质粒.PCR产物有9个保护碱基，质粒上的酶切位点也离得足够开了.我的酶系统一般是100U1,两种酶各加10-15U.DNA量小于nig.切6个小时.后来由于始终做不出阳性克隆，也试过单酶切两次.PCR产物先用Ndel在8oul体系中切2个小时，再加到looul用Notl切2个小时.质粒切得久一点,分别是4个小时.然后胶回收.用promega的ligase在I5ul体系中，放了 loong质粒,70ngpCR产物,1U的酶.16度过夜.转化后一个阳性都没有.转

32、化时做了阳性比照，没有问题.我想问的是：DNotl对甲基化敏感，我的pET-2ib是从DH5a中提的，不知道会不会由于甲基2酶切试剂（1）酶切缓冲液：一般公司会给你的说明书中，告知你用哪种缓冲液，假如是单酶切，依据说 明书上提示即可。要是双酶切，原那么是先找两种酶有没有可以共用的缓冲液，最好两种酶同时酶 切比拟省事。实在是两种酶没有共用缓冲液，就得先进行低盐缓冲液酶切，补充适量盐溶液，再 行高盐的缓冲液进行酶切。（2）限制性内切酶：一般是在一20度保存，吸取时，从冰箱取出后放在冰上进行操作，而且动 作要快，防止酶失活。有的人，将酶分装几管，每次拿出一管来用，可以更好的避开酶失活。 国产的内切酶

33、，比方常用的EcoRIBamHI还可以，但是其他一些酶质量不如国外的牢靠，有时你 的酶切假设消失smear的现象时，总是找不到缘由，有可能就是酶中的污染。3酶切目的（1）加入多少目的DNA,这要看你的酶切目的是什么，假如你要是回收目的片段，当然是多一些 好，而且在电泳之前耍更换电泳液，以免污染。耍是只进行酶切鉴定，就可以少加一些目的片段。（2）假如单一的目的片段酶切连接，在 酶切之后要将酶进行加热失活，或者用酚氯仿进行抽提, 纯化。（3）要获得不完全酶切的产物，一般都是掌握酶切的时间，进行梯度延长酶切，可以获得你所 要的最正确酶切时间。4酶切温度一般常用的内切酶都是在37度是最正确的酶切反响温

34、度，也有一些酶是低温活性更好，有的是28度化的关系没有切开？2）假如没切开，那至少有假阳性克隆啊.但什么都没有.我想是T4 ligase的问题？请各位不吝赐教！我是本科生，试验室中也没有这方面特殊牛的师兄师姐.我用sail和BamHI对一个重组子进行双酶切，可我拿到手的酶是不同的公司生 产的，且各自buffer的组成相差极大，请问我可以用sail酶切以后，再用酚， 氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用BamHI酶切吗？我用sail和BamHI对一个重组子进行双酶切，可我拿到手的酶是不同的公司生 产的，且各自buffer的组成相差极大，请问我可以用sail酶切以后，再用酚， 氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用

35、BamHI酶切吗？请高手教导conscience wrote:我用sail和BamHI对一个重组子进行双酶切，可我拿到手的酶是不同的公司生产的，且各 自buffer的组成相差极大，请问我可以用sail酶切以后，再用酚，氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用BamHI酶切吗？请高手教导先切了试试吧，我原来也是用这两个酶的，假如不行，选择比拟适中的BUFFERFalexandra wrote:我也来求教一下我的问题：我是先用宝生物的Notl和Ndel双酶切PCR产物和pET21b质粒.PCR产物有9个保护碱基，质粒上的酶切位点也离得足够开了.我的酶系统一般是looul,两种酶各加10-15U DNA量小于l

36、ug.切6个小时.后来由于始终做不出阳性克隆，也试过单酶切两次.PCR产物先用Ndel在8oul体系中切2个小时，再加到looul用Notl切2个小时,质粒切得久一点，分别是4个小时燃后胶回收.用promega的ligase在isul体系中，放了 loong质粒,70ngpCR产物,1U的酶.16度过夜.转化后一个阳性都没有,转化时做了阳性比照，没有问题.我想问的是:i）NotI对甲基化敏感，我的pET-2ib是从DH5a中提的，不知道会不会由于甲基化的关系没有切开?2）假如没切开，那至少有假阳性克隆啊.但什么都没有.我想是T4 ligase的问题?请各位不吝赐教！我是本科生，试验室中也没有这

