RelB-BLNK轴确定前列腺癌放射治疗期间细胞对新型氧化还原活性剂倍他米松的反应.docx

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1、RelB-BLNK轴确定前列腺癌放射治疗期间细胞对新型氧化还 原活性剂倍他米松的反响抽象活性氧（ROS）的异常水平是有助于癌症治疗效果和癌症治疗副作用的潜在机制。非规范氧化还原敏感NF-kB家族成员RelB 的上调在前列腺癌（PCa）中具有放射抗性。我们筛选了 FDA批准的化合物，并将倍他米松（BET）确定为一种药物，可增加 体外过氧化氢水平并保护非PCa组织/细胞，同时增强体外和体内PCa组织/细胞的辐射杀伤。值得注意的是，BET增加ROS 水平，并对正常细胞和PCa细胞中的RelB表达产生不同的影响。BET诱导正常细胞中Re旧和RelB靶基因的蛋白质表达，包 括初级抗氧化酶，钵超氧化物歧化

2、酶（MnSOD）,同时抑制LNCaP细胞和PC3细胞中RelB和MnSOD的蛋白质表达。RNA 测序分析将B细胞连接蛋白（BLNK）确定为一种新的RelB互补伴侣，BET在正常细胞和PCa细胞中差异调节。RelB和BLNK 上调并与PCa在人类样本中的侵袭性相关。RelB-BLNK轴易位到核室以激活MnSOD蛋白表达。BET促进正常细胞中的 Re旧-BLNK轴，但抑制PCa细胞中的RelB-BLNK轴。RelB-BLNK表达的靶向破坏减轻了 BET对正常细胞的放射保护作用和 BET对PCa细胞的放射增敏作用。我们的研究确定了一种新的Re旧互补伴侣，并揭示了一种复杂的氧化还原介导机制，说明 Re

3、旧-BLNK轴至少局部地通过刺激正常细胞中的适应性反响将PCa细胞推向氧化应激超负荷来触发对氧化还原活性剂BET的 差异反响。关键字:氧化还原状态;Re旧;断续器;倍他米松;辐射1.引言前列腺癌（PCa）是美国男性癌症死亡的第二大原因。虽然放射治疗（RT）对于控制癌症的生长很重要，但它存在增 加不良副作用的重大风险，包括对正常组织的伤害。鉴于PCa的发病率占美国所有癌症病例的10%以上，迫切需要旨在预防正 常组织损伤同时提高RT疗效的新治疗方法。这些方法的开展将对PCa控制和PCa幸存者的生活质量产生重大影响2。活性氧（ROS）的产生占癌症治疗的近50%3, 4o低至中水平的ROS刺激生长和存

4、活，而高水平的ROS刺激死亡途 径2, 5, 6, 7。由于癌症的氧化还原状态是重新布线的，因此已经提出了使用促氧化剂将肿瘤细胞推入氧化应激超负荷并刺激 正常细胞适应性反响的有效方法，作为选择性增强癌细胞而不是正常细胞杀伤的有效方法8, 90ROS被认为是基因表达调控的第二信使。NF-kB家族是一种转录因子，对细胞氧化还原变化特别敏感。NF-kB以非活性 形式存在于细胞质中，与抑制性I B蛋白结合。NF-kB活化对其靶基因的影响取决于靶基因启动子/增强子区域中NF-kB结合位 点的结构和可及性。p50/p65 （NF-kB1/RelA）异源二聚体和p50同源二聚体是NF-kB1信号通路中最常研

5、究的二聚体10。相 比之下，非规范二聚体p52/RelB在肿瘤发生和癌症治疗中研究缺乏11, 12。从机理上讲，IKKc（的活化和随后的p100降解导 致Re旧及其连接蛋白的募集，从而诱导与NF-kB家族的其他成员（包括p52, p50和RelA）形成Re旧二聚体13, 14。当 RHB与下游靶标的启动子结合时，其伴侣或调节因子可以被激活，随后触发细胞内信号级联反响，促进癌细胞的侵袭性生长。 我们之前的研究说明，RelB的过表达可以保护PCa细胞免受RT的影响，而Re旧的敲低会使PCa对RT敏感15, 16, 17。 我们还说明，RelB表达增加了小鼠PCa异种移植肿瘤模型中的致瘤性18。在这

