基因治疗教程文件.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。基因治疗-基因治疗回答如下几个问题:什么叫基因治疗？Whatisgenetherapy?基因是如何传递的？Howaregenesdelivered?哪些疾病可用基因治疗？Whichdiseasescanbetreated?临床试验的最新情况？Whatisthestatusofcurrentclinicaltrails?基因治疗的前景如何？Whatarethefutureprospects?第一节概述1.基因治疗的概念一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的的治

2、疗方法。基因治疗（Genetherapy）：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。2.基因治疗的主要策略基因置换（genereplacement)或称基因矫正（genecorrection）：特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，让导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因，不涉及基因组的任何改变。基因添加或称基因增补（geneangmentation）：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。基因干预（geneinterference）：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不能表达，以达到

3、治疗疾病的目的。基因置换或基因添加的必要条件对导入的基因及其产物有详尽的了解外来基因能有效地导入靶细胞导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留导入基因能有适度水平的表达基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害导入自杀基因细胞自杀效应将自杀基因转移入宿主细胞中，该基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞“自杀”，清除肿瘤细胞。基因修饰改变细胞功能基因修饰肿瘤细胞的“疫苗”疗法基因修饰TIL的过继免疫方法免疫增强基因疗法3. 原位修饰肿瘤免疫原性的基因疗法基因标记（genelabeling）：基因标记实验是基因治疗的前奏，并不在于直接治疗疾病而是期望能够提供有关正常细胞生物学和疾

4、病病理方面的信息。基因治疗步骤基因导入（administration）：把基因或把含有基因的载体导入机体。基因传递（delivery）：基因从导入部位进入靶细胞核。基因表达（expression）：细胞中治疗性基因产物的形成。第二节基因转移技术和靶细胞1.基因治疗方式基因治疗的基本方式：体内直接转基因体内法invivo体细胞介导的基因治疗回体法exvivo基因转移的方法：生物学方法逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺病毒相关病毒载体，单纯疱疹病毒载体非生物学方法脂质体，直接注射，受体介导基因转移技术，其它方法基因治疗载体载体是治疗性遗传物质的携带者或运输工具。载体的类型：病毒载体，非病毒载体理想的基

5、因治疗载体具备的性质易于进入靶细胞。在特异细胞或组织达到有规律、充分及持续的外源基因表达。外源基因应含或整合于基因组活化区内或能自主复制的构件。整个过程应安全有效并具有选择性。易于大量生产。基因治疗载体的选择（考虑因素）靶细胞或靶组织疾病类型期望是否持续或短暂表达所要求的基因表达水平体内或回体基因治疗安全性：风险效应比。基因转移的生物学方法病毒载体类型重组型病毒载体:以完整的病毒基因组为改造对象，选择性删除病毒的某些必需基因（早期基因、控制表达的基因），缺失的功能由互补细胞反式提供；利用同源重组方法将适当长度的外源基因插入病毒基因组的非必需区,不改变病毒复制和包装所需的顺式元件。无病毒基因的病

6、毒载体：由载体质粒和辅助系统组成。载体质粒：由外源基因表达盒、病毒复制和包装所必需的顺式作用元件及质粒骨架组成；辅助系统：由病毒复制和包装所必需的反式作用元件组成逆转录病毒载体优点：高效地感染分裂的宿主细胞（100%）；在感染后，逆转录病毒能够将前病毒基因组稳定地整合到宿主基因组的随机位点上；利用重组逆转录病毒能将目的DNA传递给整个细胞群体；逆转录病毒载体可感染多种人和动物的细胞，宿主范围非常广；不产生任何有免疫原性的病毒蛋白，对宿主细胞无毒性作用，可建立细胞系长期持续表达外源基因。缺点：只能整合至分裂相的细胞；容量小（不超10kb)；病毒滴度不高；由于其随机整合，有激活癌基因的潜在危险。逆

