实验十一免疫电泳资料.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。实验十一免疫电泳-免疫电泳技术将可溶性抗原（如人血清蛋白）与相应抗体（如兔抗人血清的抗体）混合，当两者比例合适并有电解质（如氯化钠、磷酸盐等）存在时，即有抗原-抗体复合物的出现，此为沉淀反应。如以琼脂凝胶为支持介质，则在凝胶中出现可见的沉淀线、沉淀弧或沉淀峰。根据沉淀的出现与否及沉淀量的多寡，可定性、定量地检测出样品中抗原或抗体的存在和含量，免疫学的一些测定方法即基于此特性。抗原与抗体的结合在沉淀反应中，呈一定的分子比例。不同抗原和抗体之间的分子比例是不同的，但只有在分子比例合适时，才出现可见的沉淀。所

2、以沉淀能否出现并不完全反映抗原和抗体是否存在和发生结合。抗原结合多个抗体分子，称抗原为多价；抗体一般只能结合两个抗原分子（IgM类抗体分子通常可以结合5个抗原分子）的抗原决定法簇，故为二价。只有在彼此的结合价饱和时，才出现大量的抗原-抗体复合物沉淀。当抗原与抗体的比例合适时，即二者结合价彼此饱和，就可形成网状结构的大分子抗原-抗体复合物沉淀，称为等价带。若比例不合适时，抗体或抗原过量，则虽有抗原、抗体的结合，但不能大量形成网状结构的大分子复合物，沉淀量很少，甚至不出现沉淀。在抗原、抗体数量关系曲线中，抗体过剩区域称为抗体过剩带，抗原过剩区域称为抗原过剩带。如图1所示，在等价带的反应液中加入过量

3、的抗原或抗体，沉淀复合物就会有部分溶解，甚至全部溶解的现象。这是由于新加入的抗原或抗体竞争地结合相应的抗体或抗原，使网状大分子结构破坏，形成小分子复合物，致使沉淀出现溶解，沉淀量减少甚至完全消失。在沉淀反应中，由于抗原过量而不出现沉淀的现象，称为前带现象。此时不能误认为无沉淀就是无抗原存在，为了检测就必须稀释抗原。抗体过量时，称为后带现象，同理需要稀释抗体进行检测。图1的位置抗原与抗体的结合是依赖于两者分子结构的互补性，故其特异性高。这种结合也是相当稳定的。在一定条件下（过酸、过碱或浓盐存在下），二者可以分开，即结合是可逆的。解离后的抗原、抗体的活性一般保持不变。双向免疫扩散测定法原理双向扩散

4、法(doublediffusion)又称琼脂扩散法，是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反应。琼脂或琼脂糖凝胶是多孔的网状结构，大分子物质可以自由通过，这种分子的扩散作用可使分别处于两处的抗原和相应的抗体通过扩散相遇，形成抗原-抗体复合物，比例合适时出现沉淀。由于凝胶透明度高，可直接观察到复合物的沉淀线（弧）。沉淀线（弧）的特征与位置取决于抗原相对分子质量的大小，分子结构、扩散系数和浓度等因素。当抗原、抗体存在多种系统时，会出现多种沉淀线（弧）。依据沉淀线（弧）可以定性抗原，诊断疾病。此法操作简单，灵敏度高，是最为常用的免疫学测定抗原和抗血清效价的方法。操作方法（一） 制备离子琼脂板用10mL量筒，

5、量取4mL融化的巴比妥离子琼脂，倒在玻璃片上，待琼脂凝固后，按图2所示的方法打孔。图2的位置打空后用注射器针头将孔内琼脂挑出，在酒精灯上烘烤背面，使琼脂与玻璃板贴紧。（二） 稀释抗原和抗体采用2倍连续稀释法。将抗原与抗体按2的等比级数即20、21、22、23方式连续稀释。方法是取试管数支，各加入稀释液（生理盐水）一份，在于第一管中加入抗原或抗体一份，用吹吸法混匀后，吸出一份加入第二管中,如此依次稀释到最后一管。其稀释倍数依次是：2，4，8。（三） 加样将稀释好的抗原或抗体依次加入外周孔中，中心孔加入相应的抗体或抗原，加入的量以平琼脂表面为度或用微量进样器定量加入。加样后置大培养皿内（皿内放有湿