6、项研究中，我们测试了一个假设，即温和的促氧化剂会在放疗期间刺激正常前列腺的适应性反响，但将PCa细胞推 入氧化应激超负荷。为了以公正的方式测试这一概念，我们筛选了 FDA批准的药物库，这些药物在正常细胞和PCa细胞中产 生相反的作用并增加过氧化氢（ h2o2）在正常细胞和癌细胞中。鉴定这些化合物的标准是：（1）它们保护非癌细胞免受RT 诱导的细胞毒性；（2）它们杀死PCa细胞；（3）增加H2o2pCa细胞和非癌细胞的水平。我们鉴定并验证了类固酸倍他米松 （BET）不仅具有所有必需的特性，而且还抑制PCa细胞中的RelB表达并诱导非癌细胞中Re旧的表达。值得注意的是，我们tiRNAA siRNA

7、 S4RNA 9*RNA RelB/ 5 RetB BLMK BINKB SuptoILBLNKZ5 7 &SMUplou.WC JPRelB(R) siRNA Ctrl - - -BLNKBLNKBLNKBLNKSiRNA图7.BLNK与RelB的相互作用是正常组织中RT诱导损伤的BET保护信号。用siRNA （圣克鲁斯生物技术）转染细胞48小时, 然后用BET处理24小时。蛋白质印迹分析（A）和（B） PC3和（C） PZ细胞的蛋白质定量。n = 2o （D） IP分析证实，RelB： BLNK轴与Re旧敲低一致。WC =全细胞裂解物。R =抗兔抗体。G =抗山羊抗体。（E）台盼蓝测定和（

8、F）代表性照片表 明，无论是否进行BET处理，siRNA对Re旧，BLNK或RHB + BLNK的细胞活力降低。c = 3。*p值0.05与非BET。比例 尺二50 pm。3.讨论在这项研究中，我们筛选了 FDA批准的药物库，发现BET具有以下特性：（1）它通过辐射增强癌细胞死亡并保护非癌 细胞免受辐射毒性；（2）增加 h2o2 在癌细胞和非癌细胞中产生。这些特性支持我们的假设，即癌细胞对产生ROS的疗法的 选择性致敏可能会驱动已经具有高组成性氧化应激水平的癌细胞走向死亡。然而，正常细胞能够通过适应性反响维持氧化还原 稳态。BET是一种糖皮质激素，被批准用于治疗造血系统的炎症和癌症23, 24

9、o糖皮质激素家族的成员，例如泼尼松龙和地塞 米松，已被证明可以减轻激素难治性PCa患者的疼痛25, 26o我们的研究首次证明BET保护正常前列腺细胞免受RT诱导的 损伤，但加剧了 PCa细胞对RT诱导的死亡的易感性。从理论上讲，BET可以调解 h2o2 当类固醇与质膜结合时产生27, 28o由于类固醇的独特结构29, BET介导的h2o2产生可能是由于BET的氧化还原循环，PROoxidant/抗氧化剂可以引起 正常细胞的保护反响，但在RT后增加对肿瘤细胞的伤害。除了 BET之外，使用氧化还原循环化合物作为靶向癌症的辅助治疗 的关键概念正在我们的实验室和其他实验室进行中。重要的是，我们的研究说

10、明，在RT时，BET介导的 h2o2 产生触发RelB 介导的MnSOD蛋白在非癌细胞中的表达，但不在PCa细胞中表达。请注意，BET + RT时MnSOD蛋白表达的变化大于SOD2 mRNA, PC3细胞中MnSOD蛋白表达的变化显着降低，但LNCaP细胞和DU145细胞中MnSOD蛋白表达的变化略有降低。 MnSOD蛋白表达程度的差异可能是由于每种细胞类型的氧化还原状态，它们的遗传背景以及MnSOD的其他转录因子（如SP-1） 的差异。因此，MnSOD （一种主要的线粒体抗氧化剂）的上调可能防止RT诱导的线粒体损伤和非癌细胞死亡。值得注意的是， 无论基内幕胞氧化还原状态如何，BET都会激活

