药物分析学：药物的含量测定.docx

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1、第六章药物的含量测定第一节概述1、药物的含量是药物质量的主要指标含量测定（assay）理化方法测定效价测定（assay of potency）生物学方法或酶学方法测定2、化学原料药的含量测定：强调测定结果的精密度3、制剂的含量测定：偏重方法的选择性4、药典对药物的含量限度的表示方法原料药：以表示（一般以干燥品或无水物计）凡未规定上限的，药典凡例中规定，其含量上限不得超过101.0%按原料药本身形式计算其含量由于药物组成不定，需以另一种稳定形式计算含量举例地塞米松磷酸钠 按干燥品计算，含C22H28FNaO8P应为96.0%.1020%硫酸庆大霉素按无水物计算，每Img的效价不得少于590庆大霉

2、素单位 阿司匹林含C9H6。4不得少于99.5%氢氧化铝含氢氧化铝按AI2O3计算，不得少于48.0%5、制剂的含量限度表示方法：按标示量计算标示量=规格量二处方量例：维生素B1注射液含维生素B1应为标示量的95.0% 105.0%直接用含量规定范围例：复方碘溶液含 I 应为 4.50% 5.50%含 KI 应为 9.5% 10.5%以重量规定含量范围例：复方磺胺甲嗯哇片磺胺甲嗯陛0.3600.440g /片甲氧茉氨嗒咤72.088.0mg /片令 常用含量测定方法（2005年版ChP）仪器法容量法其他法HPLC29.4%非水法15.3%生物学8.1%VIS-UV21%酸碱法7.5%重量法0.

3、8%旋光0.5%银量法3.4%原子吸收0.3%碘量法3.3%GC0.3%EDTA 法2.9%荧光0.1%亚硝酸钠法2.1%其他容量法5%4、AAS法的局限性主要是工作曲线的线性范围较窄，一般为1个数量级；每测一种元素需要更换1个灯，对于 多种元素同时测定时非常不便第四节色谱分析一、HPLC 法 根据固定相与流动相的极性大小，分为：NP-HPLC以吸附机理为主RP-HPLC以分配机理为主 RP-HPLC法适合于中等极性或非极性的弱酸、弱碱和中性化合物的别离分析绝大局部药物均可用RP-HPLC法进行分析1、RP-HPLC（1）色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶（ODS或C18、C8柱、氨基柱、氟基柱等（

4、2）流动相：甲醇-水（或缓冲盐）、乙月青-水（或缓冲盐）、四氢吹喃-水（或缓冲盐）（过 滤脱气）（用过缓冲盐或酸碱流动相后，色谱柱必须用低浓度甲醇液冲洗，以除去酸 碱盐，然后再用甲醇冲洗）洗脱力强弱依次为四氢吠喃一乙睛f甲醇f水（3）化学键合固定相适用pH28的流动相；C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故流 动相中有机溶剂的比例应不低于5%,否那么C18链的随机卷曲将导致组分保存值的变 化，造成色谱系统不稳定（4）色谱条件选择调节流动相中有机溶剂比例可调整被测物的保存时间，近似规那么：流动相中有机溶剂降低10%,溶质的容量因子约增加3倍40%甲醇的强度二33%乙月青二23%四氢映喃也可用三

5、种、四种混合溶剂作为流动相2、NP-HPLCNP-HPLC硅胶柱流动相溶剂有：正己烷-异丙醇；正己烷-乙醇；正己烷-二氯甲烷等洗脱力强弱依次为乙醇-异丙醇一二氯甲烷-正己烷 正-反相色谱相互转换时，须用过渡溶剂依次冲洗 如由反相一正相时，依次用甲醇-异丙醇一正己烷冲洗 而由正相一反相时，那么以反方向进行冲洗3、检测器（1）选择性检测器 紫外、二极管阵列（DAD）、荧光、电化学 响应值与待测液浓度有关，还与化合物结构有关（2）通用型检测器 示差折光、蒸发光散射检测器 对所有的化合物均有响应更专属、更灵敏的检测器质谱不同检测器对流动相的要求不同，如紫外检测器应考虑有机溶剂的截止使用波长蒸发光散射检

