应用微生物学讲解学习.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。应用微生物学-应用微生物学一 生命科学学院陈敏课程内容简介本课程主要阐述应用微生物学的基础原理及产品开发，内容共分四讲：第一讲微生物的多样性及应用（主要描述目前在应用微生物中一些重要的细菌类群和重要真菌类群）。第二讲重组疫苗与合成疫苗（介绍利用生物技术生产新型的基因工程疫苗，重点概述了艾滋病疫苗的研究进展）。第三讲微生物在环境中的应用（重点描述微生物在处理废水、回收矿物以及环境修复中的重要作用）。第四讲微生物发酵工业及产品（讨论长久以来认为对人类社会福利非常重要的微生物产品，包括食品和饮料、抗生素和其他

2、微生物药物、氨基酸、有机酸、醇、维生素、核苷酸、激素、酶制剂等）。二 学习目标了解微生物在工、农、医、环境等各个领域的应用情况；重点掌握基因工程疫苗、废水处理、矿物回收以及各种发酵制品生产的微生物学原理。三 考核目标和方案根据课程内容，选择某一感兴趣的专题，撰写一篇4000字左右的综述或调查报告。四 主要参考资料1 瞿礼嘉等。现代生物技术导论。高等教育出版社，1998。2 孔繁翔等。环境生物学。高等教育出版社，2000。沈萍主编。微生物学。高等教育出版社，2000。学习二学第一讲微生物的多样性及其应用微生物主要分五大类群：细菌、真菌、病毒、藻类和原生动物。应用微生物学的主要研究对象：细菌和真菌

3、。1原核微生物1.1古细菌(Archaea)包括三种典型类群（均发现于极端环境中）：1）产甲烷细菌：仅生长在厌氧环境中。2）极端嗜盐菌：生长需要非常高的盐离子浓度。3）极端嗜热菌：生长于80100的温泉、海洋火山口。因为古细菌是由适应异常和极端条件演化而来，所以它们是一类独特的具有生物技术加工开发潜力的有机体和生物大分子资源。1.2真细菌(Bacteria)引人注目的是，对生物技术尤其重要的真细菌类群，除了栖热菌属（Thermus)外，大多数来源于11个分支中的两种：紫细菌和革蓝氏阳性菌。1.2.1紫色细菌亦称为蛋白细菌（proteobacteria），被分为四个亚门：、门（1）大肠杆菌能在成

4、分确定的简单培养基上迅速生长，且充分获得了大肠杆菌有关遗传、生化和生理方面的大量知识，大肠杆菌已成为应用重组DNA技术生产外源蛋白的合适受菌体。主要应用实例：人类胰岛素和生长激素。（2）产荧光假单胞菌类传统分类上属于假单胞菌属（Pseudomonas），种间差异极大。产荧光类主要包括铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、丁香假单胞菌。产荧光假单胞菌类群中许多种能降解诸如樟脑、甲苯和辛烷以及其他人工合成的物质，如卤代芳香化合物。因此，天然的和通过实验室改造产生的产荧光假单胞菌菌株已成为用于降解高浓度有机毒性物质污染驯化场所的侯选菌株。（3）黄单胞菌属(Xanthomonas)可产生典型的黄色

5、染料，故名。黄单胞菌可分泌脂多糖到培养基。野油菜黄单胞菌(X.campestris)分泌的多糖在食品工业及石油开采中广为采用。门硫杆菌属（Thiobacillus）化能自养型细菌，代谢产生硫酸，许多菌株在强酸（pH1.52.5）条件下生长良好。硫杆菌是工业上用于铜或铀矿提取的重要细菌。门（1）土壤杆菌属（Agrobacterium）带有Ti质粒，质粒DNA的一小部分即T-DNA能转移到植物细胞，并整合到植物染色体DNA上，引起宿主产生瘿冠瘤。这种现象对生物技术具有极大的潜在意义，利用Ti质粒将外源基因转入谷物中，用于人工生产储藏蛋白；或用Ti质粒转入固氮基因、抗病或除草剂的基因到植物中。（2）