37、方面特殊牛的师兄师姐.放了 loong质粒,7OngPCR产物,1U的酶.16度过夜.转化后一个阳性都没有.转化时做了阳性比照，没有问题.1）查查相关资料，假如你认为是甲基化问题，用TOPio或JM1O9转转看！2）可能是连接和转化的问题，最好先检测一下酶的活性及感受态转化效率，连接体系要留 意计算载体与PCR产物的摩尔比，一般1： 3,依据需要调整，PCR产物尽量多些。感谢版主1）质粒抽的不好，重新抽一次2）先用其他的载体来检测你的酶求助！我用的是Takara ： BamHi和Sall双酶切，共用buffer是1.5但说明书上写两种酶在Tbuffer中活性均小于20%且它们还都有*活性。请问

38、该如何是好？各位大侠，我想问一下，是否全部的per引物都需要保护碱基，引物没有保护碱 基能行吗？zmjo63O wrote:各位大侠，我想问一下，是否全部的per引物都需要保护碱基，引物没有保护碱基能行吗？in case that u make T/A cloning, blunt end cloning, u dont need 保护碱基请教：我的i500bp的目的片断经质粒抽提后进行Bamhi和Ndei双酶切，两个小时后检测，目的片断消逝，只看到200bp左右的弥散片断，请问消失这样的现象时否由于酶切时间过长，TAKARA公司和MBI的酶我都用过，都是这样的结果。但是转化DH5a菌后再抽提

39、质粒进行酶切，就能切出目的条带，而且是有时能切出条带，有时候检测什么都没有了，请问这是什么缘由？特别感谢screen.width-333）this.width=screen.width-333 width=35。height=49title=Click to iew full 024CC72BDC3606225C9A4CFACA585B10.JPG （350 X490） border=o align=absmiddle各位请问一下灭活内切酶的温度要求是多少?不知道还有没有人关注此贴了！我想问个问题：我做酶切连接老是不胜利.我的PCR产物是用胶回收的，回收完,估量后，酶切,20微升体系,400n

40、g的DNA,o.5微升的NCO I，切2.5小时！酶失活后，用乙醇沉淀后，再用0.5微生Sal I切2.5小时，也是20微升体系！最终胶回收酶切PCR产物与同样的方法酶切载体一起电泳，估量,16度14小时连接.转化只有1 0个左右，不知各位高手能不能给点建议，帮我改进一下，让转化率高一些！感谢！请教高手，我的PCR产物酶切过夜后用琼脂检测就什么都看不到了，酶切3个 小时还能检测到产物，4个小时就什么都检测不到了更别提过夜了，请问这是为 什么啊？是酶的活性问题还是PCR产物的问题啊？我想问各位高手：用Hpal和Ncol （均为大连宝生物的）进行双酶切时，可否 同时切，它们没有共BUFFER,但H

41、pa I的BUFFER是K,Nco I的BUFFER是K 加BSA,而且反响温度都是37。还有假如是不能，需要一个一个切的话，应先 切那个呢？切完应如何进行乙醇沉淀纯化呢？具体是怎么操作呢？感谢教导！BUFFERK 力口 BSA 切我是标准的新手大家肯定要多教导啊呵我好不简单要了一个带目的基因的质粒 可是没有构建图请问怎么办啊 设计引物PCR拉出来吗？目的基因差不多2KB ,还是用最外边的酶切？都有什么好方法啊我现在不知从哪下手阿各位大侠帮助啦ftp: 162.105.82.25/课件一koala to susanfly/分子生物学/生科/分子生物学.rar,连不上，急啊，有哪位好心人能否重新

42、上传一下【酶切问题争论专栏】【酶切问题争论专栏】如何选择酶切缓冲液，如何提高酶切效率，尤其是PCR产物的酶切、双酶切、特殊酶切，总结了以下几点，盼望对大家有关心，欢迎补充！lPCR产物的酶切。i&age=o#62o693 : age=o#72O7992.加了保护碱基可能也会遇到切不动的问题，切不动可以从以下方面考虑:（1）酶切缓冲液。每种酶都有公司供应的最正确缓冲液，它们的差异只是离子浓度与体系的不同，如Na、k、Mg等，还有PH值及缓冲体系（一般Tris-HCl）, 此外酶加甘油和DTT作为保护剂。在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓 冲液，要到达高酶切效率，选择是个问题，假如酶切时间和量