6、测器和质谱检测器不允许使用含不挥发盐组分的流动相4、系统适用性试验1.70(%”2+忆/2)(2)别离度：R =%一% + %(1)柱效：n = lef-T(3)拖尾因子：T = &亚(T=0.95L05)2d(4)重复性：取对照溶液，连续进样5次，测得峰面积相对标准差RSD应小于2.0%令 系统的精密度：每次开机后，首先要做的日常工作，不能作为分析方法学研究中的精密 度试验5、色谱参数测量为满足系统适用性试验要求，可以改变一些条件，如色谱柱内径、长度、牌号、载体粒度、 流动相流速、组成比例、柱温等，但不能改变固定相种类，流动相组成和检测器类型6、测定方法与应用定量方法内标法和外标法HPLC法

7、是药物制剂、多组分样品分析的首选方法，是各国药典收载的方法中应用最广 的方法在原料药的含量测定中，HPLC法主要用于多组分抗生素或生化药品，或因所含杂质的 干扰测定，而常规方法又难以别离或别离手段繁杂的化学品种。如：-庆大霉素的组分测定，供内酰胺类、大环内酯类、四环素类等抗生素的含量测定留体激素类药物的含量测定例：醋酸氢化可的松的含量测定取对照品适量，精密称定，加甲醇定量稀释成每1mL中约含0.35mg的溶液。精密量取该溶 液和内标溶液（0.30mg/mL快诺酮甲醇溶液）各5mL,置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度， 摇匀，取10 L注入液相色谱仪。另取本品适量，同法测定，按内标法计算含量。：

8、对照品取样36.2mg,样品取样35.5mg,测得对照液中醋酸氢化可的松和内标的峰面 积分别为5467824和6125843,样品液中两者的峰面积分别为5221345和6122845,求本品 含量？二二二 /5467824/612584336.2mg35.5mgX1OO%=97.4%二、GC 法1、色谱柱一一分为填充柱和毛细管柱柱极性固定相非极性100%二甲基聚硅氧烷弱极性5%-苯基-95%甲基聚硅氧烷5%-二苯基-95%二甲基聚硅氧烷中极性35%二苯基-65%甲基聚硅氧烷50%二苯基-50%二甲基聚硅氧烷6%氟丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷14%氟丙基苯基-86%二甲基聚硅氧烷极性PEG-2

9、0MCarbowax 20 M2、载气有氮气、氧气和氢气由高纯度气体发生器或高压钢瓶提供，经过适当减压、除湿和纯化后进入进样器和色谱柱根据供试品性质和检测器种类选择载气，最常用的载气为氮气载气流速： 填充柱一般流速为3060ml/min毛细管柱一般流速为13ml/min检测器种类 FID检测器 氮磷检测器火焰光度检测器 电子捕获检测器 质谱检测器 热导检测器3、检测器特点对碳氢化合物有良好响应，适合大多数药物对含氮、磷元素的化合物有很高的灵敏度对含磷、硫元素的化合物灵敏度高适合于含卤素的化合物给出某个成分的结构信息，用于结构确证可用于水分等测定4、进样方式与进样量（1）溶液直接进样：手动、自动

10、今手动进样时应注意操作的一致性，以到达良好的精密度要求令填充柱进样量不超过数微升令 毛细管柱进样不超过1微升，分流进样（2）顶空进样一一体积一般为1毫升5、系统适用性试验与测定方法e 系统适用性试验同HPLC项下的规定令 为到达系统适用性试验要求，可改变色谱柱内径、长度、载体牌号、粒度、固定液涂布 浓度、载气流速、柱温、进样量、检测器的灵敏度等。但不得改变检测器种类、固定液 品种及特殊指定的色谱柱材料今 一般色谱图约于30分钟内记录完毕今内标法、外标法和标准溶液加入法令 应用一一例如：维生素E及其制剂的含量测定第五节 药物含量测定方法验证1 .专属性（空白、可能的杂质、辅料、破坏试验、粗品），