6、根瘤菌属（Rhizobium）生长于土壤中，与豆科植物共生形成根瘤，并在根瘤中固氮。根瘤菌是生物固氮的主要成员，估计每年约合成3000万吨氮素肥料，大部分供植物生长需要。（3）发酵单胞菌属（Zymomonas）发酵糖类（ED途径）产生唯一的终产物：乙醇。工业上用于大规模发酵生产酒精。（4）葡萄糖杆菌属（Gluconobacter）化能异养菌，氧化乙醇为乙酸，不能进一步氧化乙酸。在制醋业中非常有用。也可以将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，而葡萄糖酸是一种具重要商业价值的产品。1.2.2革蓝氏阳性菌（1）梭菌属（Clostridium）严格厌氧，发酵能产生有用的终产物：乙醇、丁醇、丙酮，第一次世界大战的爆发

7、导致梭菌发酵走向实际应用。1916年，丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum)的发酵成为产生丙酮的主要途径，从100吨糖浆中能生产出12吨丙酮。（2）乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)通常称为乳酸细菌。能发酵葡萄糖产乳酸，耐酸性好。其中一些菌株常用于生产奶酪和发酵乳制品，全世界年产量2000万吨，产值达500亿美元。（3）芽孢杆菌属(Bacillus)与梭菌不同，能在有氧时生长，是土壤的优势菌。许多芽孢杆菌能产生胞外水解酶，降解蛋白、核酸、多糖和脂类。

8、其中有些酶已大批量生产用于商业：蛋白酶可用于洗涤剂；多糖水解酶可用于降解淀粉。有些芽孢杆菌是昆虫致病菌，其中苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)已被大规模开发用作杀虫剂。一些芽孢杆菌合成的抗生素在生产上已具有一定商业规模，如来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的杆菌肽和来自多粘芽孢杆菌(B.polymysa)的多粘菌素。（4）纤维单胞菌属(Cellulomonoas)此属最显著特点为能降解纤维素。利用纤维单胞菌产生的纤维素降解酶可将富含纤维素的植物原料转变成酒精和蛋白质。（5）棒状杆菌属(Corynebacterium)本属中的一个种，即谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)

9、是著名的味精生产菌，它能将原料中的大部分物质转换为谷氨酸，且将其分泌到培养基中。（6）链霉菌属(Streptomyces)链霉菌以分支菌丝生长，孢子繁殖，与真菌特征相似，却为原核生物。灰色链霉菌(S.griseus)能产生高效抗菌物质链霉素。在其他链霉菌中还相继发现了多种抗生素，包括四环素、红霉素、新霉素和庆大霉素等。（7）栖热菌属（Thermus）此类微生物首次发现于温泉中，为真细菌中目前所知的最嗜热细菌，最适生长温度7072。水生栖热菌（Thermusaquaticus）是热稳定DNA聚合酶（Taq聚合酶）的主要来源，此酶在PCR扩增基因时很有价值。Taq聚合酶基因已在大肠杆菌中得到克隆和

10、表达，可以大规模生产。2真菌估计真菌的总数约为10万25万，可分成五个亚门。（1）鞭毛菌亚门（Mastigomycotina）产生具鞭毛的无性孢子，以单细胞个体或具无横隔的菌丝存在。典型代表为致病疫霉(Phytophorainfestans)，可引起马铃薯晚疫病。另一代表Rhizophlyctisrosea为土壤中常见纤维素分解菌。（2）接合菌亚门（Zygomycotina）能产生不游动的无性孢子（接合孢子）；菌丝无隔膜。重要代表菌为土壤中的腐生菌，如毛霉(Mucor)、根霉(Rhizopus)。黑根霉(R.nigrocans)长期以来用于柠檬酸的生产。（3）子囊菌亚门（Ascomycotin

11、a）真菌中最大的一个亚门，大约有1.5万种。营养体除酵母菌为单细胞外，大多数具发达的菌丝体，菌丝体有横隔。产生有性孢子（子囊孢子）。其中的脉孢菌属(Neurospora)和酵母菌属(Saccharomyces)为遗传学家特别熟悉。酵母菌是迄今为止应用最广的真菌。酿酒酵母(S.cerevisiae)广泛用于啤酒和葡萄酒的发酵生产，也用于面包制作等方面。（4）担子菌亚门（Basidiomycotina）营养体为单细胞或有隔菌丝，产生有性孢子（担孢子）。著名的食用菌（mushroom）大多属于担子菌，能在有机复合肥上进行商品化生产。（5）半知菌亚门(Deuteromycotina)由于只了解其生活周