11、类似的 h2o2pz 电池和PC3电池的生产。这些数据说明，BET介导的ROS 产生可能引发PZ细胞中MnSOD的保护性反响，以及MnSOD介导的H的增加。 2o2 有助于癌细胞的杀伤作用。有趣的是, RT产生ROS, RT也在正常细胞和癌细胞中诱导Re旧。观察到的BET和RT对PCa细胞中RelB表达的差异效应可能是由BET 产生ROS与RT的不同机制引起的。脊椎动物 Rel/NF-kB 转录因子（c-rel、RelA RelB、NF-kB1 （p50/p105）和 NF-kB2 （p52/p100）在免疫、炎症/ 应激反响中起着至关重要的作用，并且是肿瘤生存的关键30, 31。RelB转录

12、活性依赖于含有两个NF-kB结合位点的无TATA 启动子。一个NF-kB位点主要结合p50,而另一个那么与RelB结合并由RelB转激活32。在结构上，Re旧需要其N端和C端 进行转录激活33。RelB的N端还包含亮氨酸拉链。由于其结构不寻常，Re旧仅与p50或p52二聚，不能形成同源二聚体34, 35o我们之前曾报道过Re旧调节MnSOD 16。在这里，我们证明了 BLNK作为Re旧互补伙伴，在BET + RT治疗期间调节 MnSOD表达。基于PPI模型，我们提出BLNK在蛋白质水平上与RelB相互作用，并在BET + RT期间通过S。启动子/增强 子处的Re旧结合位点共调节SOD2基因的表

13、达。单独BET处理时同时敲低Re旧和BLNK,尽管在统计学上没有差异，但略微 促进PZ细胞中的MnSOD蛋白表达并略微抑制PC3细胞中的MnsOD蛋白表达（图7B, C）；我们提出，调节MnSOD或未识 别的RelB伴侣的其他转录因子可以补偿在MnSOD中观察到的微小变化。由于我们观察到PC3细胞中（1） BET诱导的细胞 死亡和（2） PZ细胞中BET促进的细胞活力的抑制，随着MnSOD的微小变化，我们提出其他未识别的Re旧调节因子/伴侣或 RelB下游靶标也可能有助于BET的抑制作用。例如，RelA是Re旧稳压器;然而，我们没有观察到非PCa细胞或PC3细胞中 RelA活性的一致变化（补充

14、图S10）。因此，BET对Re旧表达的变化可能是与RelA无关的。请注意，除了 Re旧和BLNK之 外，在BET和BET + RT上观察到的表型变化可能是由其他蛋白质和途径引起的，因为RNA测序显示至少有100个基因在这 些治疗中PZ增加，但PC3减少（图5A-C）。未来专注于其他途径的研究，如TNF-o,将增加对氧化还原循环剂作出反响的其 他介质的知识。这些可能性很有趣，对于未来的研究来说将是一个有趣的话题。BLNK是B细胞上抗原受体的一种连接蛋白，参与PI3K/Akt途径，导致JNK和ROS的产生，并促进B细胞的增殖/存活 36o BLNK的敲低导致B细胞白血病细胞凋亡37。BLNK的一个

15、机制是以前没有探索过的，那就是它与RelB的合作关系。 值得注意的是，通过使用RNA测序，再加上PLA,双免疫金标记和IP的广泛验证，我们提出BLNK是RelB的新型互补伙伴， 特别是在BET/RT介导的 h2o2 生产。由于使用BLNK抗体的ChIP测定没有产生SOO2启动子/增强子区域的DNA片段（数 据未显示）,因此BLNK很可能不直接与SOO2基因结合，而仅在BET治疗期间与Re旧结合作为互补伴侣。这些发现提出了 BLNK参与感知和调节细胞氧化还原状态的可能性，这使得细胞能够适应它们对ROS信号传导的依赖，以进行促增殖和抗凋亡 活动。此外，BLNK可以促进Re旧易位到细胞核，因为BLN