7、转录病毒的生活周期进入宿主细胞双链RNA逆转录酶双链DNA前病毒整合到宿主细胞基因组DNA中宿主细胞RNA聚合酶IImRNA病毒RNA基因组作为合成相应病毒蛋白质的模板包装成新的病毒颗粒，离开宿主腺病毒载体优点：转染效率高、安全；宿主范围广，与细胞分裂无关；容量大，制备较易，病毒滴度较高。缺点:不能整合到染色体,表达时间短暂(1-6周);具有免疫原性;反复治疗效率降低;缺陷病毒可与宿主基因组或其它病毒发生重组,产生危险系数高的新病毒腺相关病毒优点:是非病原微生物,未发现野生型adeno-associatedvirus（AAV）与人类疾病有关;它既能感染分裂细胞,又能感染非分裂细胞;宿主范围广,

8、能感染多种宿主细胞;插入突变的危险性相当低。缺点：只能包装小于5kb的目的基因片段，相对转基因能力受限；整合时需要辅助病毒感染才能进行复制，增加包装的难度；很难大量生产单纯疱疹病毒载体优点：HSV载体能携带30-50kb的外源基因，可在多种细胞中复制；能感染分裂和非分裂细胞，对神经细胞易感。缺点：病毒不能整合入宿主细胞染色体，只能短暂表达；对感染的细胞产生毒性作用。病毒载体(病毒传递系统)病毒载体小结尽管当前的临床试验中逆转录病毒载体仍然广泛应用，但腺病毒载体的应用日益增加。腺病毒载体存在抗病毒免疫及毒性问题，其替代载体是腺相关病毒载体。HSV载体容量大并具有嗜神经性，使之适合于神经性疾病的基

9、因治疗，其转移效率高，但毒性仍成问题。存在的共同问题：基因产物过度表达，引起免疫反应；可能产生有传染性或辅助型病毒；可能随机整合于宿主基因组中，从而激活或抑制癌基因；随机插入突变；携带外源基因的容量小；宿主范围有限；外源基因导入低。今后任务：如何通过对各种不同的病毒载体系统优化获得简便、高效的包装系统、可调控表达外源基因的病毒载体、靶向性载体及无病毒基因的病毒载体。基因转移的非生物学方法基因治疗的非病毒载体非病毒方法是依赖细胞机制将DNA导入细胞进而转移至细胞核。与病毒载体相比非病毒载体的优点：对受转移的DNA大小没有限制；DNA容易进行操作，对于包装与复制需要的病毒序列没有特殊要求；比构建的

10、病毒载体安全，不可能诱发任何感染；免疫源性问题少。脂质体直接注射受体介导基因转移技术其它方法理想的非病毒DNA传递系统应具备的性质：已知结构及成分在生物液体中，传递系统的稳定性受到复合物成分的控制细胞摄取受细胞特异性浆膜受体的控制能迅速从内容泡中释放（依赖于pH值）能有效地脱包膜并经细胞质运输DNADNA的核摄取充分能达到所期望的持续表达脂质体(liposome)脂质体是由脂类形成的一种可以高效包装DNA的人造单层膜，是一种脂质双层包围水溶液的脂质微球。其结构和性质与细胞膜极为相似，二者易于融合，DNA由于细胞的内吞作用进入细胞。脂质体与细胞相互作用产生胞内DNA传递的可能模式直接注射裸DNA

11、通过物理或机械方法导入基因枪方法：注射，包埋溶液类型对基因表达有影响：重组DNA可贮存于5%30%的蔗糖溶液中也可用生理盐水或PBS其它方法磷酸钙共沉淀法电穿孔法显微注射法基因枪法基因转移的靶细胞靶细胞的选择须考虑：最好为组织特异性细胞细胞较易获得，且生命周期较长离体细胞较易受外源基因转化离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活转基因靶细胞的选择选择目的基因表达的组织细胞最好是组织特异性细胞。细胞较易获得，且生命周期较长。离体细胞较易受外源遗传物质转化。离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内仍较易成活。目前常用的靶细胞有：造血细胞皮肤成纤维细胞肝细胞血管内皮细胞淋巴细胞肌肉细胞肿