12、期的一半，故名。营养体结构为单细胞或有隔菌丝，以分生孢子进行无性繁殖。此亚门中的某些属具可观的经济价值，如青霉属(Penicillium)和曲霉属(Aspergillus)。黑曲霉(A.niger)用于生产柠檬酸和葡萄糖酸。米曲霉(A.oryzae)在食品工业中通过发酵大米和黄豆来生产淀粉水解酶和蛋白水解酶。点青霉(P.notatum)是用于生产青霉素的第一个菌株；灰黄青霉(P.griseo-fuluvum)为灰黄霉素的生产菌，主要用于治疗被真菌感染的皮肤或指甲疾病。第二讲重组疫苗与合成疫苗疫苗是目前医学上最有潜力的防御物质。在发展中国家，传染病死亡率占总死亡人数的30%50%，疫苗成为对付传

13、染病的重要工具。在发达国家，传染病死亡率占总死亡人数的4%8%，但这并不意味着疫苗在这些国家不重要，传染病的低发率正是得益于疫苗的广泛使用。除众所周知的天花疫苗成功消灭了天花疾病以外，其他疫苗的使用也大大降低了许多重要传染病的发生率，如大众免疫计划的实施，使美国的白喉发病率降低了1000多倍，脊髓灰质炎发病率下降了4000多倍。疫苗广泛应用的第二个原因是效益，现在抗生素和化学治疗药物非常昂贵，免疫接种较患病后再去治疗要经济得多。21传统疫苗存在的问题传统疫苗包括活疫苗和灭活疫苗两种。许多传统疫苗都非常有效，但开发新疫苗和疫苗生产新技术仍然十分必要，因为传统疫苗还存在一些问题：1）活疫苗存在毒力

14、返强的危险；2）灭活疫苗往往引起机体严重的反应；3）许多重要传染病还缺乏疫苗。22生物技术对疫苗发展的影响生物技术发展使生产全新的疫苗成为可能。所谓新型疫苗是由已经证实是安全的生物来生产。如用大肠杆菌或酵母菌生产病原微生物的某种组分或保护性抗原。利用这一技术，即使很难培养或不能培养的病原体也可以生产出相应的疫苗。新型疫苗有的是用来预防新的疾病，有的只是较传统疫苗更有效，生产的副作用更小。在过去的几十年中，疫苗的研究工作主要是针对体液免疫。20世纪90年代开始，人们开始注意到细胞免疫对癌症、艾滋病等疾病治疗的重要性。因此，新一代疫苗的设计思想：1）尽可能同时调动细胞免疫和体液免疫两个系统；2）删

15、除致病基因，保留病原物质引起免疫反应的能力。23基因工程疫苗是指用基因工程的方法表达出病原物的一段基因序列，将表达产物（多数无毒性、无感染能力、但具有较强的免疫原性）用作疫苗。231.亚基疫苗（subunitvaccine）利用病原物的某一部分制得的疫苗。优点：1）避免了直接使用病原物可能致病的危险；2）利用纯化蛋白质作为免疫源，避免了外源蛋白、核酸混杂而造成的种种副作用，使疫苗更安全；3）有时单独使用特异蛋白能增强疫苗的效果。局限性：1）表达可能很低；2）蛋白质构象折叠可能不正确；3）免疫力弱且持续时间短。232肽疫苗(peptidevaccine)将只与抗原决定簇相对应的小肽连接在大分子载

16、体蛋白上，制成的疫苗称为肽疫苗。优点：1）最突出的是可以用化学合成的方法合成肽，省去了以重组DNA为基础的亚单位疫苗产品的纯化步骤；2）肽疫苗只用抗原蛋白的一部分，不会产生该蛋白其他部分引起的不必要的免疫反应。实例：口蹄疫疫苗传统的口蹄疫疫苗是一种灭活病毒疫苗：1）需冷冻状态保存；2）具有危险性；3）生产花费巨。24DNA免疫DNA免疫又称基因免疫（geneticimmunity）或核酸免疫。1993年，Wolff等人意外地发现，将DNA直接注射小鼠骨骼肌细胞后可引起特异性的免疫反应，并可持续2个月以上。DNA免疫的优越性：1）DNA比蛋白质更稳定，保存的时间较长；2）DNA的提取和纯化比蛋白