11、提供相应图谱.线性与范围（至少5个浓度系列标准液）2 .精密度（重复性、中间精密度和重现性），用高中低浓度9次测定结果评价.准确度（回收试验、加样回收试验），高中低浓度9次测定结果评价3 .耐用性（不同牌号柱、流动相组成比例、流速、pH、温度、测定液稳定性等）令回收试验R=C测/C标义100%R= （C 总-C 底）/C 标 X100%举例：地非三晚注射液的HPLC含量测定方法学研究本章学习要求1、熟悉药物及其制剂的含量限度表示方法2、掌握容量分析滴定反响原理与含量计算方法；熟悉常用滴定剂、相应的基准物质和指示剂3、掌握HPLC法和GC法的系统适用性试验、含量计算；熟悉常用HPLC、GC色谱柱

12、、检测器、条件的选择4、掌握UV法测定药物含量的原理与计算方法；熟悉紫外-可见分光光度仪的检定方法；了解荧光分光光度法和原子吸收分光光度法测定药物含量的原理与应用 5、熟悉药物含量测定分析方法的验证实验第二节容量分析法一、含量计算1、原料药及以表示的制剂（1）直接滴定法样品=VxFxT/ WX100%浓度校正因子F=N实/N理滴定度T与1ml规定（理论）浓度的标准溶液所相当的被测物的mg数T= （M被测物/a ）X mol/L标准液（理论）a为与1摩尔被测物相当的标准液摩尔数。（2）剩余滴定法方法：样品+标准液1剩余的标准液1 + 空白+标准液1 剩余的标准液1 +样品二 （V 空白一 V 样

13、）xFxT/ WxlOO%（过量定量）标准液2回滴定一V2样（同样量）标准液2回滴定f V2空白2、相当于标示量的计算公式（1）片剂：VXFXT/WX 平均片重 V100%士 W为片粉重（2）针剂:1 VXFXT/W XX100%W为注射液体积3、以重量/片计的计算公式VXFXT/ WX平均片重二重量/片例1异烟脱含量测定称取异烟脱约0.25g,置100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取25mL, 加水50 mL与盐酸20 mL,加甲基橙指示液1滴，用澳酸钾滴定液（0.01667mol/L）缓缓滴定 至粉红色消失。：异烟册取样0.2545g ,消耗溟酸钾滴定液（F=L005）

14、18.30mL,每1mL漠酸钾滴定液 （0.01667 mol/L）相当于 3729mg 异烟当。CONHNH23 x 137.13TCOOH+ 3N2+2 KBr + 3 H2O+ 2 KBrO0.01667x1样品=V XFXT/WX100%X100% =99.1%_18.30 * - 0.2545/100X25X1000例2司可巴比妥钠的含量测定：取本品约0.lg,精密称定(0.1022g),置250ml碘量瓶中，加水10mL,振摇使溶解，精密加 溟滴定液(0.05mol/L) 25 mL,再加盐酸5 mL,立即密塞并振摇1分钟,暗处静置15分钟 后，微开瓶塞，加碘化钾试液10 mL,立

15、即密塞，摇匀，用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L) 滴定，至近终点时加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。：样品消耗硫代硫酸钠滴定液(0.lmol/L) 15.73 mL,空白试验消耗23.21 mL,每1mL 溟滴定液(0.05mol/L)相当于13.01mg的司可巴比妥钠，硫代硫酸钠滴定液F=L038。样品二 (V空白一 V样)XFXT/WX100%_ (23.21-15.73) X 1338X13.01 100。0.1022X1000=98.8%例3葡萄糖酸钙片含量测定取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于葡萄糖钙1g),置100ml量瓶中加水溶解