6、滤纸或湿纱布以维持湿度）。盖好皿盖，于2437温箱内保温2448小时。扩散后可出现清晰的沉淀线，以出现沉淀线的抗体稀释倍数最高的一孔为被测抗体的效价。（四） 染色及保存经染色后可提高沉淀线的可见度。1. 漂洗琼脂板：将琼脂板置生理盐水中浸泡两天，每天更换生理盐水2次以洗去未结合的抗原或抗体。生理盐水浸泡后，更换蒸馏水浸泡1天，换水2次以除去盐分。琼脂板较脆易破，操作需小心。2. 干燥：取出琼脂板，覆盖滤纸片，于室温自然干燥或吹干、烘干。3. 染色：将琼脂板置于染色剂（0.05%氨基黑10B）中浸泡，约5分钟（*注意观察染色深度），再加5%的乙酸浸泡以脱去背景颜色为度。脱色后滴加少量5%的甘油至

7、琼脂板上，置室温干燥保存。如欲取下琼脂薄膜，则需在干燥前浸泡在10%的甘油中（或在染色剂、脱色剂中加10%甘油），烘干后轻轻去下薄膜。本实验用琼脂糖效果最好，琼脂粉次之，琼脂所含杂质较多时，制出的琼脂凝胶板透明度较差，影响沉淀线的观测、且重复性差，必须做净化处理后方可使用。琼脂凝胶和玻璃片结合不紧密，样品可从样品孔下泄漏；在观察、漂洗时凝胶易于脱落。为防止上述现象，可将玻璃板进行处理，方法是用0.1%0.2%琼脂均匀涂布在玻璃板上，自然干燥后再进行双向扩散实验。在抗原、抗体单一体系中，抗原浓度不同，沉淀线特征不同。如图3所示图3的位置抗原与抗体之间相对浓度不同，出现的沉淀线特征亦不同，如图4所

8、示在抗原、抗体多种体系中，抗原与相应抗体出现的沉淀线有多条，彼此互部干扰，如图5所示图4图5试剂和器材1. 1.5%离子琼脂（1） 琼脂的净化：高度净化的琼脂，买来即可使用，如果不纯则需要净化处理。取30克优质琼脂加970mLH2O，加热至琼脂全部融化，即成3%的琼脂。用三、四层纱布热过滤，滤液流入一个搪瓷盘内，凝固后，切成1cm见方的小块，放在大容器中，将自来水同到容器底部，流水冲洗3天。冲洗时于容器上捆好一层纱布，以防琼脂块顺水冲走。然后用蒸馏水浸泡23天，每天换水23次。琼脂块净化后即浸没于蒸馏水中，加万分之一的硫柳汞防腐，置冰箱中保持待用。（2） 巴比妥离子琼脂的制备：离子强度0.06

9、，pH8.6缓冲液：称取10.3g巴比妥钠，1.84g巴比妥酸（如=0.05，则称取1.86g）溶于水稀释到1000ml。取净化的3%的琼脂块，加热融化后加入等体积的离子强度0.06，pH8.6的巴比妥缓冲液，加热混匀，即成为离子强度0.03，pH8.6，1.5%巴比妥离子琼脂。在制备离子琼脂时，可在琼脂中加入万分之一的硫柳汞防腐。琼脂中的缓冲液，其离子强度最好比电极槽中的低1/2，这样可以避免在电泳时因电流过大引起琼脂变形（凸凹不平）。2. 抗原3. 抗体4. 生理盐水（0.9%氯化钠）器材1. 7.5cm3.5cm玻璃片（或显微镜用的载玻片）2. 10ml量筒3. 4mm打孔器（可用直径相

10、当的玻璃管代替）4. 注射器针头5. 试管及试管架小滴管（带胶皮管头）微量免疫电泳原理免疫电泳法（immunoelectrophoresis）是把蛋白质电泳分离技术（琼脂电泳）和免疫学检测方法（双向扩散）结合起来的检测方法。它提高了分辨率和灵敏度，是很理想的分离和鉴定蛋白质混合物的方法。微量免疫电泳所用的样品和抗血清较少，而且测定时间短，灵敏度高，因此应用比较广泛。微量免疫电泳发不仅用于抗原、抗体定性及纯度的测定，而且在临床诊断方面也有实用价值。如缺-球蛋白患者的血清免疫电泳图谱明显缺少了-球蛋白沉淀弧；又如巨球蛋白血患者血清免疫电泳后，检出IgM类抗体显著增加。在倒有离子琼脂的饿玻璃片的中心