16、K水平的增加与核RelB相关。ROS生产是BET以前未被认可的属性。图8说明了所提出的ROS-介导机制，显示了 BET如何保护正常细胞免受RT诱 导的损伤，同时加剧RT诱导的癌症杀伤。BET介导的ROS产生增强正常前列腺细胞中的RHB-BLNK相互作用，但抑制PCa 细胞中的RHB-BLNK。我们的结果支持了一个关键概念，即细胞氧化还原状态的内在差异，Re旧-BLNK轴以及正常细胞和癌细 胞对前氧化剂的不同适应性反响可用于鉴定可预防正常组织损伤的药物，同时提高RT疗效。RT在控制局部PCa方面的效率很 可能有助于大量PCa幸存者在癌症治疗后享受长寿，富有成效的生活池因此，迫切需要保护正常组织而

17、不降低RT效果的氧化 还原活性剂。鉴于BET调节RelB-BLNK复合物水平，并考虑到TCGA数据库确定的PCa患者中RelB和BLNK的高表达水平， 本研究强调了一种新的精准医学方法，以减少RT在PCa患者中的副作用。Normal Cell-Low ROSRTCancer Cell-High ROS1111BINK)BET-mediatedBET-mediatedBLNKBLNKMnSODMnSODIncreased oxidative stress induced cell deathIncreased antioxidant defended against injury图8.BET介导

18、的ROS产生如何使PCa细胞对RT引起的死亡敏感，同时保护非PCa细胞免受RT脱靶效应的伤害。癌细胞的 异常氧化还原稳态使氧化还原修饰剂BET能够通过选择性致敏来提高放射治疗效果。在生理条件下的正常细胞中，细胞氧化还 原状态保持在低氧化水平。细胞氧化还原状态从BET + RT向氧化条件的转变将刺激RelB-BLNK的表达并易位到细胞核，从而 导致抗氧化系统（包括MnSOD）的上调。MnSOD的上调维持正常细胞中的氧化还原状态并促进细胞存活。相反，癌细胞通常 处于高氧化条件下。通过BET+RT调节的ROS水平的可比变化到极端氧化状态将导致细胞死亡。绿色箭头=激活;红线=抑 制。4 .材料和方法细

19、胞培养、试剂人PCa细胞系，PC3细胞，DU145细胞，LNCaP衍生细胞系，LNCaP-C4-2B （C4-2B） , LNCaP细胞和PZ细胞是从 美国型培养收集（ATCC）获得的。这些细胞系使用ATCC的短串联重复（STR）分析服务进行认证，并定期检查支原体污染 （MycoSensor PCR测定，Thermo Fisher,佛罗伦萨，肯塔基州，美国）。如前所述，在RPMI 1640培养基中培养细胞。在所有实验中使用传代少于15次的细胞。PrECs是从龙沙（瑞士巴塞尔）获得的，并在制造商建议的媒体中保存。化学品和试 剂是从西格玛化学公司（美国密苏里州圣路易斯）购买的。细胞培养试剂从赛默飞

20、世尔科技购买。除非另有说明，否那么一抗和 二抗均从圣克鲁斯生物技术公司获得。金偶联二抗来自英国BB International Cardiss。倍他米松从美国药典（美国马里兰州罗 克维尔）获得，用于体外实验（99%纯度，粉末，USP/ FCC级）W Cardinal Health （美国俄亥俄州都柏林）用于动物实验 （注射剂，倍他米松磷酸钠）。BET是在申请前新鲜制备的。细胞存活分析、放射治疗根据细胞类型，通过集落存活（6孔板，每孔100-500个细胞）或MTT测定（96孔板，每孔1000-5000个细胞）（特 雷维根，盖瑟斯堡，马里兰州，美国）来量化细胞存活分数38。在BET处理之前，用20

21、0单位PEG-CAT预处理细胞24小时。 存活分数（SF）计算为形成的集落数与有效接种细胞数的比值，并按如下方式校正接种效率（PE） ： $5=菌落计数/接种x细胞 （PE/100） 39o对于联合治疗，RT与BET治疗同时通过250 kVX射线机（Faxitron X射线公司，亚利桑那州图森，美国） 进行，峰值能量为120 kV, 0.05 mm Al过滤器，剂量为。至6 Gy。DO值（将生存分数降低到37%的剂量）是根据线性-二次 生存曲线的线性局部计算的21。线性二次（LQ）模型使用。（单击杀伤）和B （两击杀伤）项，它们分别与低剂量杀伤和高剂 量杀伤相关。LQ模型可用于确定各种剂量分储