16、并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL加水75mL加氢氧化钠试 液15ml,用EDTA滴定液(0.05mol/L)滴定。每ImLEDTA滴定液(0.05mol/L)相当于 22.42mg 的 C12H22CaO14 H2O。：20片重12.0640g,取片粉l.2058g,消耗EDTA滴定液(0.0501 mol/L)l 1.22mL,规格0.5g/片规定取样量/规格二应称取片芯/平均片重可称取范应称取量10%lL22X22.42X(0.0501/0.05) x 12.064/201.2058X25/100 X 100005X100%=100.9%二、酸碱滴定法滴定类型一一多为强酸强

17、碱滴定弱碱弱酸药物，以盐酸、硫酸、氢氧化钠为滴定剂 溶剂一一根据药物的酸碱性、溶解度、稳定性等性质，选用水、中性乙醇等为溶剂 应用一一以水为溶剂：枸椽酸以中性乙醇为溶剂：芳酸类、磺酰胺类药物指示剂、滴定剂一一酚醐，氢氧化钠滴定液三、非水溶液滴定法本法主要用于测定有机碱及其氢卤酸盐、磷酸盐、硫酸盐或有机酸盐，以及有机酸碱金属盐 类药物的含量，也用于测定某些有机弱酸的含量e药典收载了两种方法：第一法为测定有机弱碱及其盐类第二法为测定有机弱酸及其盐类令常用非水溶剂种类溶剂种类最常用溶剂特性:酸性溶剂:冰醋酸，醋酊,甲酸:可增强有机弱碱的相对 碱度:碱性溶剂。乙二胺、乙醇 胺、二甲基甲酰 胺:可增强有

18、机弱酸的相对 酸度:两性溶剂。甲醇、乙醇兼有酸碱两性，用作不 太弱的酸碱物质的介质:惰性溶剂:苯，三氯甲烷,二氧六环:无酸碱性，常与上述溶 剂混合使用，增加滴定突 跃和试样的溶解性第一法(非水碱量法)精密称取供试品适量约消耗高氯酸滴定液(O.lmol/L) 8mL,加冰醋酸1030mL使溶解， 加各药品项下规定的指示液12滴，用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定。终点颜色应以电 位滴定时的突跃点为准，并将滴定的结果用空白试验校正1、影响因素：温度、水分、溶剂的选择、指示终点方法以及被测物酸根等(1)温度影响滴定与标定时的温度差异：超过10,那么应重新标定假设未超过10,根据公式校正(2)水分

19、影响反响体系中不应有水，因为水既是质子的受体，又是质子的供体，可与弱酸弱碱发生竞争, 影响终点判断（3）溶剂选择对于不同碱性的杂环类药物只有选择合适的溶剂和指示终点方法才能获得满意的滴定结果杂环类药物Kb10一81O-1010一110T2 氢漠酸 硫酸盐酸硫酸氢根 硝酸 磷酸、有机酸采取措施：HX加 HgAc2f HgX2H2SO4生物碱的硫酸盐通常为2分子生物碱与1分子硫酸成盐,可直接滴定至HS0-4（注意摩尔比）HNO3可氧化指示剂，改用电位法磷酸、有机酸无需处理，直接滴定2、应用胺类药物：盐酸利多卡因，重酒石酸去甲肾上腺素，盐酸克仑特罗、硫酸沙丁胺醇等 含氮杂环类药物：氢漠酸东蔗着碱、硫

20、酸奎宁、硝酸毛果芸香碱、马来酸氯苯那敏等; 维生素类药物：维生素B1第二法（酸量法）滴定液 溶剂一 注意一应用甲醇钠、甲醇锂、氢氧化四丁基胺二甲基甲酰胺滴定过程中应防止溶剂和碱滴定液吸收大气中的二氧化碳和水蒸气，以及滴定液中 溶剂的挥发异维A酸、苦氟嗥嗪、环此酮等四、其他方法银量法、碘量法和滤量法（直接滴定、剩余滴定、置换滴定）、亚硝酸钠法、络合滴定法费休氏水分测定法（Karl Fischer Titration）1、本法为非水氧化还原滴定反响，采用的滴定液称费休氏试液，由碘、二氧化硫、毗咤和 无水甲醇组成。利用碘氧化二氧化硫时需要一定的水分参加反响I2+SO2+2HI+S52、反响可逆，用毗