11、挖一长槽，槽的两侧个挖一个圆孔，孔内加入待测样品，如图6A所示。电泳时，样品中各蛋白质的等电点不同，其带电性质各异，因而被分离成几个区带（如图6B所示）。电泳后在中央槽中加入相应抗血清，置37扩散。被分离的蛋白质与相应抗体形成大小不同、深浅各异的沉淀弧（如图6C、D所示）。一般情况下，每一沉淀弧即代表蛋白质混合液中的一种成分，以此定性或半定量。图6操作方法（一） 制备离子琼脂板将前述实验的离子琼脂加热融化，取4ml倒在玻璃板上，凝固后按图7所示打孔和打槽，用注射器针头将孔内琼脂挑出。槽内琼脂在电泳分离以后在挑出，以免电泳时横槽变形影响双向扩散。图7（二）电泳于两个电泳槽中防入离子强度为0.06

12、，pH8.6的巴比妥缓冲液。将琼脂板平置于两个电极槽之间，为使电路连通，于缓冲液的液面到琼脂板之间，用单层滤纸或纱布搭桥形成通路，接通电源加10V电压，用小滴管取样品注入琼脂板孔内，假样量与孔平或稍少，调电压至100150V，通电4060分钟，当血清中色素泳动到距边缘约1.5cm时，断电，取出琼脂板，用注射器针头将横槽中的琼脂挑出，加抗血清，水平置于湿盒（或培养皿中），于37或24进行双向扩散24-48小时后，取出观察实验结果。（三） 染色参看双向免疫扩散法实验。在免疫电泳实验中的琼脂电泳分离法，可用其他蛋白电泳技术代替，如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦电泳法等。电泳后切下相应的胶带置于玻璃板

13、上，倒上离子琼脂。当凝胶与胶带紧密帖在一起并凝固后，在距胶带约0.5cm处打横槽，挑出琼脂，加抗血清进行双向扩散。由于不同电泳方法对蛋白质抗原的浓度要求不同，要根据抗原、抗体沉淀反应的合适比例稀释抗血清。沉淀弧的曲度大，说明该种蛋白质的含量较高，电泳时扩散也较为严重之故。曲度对称说明蛋白质分子均一，不对称似直线或直线上有小弧，说明蛋白质分子不均一。电泳时一般稳压在100150V范围，电流可用凝胶板两侧滤纸桥的层数加以调节，一般一层滤纸即可，电流过大致使凝胶发热，水分蒸发快，影响电泳效果。凝胶中缓冲液浓度为电极缓冲液的一半，这样可减少电流的作用，也可增加蛋白质的泳动速度。当电泳时间过长时，电极槽

14、内的电极缓冲液的pH会发生变化，此时可将缓冲液倒出，重新混匀，或改变正负极方向，让其正负离子平衡。当改变电极的正负极方向时，同时改变琼脂板的方向（旋转180），使蛋白质按原来方向泳动。要根据样品鉴定的不同要求，选择抗血清。检测蛋白质混合液（如血清或组织粗提液）中所需成分的存在及多寡，需用纯样品制备的抗血清和用混合液制备的抗血清对照检测，如图8。图8、9图10从示意图中可以看出，混合液中存在所需的蛋白质成分，可作为分离纯化该种蛋白质的材料。如果只用纯品的抗血清检测，亦可得到上述结论。但对照检测方法，结果更为鲜明易判，而且可了解杂蛋白电泳性质，为分离纯化提供依据。检测纯化样品的纯度时，应以蛋白质混

15、合液（血清或组织粗提液）制备的抗血清，而不能用纯的样品免疫动物制备的抗血清。如图9所示从示意图中可看出纯化后的样品还有两个沉淀弧，表示有2种抗原成分，须进一步纯化。为了检测样品的纯化效果、纯度和进一步考虑纯化方法，常采用在一块琼脂板上做纯化个步所得样品的系列测定。如图10所示：从示意图可以看出：A孔的粗提液含有较多的杂蛋白（7条沉淀弧）；B孔为第一次纯化样品，只有5条沉淀弧，说明该纯化方法效果较好；C孔为第二次纯化样品，仍有5条沉淀弧，说明无纯化效果，可取消该步纯化方法；D、E孔纯化效果较好，得到免疫电泳纯的样品。比较D孔的2条沉淀弧，可以看出杂蛋白与纯化样品之间带电性质差异较大，可考虑采用电