22、方案之间的生物等效剂量。4.3. H的量化2o2水平将细胞与50pM Amplex红色试剂（Thermo Fisher）在37下孵育30分钟。使用双子座XPS酶标仪（Molecular Devices, 加利福尼亚州圣何塞,美国）在ex/em 550/590nm处检测到荧光。说明 h2o2-特异性荧光，PEG-CAT如上所述使用。H 的细胞内生成 2o2 使用基于氨基三噗介导的CAT失活的灵敏测定法进行估计，如Wagner等人先前所述40。在100mm组 织培养皿中以70-90%汇合的细胞用BET处理6小时，然后加入20mM 3-氨基三喋（3-AT）并在37P下孵育0, 5, 10, 15,

23、30和45分钟。将细胞冲洗两次并用冰冷的50mM磷酸盐缓冲盐水（PBS）收获，并收集pH 7.4和沉淀。 h2o2 通过动力学 分析计算CAT活性下降速率的浓度41。分光光度法CAT活性通过添加30 mM H启动2o2贝克曼DU-600紫外可见分光光 度计（贝克曼-库尔特，加利福尼亚州富勒顿，美国）监测240nm处的吸光度损失。通过将实验数据拟合到一阶动力学来计算 初始CAT活性，并以过氧化氢的kmU/mg细胞蛋白表达。FDA批准的药物的筛选分析Enzo Screen-Well FDA批准的药物库版本2 （786种批准的药物，补充Excel文件）是从肯塔基州列克星敦肯塔基大学 药物研究与创新中

24、心获得的。将细胞接种（2000个细胞/孔，96孔板一式两份）并与药物在二甲基亚飒（DMSO）中孵育（筛 选剂量为10pM）。MTT和Amplex红色测定在24小时孵育后进行。此外，将RT （4 Gy）与所选化合物组合应用于-组单独 板上的PZ细胞（1000个细胞/孔）。然后在RT后96小时进行MTT测定，选择顶级候选药物并用nm至pM的不同浓度进行 验证。蛋白质印迹和IP蛋白质印迹和IP协议之前已经描述过42。蛋白质水平通过布拉德福德测定测定。使用针对RelA, ReIBCThermo Fisher）, BLNK （Abeam,剑桥，英国），MnSOD （Millipore Sigma,德国达

25、姆施塔特）和GAPDH或小肌动蛋白（Sigma）的一抗。 使用增强的化学发光检测系统可视化蛋白质印迹（Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, UK）。对于IP实验，首先将 硝酸纤维素膜与RelB抗体一起孵育，进行条纹化，然后用BLNK抗体重新探测（由于Re旧和BLNK的MW接近）。实时荧光定量PCR使用MagNA Pure Compact RNA别离试剂盒（瑞士巴塞尔罗氏）从细胞中别离mRNA,使用TaqMan逆转录试剂盒 （Thermo Fisher）进行反向转录，并使用UghtCycler 480实时荧光定量PCR系统（罗氏）和基因特异性引物（Invit

26、rogen, Carlsbad, CA, USA）进行分析，如下所示：RELB： Scacttcctgcccaaccac-S（正向） # 5,-gacacggtgccagagaga-3（反向）BLNK： 5-cgagtgctcatctggattttcc-3（正向）# 5-agagagccctgctgacga-3（反向）RELA5,cgggatggcttctatgagg-3, （forward） and 5,-ctccaggtcccgcttttt-3, （reverse）SOD2： 5agcatgttgagccggt-3（正向）W 5-aggttgttcacgtaggccgc-3（反向）B-肌动