21、咤吸收生成的HI和S03,形成氢碘酸毗咤和硫酸酎毗咤。但硫酸酎叱 咤不稳定，无水甲醇可使其转变成稳定的甲基硫酸氢嗽咤I2+SO2+3I2+SO2+3+CH3OH+H2O 2|H+3、方法与计算测定方法：精密称取供试品适量（约消耗费休氏试液1 5ml）,除另有规定外，溶剂为无 水甲醇，用水分测定仪直接测定。或将供试品置干燥的具塞玻瓶中，加溶剂2 5ml,在不 断振摇（或搅拌）下用费休氏试液滴定至溶液由浅黄色变为红棕色，或用永停滴定法指示终 点，另作空白试验，按下式计算（Va-Vb） F供试品中水分闾二0x100%本法专属性强，准确度高，适用于受热易被破坏的药物的水分测定，如抗生素类药物的水分 测

22、定4、考前须知：（1）每1ml新配的费休氏试液约相当于5mg的水，由于试液不稳定，逐渐变质，因此费休 氏试液需在临用前lh内标定。一般F值应在4.0mg/ml以上，当F值降低到3.0mg/ml以下 时，滴定终点不敏锐，不宜再用。（2）本法测定结果的精确度取决于多种因素，如试剂成分的相对浓度、溶解样品的溶剂性 质、操作技术、空气湿度等，尤其是测定系统中的水分。因此必须严格规范操作，所用仪器 必须干燥，并能防止空气中水分的侵入，操作宜在干燥处进行，并注意避光，整个操作应迅 速，不应在阴雨天或空气湿度太大时进行测定。第三节光谱分析一、紫外分光光度法（-）仪器校正与检定1、波长校正：用汞灯中的较强谱线

23、或仪器中晁灯的486.02nm、656.10nm谱线进行校正2、吸收度的准确度检定：测定重倍酸钾的硫酸溶液在规定波长处的吸收系数进行检定3、杂散光的检查：用碘化钠，亚硝酸钠溶液测定规定波长处的透光率（二）对溶剂的要求以空气为空白（空白光路中不置任何物质）测定溶剂的吸光度（使用波长附近应符合规定）（三）测定法1、测定波长核对（规定波长2nm内），并以吸光度最大波长为测定波长2、吸收度读数范围（0.3-0.7）3、同批溶剂为空白试验（校正比色皿和空白溶剂的吸收）4、测定方法：吸收系数法、对照品比拟法、计算分光光度法、比色法（1）百分吸收系数法A= E1%cmXCXLC （%） = A/E1%cmA

24、 XF 样品 =E1%cmxWF =稀释倍数和浓度换算因子，W二取样量E值的大小反映了药物对某一波长光的吸收能力，也反映了测定反响的灵敏度。采用E法测 定含量时，一般取三位有效数字表示，E值小于100的一般不宜采用 例1:己酸孕酮称取己酸孕酮0.0105g,加无水乙醇溶解后，置10ml容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。吸取 1.00ml,置100ml容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，置1cm吸收池内进行测定，根据下 列条件，求出按干燥品计算的己酸孕酮百分含量。A=0.390, E1%lcm=3930.390 X10X100X100% =含量%393 X 0.0105 X100令 吸收系数（Em）测定方

25、法： 精密称取被测物对照品适量（双份），加溶剂制成一定浓度的溶液使吸光度在0608之间 精密吸取适量，用同批溶剂将溶液稀释一倍在规定波长分别测定高低浓度的溶液， 计算吸收系数（E）值，要求：/ 在五种不同型号的紫外仪上测定/ 同一台仪器测定二份间结果的偏差应不超过1.0%/ 各台仪器测得的E值，RSD应不超过1.5%/ 取平均值为该药物的吸收系数（注明测定时温度）（2）对照品比拟法A样/A对=C样/C对样品二 A样/A对 X C对 X F/ W X 100%F二稀释倍数，W二取样量双波长法，差示法，荧光法，均可应用此公式，以4A,荧光强度代替吸收度A例2：盐酸吗啡片与注射液本品20片，精密称定