16、泳法或离子交换层析方法加以分离。在某种疾病或生长发育的某一阶段，起血清或组织提取液中增加某种蛋白质或酶，须用增加该种蛋白质或酶的血清或组织提取液制备出的抗血清进行检测（如图11所示）。反之，如减少了某种蛋白质或酶时，须用正常的血清或组织提取液制备的抗血清进行检测（如图12所示）图11、12在图11、12中，1为增加或减少的蛋白质成分。利用抗原、抗体特意结合的特性，可将血清或粗提液及到抗血清中去，即吸收实验法，可得到纯化的抗血清，再用此抗血清分离该种（增加或减少）蛋白质成分。试剂和器材试剂1. 1.5%的离子琼脂2. 抗原3. 抗血清4. 离子强度0.06，pH8.6巴比妥缓冲液（试剂14均同于

17、双向免疫扩散法实验）器材1. 同“双向免疫扩散法实验”的实验器材1，2，3，4，7部分2. 打槽刀片（将两块手术刀片用螺钉拧在一起，中间加适当硬纸片，以控制两到刀片之间的距离）3. 电泳仪：稳压电源和电泳槽滤纸对流免疫电泳原理对流免疫电泳（counterimmunoelectrophoresis）是外加电场以限制抗原、抗体的自由扩散，提高抗原、抗体的局部浓度，加快二者的移动速度，因此它是快速、灵敏的免疫学检测方法。血清抗原在碱性缓冲液中（pH8.6），带负电荷，由负极向正极用动，而血清抗体由于接近等电点，可由正极向负极渗透（电渗效应），在合适的抗原、抗体比例急一定的离子强度下，二者相遇而形成白

18、色复合物沉淀线，以此定性定量抗原或抗体。操作方法（一） 制备离子琼脂板参看双向扩散法实验。琼脂板可根据需要设计。小板上可打双排孔，大板可打多组双排孔（如图13所示）。孔的直径为4mm，相对孔的孔距为35mm。图13（二） 加样如图13所示，将抗原和抗血清分别加入相对应的两排孔中，如做抗血清效价测定，可将抗血清做2倍稀释，分别加入相应的孔内。加样量与琼脂面平。（三） 电泳琼脂板两端用滤纸做桥与电极槽中缓冲液相连接，抗原孔端接电源负极，抗体孔端接正极。打开电源，电源稳压在100150V范围，泳动20分钟到1小时。在通电过程中，可打开电泳槽盖进行观察，如发现沉淀线，可关掉电源；如不清晰，可将电泳后的

19、琼脂板在室温下或37放置数小时后观察。由于加样孔较多，故在加样时可先通电，加上一小电压（1020V），这样样品不会扩散，电泳效果好。（四） 染色参看双向免疫扩散法实验注意对流免疫电泳的正负极位置，如果电极接反，两孔之间不会出现沉淀线，而在两排孔之间出现微弱的沉淀线，结果无法判断。电渗效应是由于介质不纯即本身带有电荷所致。因此，可用经过净化处理的琼脂进行对流免疫实验，而纯净的琼脂糖效果极差。利用对流免疫电泳快速、灵敏的特点，可用于柱层析（凝胶过滤、离子交换层析）的流出液、洗脱液的检测。但需注意所分离纯化的蛋白质，其活性必须与该蛋白的抗原性吻合，且必须用纯品制备的抗血清进行检测。试剂与器材试剂抗原

20、、抗血清、巴比妥缓冲液、0.9%氯化钠、1.5%离子琼脂等均同于“双向免疫扩散法实验”。器材所用器材同于“微量棉衣电泳实验”。单向定量免疫电泳（火箭电泳）原理火箭电泳（rocketimmunoelectrophoresis）由称单向定量免疫电泳。在琼脂板的琼脂内掺入适量的抗体，在电场作用下，定量的抗原泳动时，遇到琼脂内的抗体时，形成抗原-抗体复合物沉淀出来。在抗原孔内，走在后面的抗原继续在电场作用下继续向正极移动，在向前泳动过程中，遇到琼脂内的抗原-抗体复合物，由于抗原的增加造成抗原过量而使复合物沉淀溶解，并一同向正极移动而进入新的琼脂内与未结合的抗体结合，由形成新的抗原-抗体复合物沉淀出来，