43、足够，解决的方法:（A）使用其中一个酶的缓冲液，但要考虑到另一酶的反响效率，反响效率如何, 可以查查酶在不同buffer里的效率参数，具体见公司网站，如NEB供应了很好的buffer参数： :/ / circuit. neb. com/neb / tech/tech_resource / restriction/buffers/buffer_c hart.html o（B）使用它们的通用的缓冲液，使两种酶在同一缓冲液里到达也足够的酶切效 率；没有通用的BUFFER怎么办呢？分两次酶切。即先用一种酶切，胶回收后 再用另一种酶切。一般先低盐后高盐，这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都 得到最大的酶

44、切效率，但缺点是要回收，损失大；（C）克隆到T载体中，值得推举的方法，克隆到T载体中，不必要考虑受这个 条件的限制，酶切位点也可以用T载体上自带的。（2）酶切温度。酶切温度也很重要，一般的酶切最适温度为37度，有些特殊的酶的反响温度不同，如Sma I为30度。双酶切时这种状况下最好分开切,先低温后高温。（3）酶切时间。酶切时间直接影响到酶切是否完全，一般为i-3h,这个时间已经足够，对于一些活性较好的酶，3omin就可以酶切完全，建议在酶切lh后取 5U1跑电泳以鉴定酶切效率；PCR产物的酶切时间较长，一般过夜。（4）酶失活。假如使用酶解冻后放置太久，可能导致酶失活。这种状况较少见, 只能换新

45、酶。假如拿了不同公司的酶，buffer也不一样，怎么办？放心，可以用 不同公司的酶进行双酶切，一般不会有问题的。可以先查查NEB的酶在不同缓 冲液中的活性百分比，选择它们都有适中活性的buffer,每个公司生产的酶反响 缓冲液针对特定内切酶是最合适的！（5）酶切体系。选用多大的酶切体系取决于你的样品浓度，在双酶切的时候为了 得到质量高的电泳图，尤其插入的是小片段DNA,酶切后产物量较少，可以增 加酶切重组DNA的量和增加上样量，建议酶切前测定一下DNA浓度或跑电泳 看看DNA有多浓，做到心中有数。相关帖子 : age=o#88696iage=o#458396age=o#893847关于保护碱基

46、的资料：Cleaage Close to the End of DNA Fragmenti.doc （104.5k）wangjun2002274的工作特别精彩，建议加分，值得学习！支持！ ！请问前辈：为什么双酶切时要先切低温再切高温？假如酶切过夜会影响酶切效果吗？主要是考虑到酶活性的维持。温度对酶的活性影响很大，温度高，简单造成某些酶的失活；双酶切时，由于有2种的限制酶存在，2种酶可能有不同的最适反响温点，当1种酶在其最适温点 反响时，为了不使另1种酶降解或失活，所以双酶切时要先切低温再切高温。请问PCR产物酸切过夜，对连接没影响吗？紧急求助！万分感谢！ ！构建ector3个月没结果！我的载体

47、是PstI单酶切，脱磷。目的片段是PCR产物切胶回收PstI单酶切（切2.5h,引物设计加6个保护碱基）,，然后又切胶回收，再连接，阴性比照长一些兰斑（可能脱磷不彻底），但样品只长几个白斑，鉴定全是假的。请问高手问题出在哪？是不是目的片段没切动导致没连上？载体是PCAMBIA13。，目的片段9.7kb。你的目的片段9.7kb,有点大，胶连有点困难了.可以考虑液连.用Agrose酶把你的胶溶解.并提高目的片段的纯度和浓度.还有就是你的PCR产物PstI单酶切的问题，由于你跑胶看不出酶切的效果.可用一有PstI酶切位点的环质做比照一起酶切,可以看出局部问题.你的载体脱磷也确实是个麻烦，每次做阴性比照也很对，但脱磷的程度要看你自己的把握了，脱磷不彻底和太过了也不好.不过,CIP肯定要保证活性.最好用新的.特别感谢biotin,我再试试。我个人认为，一般不到万不得已，没必要先回收再酶切，损失太大，绝大多数双 酶切可在ix通用buffer中先切1小时，再在2x通用buffer中切1小时，可解决 绝大多数酶切问题。不过先回收，也能保证酶切的效率，假如P