17、质容易得多；3）任何DNA片段都可以插入质粒中制成疫苗；4）对目前难以用常规疫苗防治的疾病的预防和治疗有重要意义。但DNA疫苗普遍存在免疫效率较低的问题。25艾滋病（AIDS）疫苗251AIDS的定义获得性免疫缺陷综合症（AIDS）：即HIV检测阳性的个体。1） 全血的CD4T细胞数小于200个/mm3（正常值6001000个/mm3），或CD4T细胞占整个淋巴细胞数不到14%；2） CD4T细胞数等于或大于200个/mm3，但伴有最常见的与AIDS相关的机会性感染，包括：细菌病：肺结核和其它分枝杆菌属感染，或复发性沙门氏菌败血症。真菌病：假丝酵母病、球孢子菌病、隐球酵母病、肺囊虫属肺炎等。病

18、毒性疾病：巨细胞病毒感染、与HIV相关的脑病、单纯疱疹病毒引起的慢性溃疡和支气管炎等。恶性肿瘤：Kaposi肉瘤、温袭性子宫颈癌、脑原始淋巴瘤等。252人类免疫缺陷病毒（HIV）253HIV病毒的致病机理及患者的感染进程HIV病毒一旦进入细胞，就可在细胞内大量繁殖，从而导致感染细胞的破裂，这称为直接杀伤。最易受到HIV病毒侵染的细胞是辅助T细胞，即CD4T淋巴细胞，它是免疫系统的支柱细胞之一，因而HIV病毒感染后的主要症状是免疫能力低下，CD4T淋巴细胞数量急剧降低。254HIV的生活史及治疗药物1）逆转录酶抑制剂抑制逆转录酶，从而阻止基因整合。包括应用最广的第一代抗HIV药物AZT（叠氮胸苷

19、）。2）HIV蛋白水解酶抑制剂阻断HIV蛋白质活性，防止其进行剪切产生新的HIV蛋白质。有可能成为第二代有效的HIV化疗药物。3）混合疗法解决耐药性问题，采用多种药物联合作用的办法。（1996，美国何大一博士首创鸡尾酒疗法（cocktailtherapy），被评为当年“时代周刊”风云人物）混合疗法是目前化学治疗的首选方法。255AIDS疫苗HIV基因的多样性阻碍了AIDS疫苗的研究进展。目前，AIDS疫苗的研制包括1）亚基疫苗：将编码多种HIV外膜蛋白的基因，用基因工程的方法合成病毒疫苗。亚基疫苗的临床实验目前仍在进行。2）灭活的完整HIV作为疫苗：只限于感染HIV的患者使用。3）活的减毒疫苗

20、：被HIV-1（一种相关病毒，只引起温和的AIDS）感染的个体可以保护不被HIV-2（引起严重AIDS）感染。4）其他：HIVgp160疫苗、CD4受体疫苗等。26结束语到目前为止，还没有获得有效的AIDS疫苗。而且，AIDS疫苗在治疗患者时，并不十分有用，因为他们的免疫系统已衰弱，不能对疫苗产生反应！尽管我们对HIV分子水平的了解和对AIDS的临床研究已取得了相当的进展，但对抗AIDS的主要手段，目前仍是以加强社会教育和避免危险的行为为主。要想获得AIDS的最新信息，可登录AIDS网址：http:/www.cdc.nac.org第三讲微生物在环境中的应用3.1微生物在生态系统中的地位和作用3

21、.1.1微生物是有机物的主要分解者微生物最大的价值也在于其分解功能。它们分解生物圈内存在的动物和植物残体等复杂有机物质，并最后将其转化成最简单的无机物，再供初级生产者使用。3.1.2微生物是物质循环中的重要成员微生物参与所有的物质循环，大部分元素及其化合物都受到微生物的作用。在一些物质的循环中，微生物是主要的成员，起主要作用；而一些过程只有微生物才能进行，起独特作用；而有的是循环中的关键过程，起关键作用。3.1.3微生物是生态系统中的初级生产者光能营养和化能营养微生物是生态系统的初级生产者，它们具有初级生产者所具有的二个明显特征，即可直接利用太阳能、无机物的化学能作为能量来源，另一方面其积累下