26、，研细，精密称取适量（约相当于盐酸吗啡10mg）置100ml量瓶中， 加水溶解至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液15mL置50ml量瓶中，加0.2mol/L氢氧 化钠25ml,用水稀释至刻度，摇匀，UV法测定。另取吗啡对照品适量，精密称定，用0.2mol/L 氢氧化钠稀释至每ml中约含20ug的溶液，同法测定。计算，结果乘以1.317,即得 C17H19NO3 HC1 3H2O 的含量.（规格 5mg）1.317=M-3H2O/M=375.85/285.34A 样 XC 对 X50 X100 X1.317 I 片重 x10（）%A对X15 X 取样X1000 X5方法的特点与影响因素：特点：简

27、便、快速、灵敏（10-410-7 g/ml）、有一定专属性和准确度（相对误差2%左 右），应用范围广（制剂含量、溶出度、含量均匀度测定），仪器价廉易普及影响因素：溶剂、溶液pH值（3）计算分光光度法双波长分光光度法（复方磺胺类药物的测定）三点校正法（维生素A的）解线性方程组法等使用时应注意，当在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定吸光度时，波长的微小变化可对 测定结果造成显著影响（4）比色法在药物分析中应用的比色法：酸性染料比色法（含氮碱性药物如：硫酸阿托品片、氢漠酸东蔗着碱片的测定）四氮嘤比色法、异烟脱比色法和Kober反响法（笛体激素类药物）蛋白质的双缩腺反响（硫酸软骨素的测定）总黄酮、总生

28、物碱的测定（中药制剂）二、荧光分光光度法(Fluorescence Spectrophotometry)荧光法测定的是物质分子的发射光谱。在一定条件下，物质的浓度与其荧光（也称发射光） 强度成正比关系，可用于定量分析1、测定方法一一对照品对照法Cx二Cx二Rx RxbRr-Rrb XCr荧光分析中，药物的浓度与相应的荧光读数之间的线性范围较窄，故（Rx Rxb）/（RrRrb） 应在0.52,如超出此范围，应调节溶液浓度后再测定2、荧光分析法的特点灵敏（检测限可达10-1010.12g/ml） 专属（入ex和入em）适于低浓度溶液分析。浓度过大，荧光会发生“自熄灭”现象，导致荧光强度与溶液浓

29、度不成正比 干扰因素多，如溶剂种类与纯度、溶液pH、温度，共存物质、溶液中的悬浮物、玻璃 仪器的洁净度等，因此必须做空白试验常用基准溶液校正仪器，如：硫酸奎宁的稀硫酸溶液（蓝色荧光）荧光素钠水溶液（黄绿色荧光）罗丹明B水溶液（红色荧光）三、原子吸收分光光度法（Atomic Absorption Spectrophotometry, A AS）1、原理由待测元素作为阴极的空心阴极灯发出的特征谱线，通过供试品经原子化产生的原子蒸气时, 被蒸气中待测元素的基态原子所吸收，测定该特征谱线辐射光强度减弱的程度，求出供试品 中待测元素的含量2、遵循一般分光光度法的吸收定律。用于呈原子状态的金属元素和局部非金属元素的测定3、含量测定方法采用标准曲线法和标准加入法（1）标准曲线法制备含待测元素的对照品溶液至少3份，浓度依次递增，并分别加入各品种项下制 备供试品溶液的相应试剂，同时以相应试剂制备空白对照液依次测定空白对照液和各浓度对照品溶液的吸光度，记录读数（3次），绘制标准 曲线制备供试品溶液，测定吸光度，取3次读数的平均值，从标准曲线上查得相应的浓 度，计算元素的含量（2）标准加入法取同体积按规定制备的供试品溶液4份，分别置4个同体积的量瓶中除1号量瓶外，其他量瓶分别精密加入不同浓度的待测元素对照品溶液，分别用去离 子水稀释至刻度制成从零开始递增的一系列溶液供试液取用量中待测元素的含量