27、蛋白：5Lccaaccgagagatga-3（正向）# 5-ccagaggcgtacagggatag-3（反向）相对mRNA拷贝数由2-AAct方法43。NF-kB （RelB-DNA）结合测定和 ChlP使用基于ELISA的TransAM NF-kB家族试剂盒（活性基序）制备核提取物并测量Re旧-DNA结合活性9。穿孔断续器琼脂糖ChlP试剂盒（Thermo Fisher）用于研究RelB介导的转录调控。使用RelB抗体拉下的染色质和位于人SOD2基因的I2E启动子/增强子区域的含有NF-kB元素的DNA片段通过定量PCR进行分析。PCR引物序列为5-cggttatgaaatttgttgag

28、ta-3 （上链）和 5-ccacaagtaaaggactgaaattaa-3（ ） MnSOD 夕卜显子 2 被放大为非靶向对照。弓I 物序歹 U 为 5-tgaccgggctgtgctttcg-3 （上链）和5-actgcctcccgtctccc3 （下链）。ChlP-qPCR数据通过输入准备进行归一化。RNA测序和数据分析使用MagNA Pure Compact RNA别离试剂盒别离mRNA。使用生物分析仪（安捷伦）确认RNA浓度和RNA完整性（RIN）。 仅将RIN8.5的样品用于全转录组RNA测序。使用整个FlowCell HiSeq 2500 Rapid Run （Illumina

29、 Inc.（美国加利福尼亚州圣 地亚哥）执行配对端测序策略，读取长度为100 bp。文库制备（TruSeq标准总RNA） , RNA测序和质量控制由肿瘤基因组 学共享资源设施执行。对于每个图书馆，至少获得了 4000万次阅读。原始测序数据被转移到生物统计学和生物信息学设施进行 数据处理和分析。使用Cutadapt （v1.4）对测序读取进行修剪和过滤44。使用Ensembl GRCh38注释gtf文件提取参考转录 本。使用STAR45进行转录组比对，使用RSEM估计基因丰度46。我们使用edgeR 47进行差异表达分析，以比拟每种治疗 条件下的两种细胞系（PC3细胞和PZ细胞）。显著上调或下调

30、基因被确定为22的倍率变化，假发现率q值oCompounM(10|AI)D. Top compoundsBetamethasone (BET)PZ with 4 GyCompourxS 2H0M.9-a gnboBMOU-S90W.U.exn图1.FDA批准的化合物的文库筛选,用于通过调解H诱导PCa细胞死亡同时提高非癌性前列腺细胞活力的化合物2。2生产。PC3细胞和PZ细胞用FDA批准的药物处理24小时。（A）细胞活力。（B）细胞外h2o2 基于Amplex Red测定法。（C）药物和辐射（4 Gy）治疗后的细胞活力。对每种化合物的重复孔进行测试。（D）从基于H的786化合物库中选择候选 药

31、物 2o2 产生和对非癌细胞和癌细胞施加相反的细胞毒性作用的能力。一个点代表一个化合物。请参阅补充excel文件，了 解每种化合物的详细信息。.PrEC dpz BC4-2B *PC3-*-LNCaP - DU145H2O2 Production5 gM BET (h)06122448PZPC3c BET at 6 hr Vehicle BET 5 uM3三 qBs一石。 Vehicle BET onlyPEG-CAT 200 unit PEG-CAT 200 unrt*BETPZ PC3 VehicUoBETontyPEG-CAT 200 Unit PEG-CAT 200 un*.BETPZ

32、 PC3PrEC PC3图2.BET诱导PCa细胞死亡，同时通过H的介导提高非癌性前列腺细胞的活力2。2生产。在不同时间点用5PM BET处理 细胞。（A）基于MTT测定的细胞活力。（B）细胞外 h2o2基于Amplex Red方法的产量（pM） （24小时）。（C） 细胞内 h2o2 使用氨基三理-（3-AT）介导的CAT灭活方法（6小时）测量产量。（D, E）与载体相比，BET之前用PEG-CAT 治疗后的细胞活力*p值W0.05。n = 3oBET作为正常组织的放射保护剂,同时增强PCa在体外和体内的RT功效为了确定BET对正常细胞的差异效应是否阻止RT诱导的细胞死亡，用BET （1至20PM）和RT （0至6 Gy）处理PZ 细胞。采用菌落存活测定法，根据线性二次曲线生存模型计算D0 （将细胞存活数量减少到37%的辐射剂量20, 21。与较高的 DO值相比