22、来的能量又可以在食物链、食物网中流动。3.1.4微生物是物质和能量的贮存者微生物和动物、植物一样也是由物质组成和由能量维持的生命有机体。在土壤、水体中有大量的微生物生物量，贮存着大量的物质和能量。3.1.5微生物在地球生物演化中的作用微生物是最早出现的生物体，并进化成后来的动、植物。藻类的产氧作用，改变大气圈中的化学组成，为后来动、植物出现打下基础。3.2污水的微生物处理3.2.1污水的工厂处理过程污水处理一般是一个多步的过程，其中包括物理和生物的处理步骤。一级处理：仅是物理分离。进入污水处理厂的污水经一系列的筛子，去除大块物体，然后这些水静止数小时，使其中悬浮的固体颗粒沉淀下来。二级处理：目

23、的使污水中有机物含量减少到可排放至自然水域的程度，与微生物过程紧密联系。三级处理：是一个物理化学过程。利用沉淀、过滤和加氯消毒法很快地降低最后污水中的无机营养物水平，特别是磷酸盐和硝酸盐。3.2.2微生物处理的主要方法3.2.2.1好氧生物处理活性污泥法(activatedsludgeprocess)是利用悬浮生长的微生物絮体（活性污泥）处理有机废水的一类好氧生物处理方法。最早于1914年由英国人Ardern和Lockett创建，在废水处理技术中取得了巨大的成功，成为目前最成熟且仍在继续发展的废水生物处理技术之一。生物膜法（biofilm）是利用微生物在固体表面的附着生长对废水进行生物处理的技

24、术。主要用于固定床生物处理技术和流化床生物处理技术中，如生物滤池、生物转盘等工艺。这一类方法的共同特征是通过废水与生物膜的相对运动，使废水与生物膜接触，进行固液两相的物质交换，并在膜内进行有机物的生物氧化与降解，使废水得到净化。生物滤池：又称洒滴池，主要包括以下几部分:1） 滤床：一般采用碎石、卵石或炉渣铺成滤床，生物膜便长在滤料上；2）配水与布水装置：其作用是使污水均匀洒向滤床；3）排水装置：在滤层底部汇集经滤床处理的水，通过二沉池排出。3.2.2.2厌氧生物处理当废水中有机物浓度较高时，就不宜采用好氧处理，而应该采用厌氧处理方法。厌氧生物处理是在厌氧条件下，形成了厌氧微生物生长所需的营养条

25、件和环境条件，利用这类微生物分解废水中的有机物，并产生甲烷和二氧化碳的过程，又称厌氧发酵。与好氧生物处理过程的根本区别在于不以分子态氧为受氢体，而以化合态盐等为受氢体。3.2.3生态工程与污水处理系统生态工程（ecologicalengineering）：一般是指应用生态系统中物种共生与物质循环再生的原理，结合系统工程的最优化方法设计的分层多级利用物质的生产工艺系统。生物氧化塘（oxidationpond）：又称稳定塘，是利用藻类和细菌两类生物间功能上的协同作用处理污水的一种生态系统。3.3微生物沥滤由嗜酸细菌产生的酸和金属溶解作用在采矿中起着有益的作用。如果矿石中的金属浓度很低，用传统的开采

26、方法是很不经济的。这种情况下通常采用微生物沥滤法，该法特别适合于铜矿。细菌沥滤的原理：（1） 溶矿：通过浸矿剂的作用，产生大量的CuSO4。（2） 置换：一般采用Fe置换“海绵铜“，待进一步加工。（3） 再生浸矿剂(3.4环境污染的微生物修复生物修复（bioremediation）：利用生物将土壤、地表及地下水或海洋中的危险性污染物现场去除或降解的工程技术系统。生物修复与生物处理是一致的，两者的区别在于生物修复几乎专指已被污染的土壤、地下水和海洋中有毒有害污染物的原位生物处理，旨在这些地方恢复“清洁”，而生物处理一般具有更广泛的涵义。可用作生物修复的微生物类型：1）土著微生物；2）外来微生物；