12、瘤细胞第三节反义RNA、核酶和三链DNA在基因治疗中的作用反义RNA反义RNA可作为一种调控特定基因表达的手段。合成的RNA用于体内基因治疗，必须解决的关键问题：专一性转移问题；反义RNA进入靶细胞前的降解问题。受体介导反义RNA转移技术可以满足反义RNA在基因治疗中的专一性高、抗降解作用强的要求。受体介导的反义RNA基因治疗的优点：安全性高；反义RNA设计和制备方便；具有剂量调节效应；能直接作用于一些RNA病毒。小干扰RNA（siRNA）siRNA一般不会在哺乳类细胞中诱发蛋白质合成的非特异性抑制；用人工合成的siRNA可特异地抑制哺乳类细胞中外源性或内源性基因的表达；siRNA诱发的基因抑

13、制具有高度的序列特异性。siRNA的临床应用潜力siRNA可用于肿瘤的基因治疗siRNA可用于病毒性疾病的基因治疗核酶（ribozyme）RNA组成的酶可催化RNA切割和RNA剪接反应。结构：锤头状和发夹状。具有催化RNA切割的核酶可作为基因表达和病毒复制的抑制剂，目前已被开发用于基因治疗。核酶临床应用潜力核酶作为抗病毒药物的潜力：下列病毒感染是核酶治疗潜在的靶子：HIV-1、乙型、丙型和丁型肝炎病毒、A型流感病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒和牛白血病病毒。核酶用于癌症治疗三链DNA（triple-strandDNA）当某一DNA或RNA寡核苷酸与DNA高嘌呤区结合时可形成三链。三链形成寡核苷

14、酸（triple-formingoligonucleotide，TFO）能特异地结合在DNA大沟中，并与富含嘌呤链上的碱基形成Hoogsteen氢键。TFO与靶DNA的结合具有高度序列特异性，这是三链DNA的应用基础。TFO的作用机制：基因调控区形成三链DNA后抑制基因转录专一性地干扰DNA与反式作用因子的结合，抑制转录起始或转录延伸，达到反基因的目的。技术关键：TFO（ODN）的设计与合成专一性稳定性摄取及分布三链技术可用于下列疾病病毒性感染：HIV-1、单纯疱疹和乙型肝炎。癌症基因治疗的受控表达内容：时间、空间、水平三个层面时间：控制治疗基因在患者需要实施治疗时才表达；根据不同疾病的治疗方

15、式，控制治疗基因持续表达的时间跨度。空间：严格限制治疗基因只在靶细胞中表达（专一性和安全性）水平：治疗基因在一个适当的水平表达（避免毒副作用）第四节基因治疗的应用研究基因治疗在临床上的试验和应用基因治疗方案用于人体之前必须进行三个阶段的试验，即体外研究，小鼠体内研究和灵长类动物体内研究，以保证对人体无害。一、 遗传病的基因治疗研究1990.9.14首例基因治疗4岁女孩严重免疫缺陷症(SCID)缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA)2-脱氧腺苷含量升高毒性严重破坏免疫功能ADA基因LN逆转录病毒载体靶细胞为病人淋巴细胞回输二、肿瘤的基因治疗研究修正肿瘤相关基因的功能恢复抑癌基因的功能纠正癌基因的表达导入特定

16、的基因产生肿瘤特异的药物敏感性自杀基因疗法HSV-tk肿瘤的免疫基因治疗外源基因导入肿瘤细胞细胞因子，MHC外源基因导入免疫细胞TNF肿瘤的免疫基因治疗面临的问题细胞因子作用的双重性细胞因子基因转染肿瘤细胞疫苗的有效性三、病毒性疾病的基因治疗诱导对病毒RNA的降解：抑制病毒与宿主细胞的结合：干扰病毒基因组的转录起始和调控：抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成：RNA干扰技术：基因治疗的前景与问题基因治疗中所用的各种启动子，在不同种类的体细胞中表达效率是不同的。基因治疗研究中，体外基因转移是一个重要的研究领域，人体细胞在体外进行长期培养和繁殖，细胞的生物学改变是值得研究的问题。要有效和简便地将基因治疗应用于临床，需要发展体内基因转移方法。导入外源基因对机体的不利影响也是一个不容忽视的问题。-