21、这样不断地沉淀溶解再沉淀，直至全部抗原与抗体结合并在琼脂糖内形成锥形的沉淀弧峰，故亦形象地称为火箭电泳。抗原含量愈高，所形成的火箭峰愈长，根据火箭峰的长度与标准抗原比较，可较精确地计算待测抗原的浓度。操作方法（一） 制备抗体琼脂块1. 取融化的1.5%的离子琼脂约10ml，置55恒温水浴中平衡。加适量抗体，搅拌混匀（搅拌时不能引起琼脂产生泡沫），此为抗体琼脂。2. 将抗体琼脂倒在6cm7cm的玻璃板上，制成抗体琼脂板。冷却后按图14所示打孔，用注射器针头将孔内的琼脂挑出。孔距底边约5mm，用滤纸条将琼脂板与电极缓冲液连接，接通电源，将电压调在1020V范围内。（二） 加样和电泳将抗原或2倍稀释

22、抗原按孔序加入琼脂孔内。增加电压至100150V，电泳35个小时，当泳动距离（火箭峰）35cm或出现的峰形不变时关闭电源。取下琼脂块，观察实验结果。图14、15（三） 染色参看双向免疫扩散法实验加样时，在琼脂板两端加一小电压（1020V）是为了避免样品扩散，样品扩散后虽可出现火箭峰，但无法定量。参看图15A所示的图形。抗体用量必须合适。抗体用量过低即出现抗原过量，不能形成完整的火箭峰，出现冲刷现象。参看图15B所示的图形；抗体用量过高即表现为抗原相对量较低，抗原泳动距离很短，有时甚至走不出琼脂孔。参看图15C所示的图形。为寻找合适的抗体用量，可在一块较大的玻璃板上分别倒上不同抗体浓度的抗体琼脂

23、，在抗原孔内分别加入不同浓度的抗原，选择合适的抗原抗体浓度后，再进行正常的火箭电泳对抗原定量测定。在本实验条件下，将抗体用融化的1.5%离子琼脂稀释510倍，便可得到较好的峰形。试剂和器材试剂抗原、抗血清、巴比妥缓冲液、1.5%离子琼脂等均同于“双向免疫扩散法实验”。器材1. 所用器材同于“微量免疫电泳法实验”恒温水浴双向定量免疫电泳原理双向定量免疫电泳由称交叉电泳（crossedelectrophoresis）,它分两个步骤进行的，首先将抗原进行电泳（琼脂电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺等电点聚焦电泳等）以分离各组分，然后放在抗体琼脂板上，使各组分在垂直方向上再泳动一次。根据各组分的沉淀

24、峰便可定性、定量抗原。操作方法（一） 第一相琼脂电泳按图16所示制备离子琼脂板，打孔加样，进行电泳（参看微量免疫电泳法实验）。（二） 电泳结束后，取出琼脂板，用一个载玻片推动琼脂板上的琼脂，将其转移到7.58cm的大玻璃板的一侧，如图17所示。（三） 配制喊适量抗体的琼脂（配制方法参看火箭电泳实验），将琼脂小心地倒在上述的大玻璃板上，倾倒时注意与第一向电泳后的琼脂紧密粘合在一起。琼脂冷凝后放入电泳槽内进行第二相电泳，正负极方向如图17所示。第二相电泳：电压稳压在100150V，时间35小时。电泳结束后，关闭电源，取下琼脂板观察结果，参见图18。图16、17（四） 染色：参看双向免疫扩散法实验在火箭电泳，双向免疫电泳进行中，可以观察到沉淀峰不断向正极方向延伸，当发现沉淀峰不再延伸，且在峰的基部出现部分沉淀消逝时，说明电泳时间过长而引起电极缓冲液酸碱度改变，过酸过碱都会引起抗原抗体复合物沉淀的溶解。此时必须重新混合电极缓冲液或调换正负极位置和电泳板方向。如调换及时，沉淀峰仍能恢复原形。图18聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺等电点聚焦电泳分离各蛋白质后，切下相应凝胶条带置于玻璃板上，加抗体琼脂制成抗体琼脂板，进行第二相免疫电泳，余下胶条可做染色对照。为寻找合适抗体浓度，可参考火箭电泳实验时的抗体浓度，一般无大差异。试剂和器材所用试剂、器材同于“火箭电泳实验”-