27、3）基因工程菌。3.4.1土壤生物修复的原位处理方式这种方法是在受污染地区直接采用生物修复技术，不需要将土壤挖出和运输。其基本方法是在修复区钻井，一组是注水井，用来将接种的微生物、水、营养物和电子受体等物质注入土壤中；另一组是抽水井，通过抽取地下水，造成地下水在地层中流动，促进微生物的分布及营养物质的运输。例：生物通风系统有机污染物会降低土壤中的氧气浓度，增加二氧化碳浓度，进而抑制污染物进一步生物降解的条件。因此，生物通风系统向土壤中补充氧气来提高土壤中的污染物降解效果。第四讲微生物工业和产品工业化规模培养微生物生产商业性产品，称为微生物工业。微生物工业中菌种的选择和培育是生产之本；代谢调控是

28、生产的关键；规模生产的设备和产物的各项处理是生产的重要组成；所涉及的学科除微生物学、生物化学、分子生物学、化工外，还涉及机械、工程、计算机、经营管理等。4.1工业发酵的菌种要求和发酵特征4.1.1生产菌种的要求1）菌种能在较短时间的发酵过程中高产有价值的发酵产品；2）菌种的发酵培养应加工低廉，来源充足，被转化产品的效率高；3）菌种对人、动物、植物和环境不应造成危害；4）菌种发酵后，所产生不需要的代谢产物少，产品相对容易地与不需要的物质分离；5）菌种的遗传物质特性稳定，而且易于进行基因操作。4.1.2工业发酵的特征一般认为是规模大，即所用的设备庞大,占用场地大，人力、物力投入的规模大；消耗的原料

29、、能源多；菌种符合生产菌种的要求，其生长代谢特性与大规模生产发酵相适应；需进行成本核算等。4.2好氧发酵罐的结构和工艺监控发酵罐是一个大的圆柱体，顶部和底部密封，内部安装了各种管子和阀门。发酵罐一个重要部分是通气系统，一种通气装置称为喷雾器，另一种搅拌的装置称为叶轮。发酵罐的仔细监控非常重要。大多数情况下，不仅要检测菌体生长和产物合成的情况，而且随着过程的进行，要改变环境参数来控制发酵过程，通常检测的环境因素包括温度、氧浓度、PH、细胞量和产物浓度。计算机在发酵罐工艺控制中起重要作用。4.3发酵的逐级放大一般通俗地将逐级放大称为小试（小型试验）、中试（中型试验）、大试（大规模工业性试验）三个阶

30、段。各阶段不是设备的简单放大，每个阶段都有预期的目标和要求。4.3.1小试：一般指采用实验室的小型设备，包括三角瓶、150L发酵罐。目标：初步评估出所发酵的产物是否具有效益和生产的可能性。4.3.2中试：指采用试验工厂或车间的小规模设备，如1005000L发酵罐。中试的目标：基本确定发酵产物能否进行工业性大规模生产，初步确定生产该产品的必要性和可能性。4.3.3大试：也称为试验性生产，是指用工业性大规模设备，包括大型发酵罐。大试的目标：确定发酵产物能否进行工业性大规模生产，生产该产品的必要性和可能性。4.4工业发酵的方式通常按发酵中某一方面的情况，人为地分类为如下几种方式：1）按对氧需要或不需要：好氧发酵和厌氧发酵2）按培养基是液态还是固态：液态发酵和固态发酵3）按发酵是在培养基的表面或深层进行：表面发酵和深层发酵4）按发酵是间歇性或连续进行：分批发酵和连续发酵5）按菌种是否被固定在载体上：游离发酵和固定化发酵6）按菌种是单一还是混合的菌种：单一纯种发酵和混合发酵现代发酵工业大多数是好氧、液体、深层、分批、游离、单一纯种发酵方式结合进行。4.5发酵的主要产品4.5.1食品和饮料4.5.2抗生素和其他微生物药物及生物制品4.5.3氨基酸、有机酸、醇、维生素、核苷酸、激素4.5.4酶制剂4.5.5微生物农药、肥料和饲料-