应用分子生物学技术对环境中军团菌的调查研究说课讲解.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。应用分子生物学技术对环境中军团菌的调查研究-应用分子生物学技术对环境中军团菌的调查研究沈莉谢晓红韩华忠陶力新袁建华王仁刚上海市奉贤区疾病预防控制中心201400摘要目的：应用分子生物学技术对奉贤地区部分公共场所空调冷却塔水及其它环境（淋浴设施等）进行军团菌污染状况调查。方法：在五月和十月，分别采集中央空调冷却塔水样品及环境样品用聚合酶链（PCR）对其进行军团菌检测，同时用常规法进行分型鉴定。结果：采集的125份样品中，PCR法检出军团菌45份，阳性检出率为36%，且水样检出率远高于环境。在检出的59株军

2、团菌中共鉴定出6种不同菌型，其中LP1为重点菌型，占50.85%。且在同一样品中检出不同菌型有2株以上的占35.29%。结论：奉贤地区中央空调冷却塔及环境中存在军团菌污染，需引起重视，以防止军团菌的爆发流行。关键词：军团菌冷却塔PCRApplicationofmolecularbiologytechnologyontheenvironmentintheinvestigationofLegionellaShenli,XieXiaohong,HanHuazhong,etal.FengxiandistrictCenterforDiseasePreventionandControl,shanghai2

3、01400,china.AbstractObjective：MakingasurveybytechniquesofAppliedMolecularBiology,whichisabouttheconditionofLegionellacontaminationinair-conditioningcoolingtowerwaterandotherenvironments(showerfacilities,etc)insomepublicplacesinFengxianDistrict.Methods：InMayandOctober,inspectingthesamplesofcentralair

4、-conditioningcoolingtowerwaterandotherenvironmentsrespectivelyonLegionellabypolymerasechain(PCR),whilemakingaclassificationidentificationbyroutinetechniques.Results：Amongthe125samplescollected,Legionellawasfoundin45samplesbyPRC,relevanceratioofmasculinegenderwas36%,whichwashigherinwaterthaninotheren

5、vironments.Therewere6differentbacteriatypesidentifiedinthedetectionof59piecesofLegionella.LP1wastheimportantbacteriatypeamongthe6,accountingfor50.85%.Thefactthatmorethan2typesinonesampleaccountsfor35.29%.Conclusions：Legionellacontaminationexistsinair-conditioningcoolingtowerwaterandotherenvironments

6、inFengxianDistrict,whichshouldbepaidattentiontoinordertopreventtheoutbreakofLegionella.KeywordLegionella;Coolingtower;PCR军团菌是一种革兰氏阴性杆菌，能引起急性呼吸道传染病1，因在1976年美国费城召开的退伍军人大会时爆发流行而得名。自70年代被发现以来，全世界已有广泛报道，全球每年都有数起军团菌爆发流行，WHO也已正式把它列入疾病传报范围。迄今为止，军团菌已被发现存在40个种，60多个血清型。经流行病学调查研究，这种细菌存在于各种自然界水源以及空调水管道，供水系统等人工水源

7、中，在引进空调冷却塔做冷却水时，随空调器把细菌散布于室内空气中，被人吸入而引发肺炎。我国自1982年南京首次证实军团菌病例以来已有多起军团菌爆发流行2，上海在近几年内也从病人和环境中分离到军团菌3。而上海地区健康人血清抗体水平调查也证明军团菌早已存在我们周围并对人群构成潜在威胁4。近年来从军团菌的流行可以看出军团菌对人类健康的威胁已达到不容忽视的程度。随着人们生活水平的提高，其发病率有上升趋势，因此对该病的研究也越来越受到人们的重视。目前用于军团菌检测的常规培养费时约7-10天，不仅花费大量时间和精力，还具有敏感性，特异性差的缺点，且操作复杂，易造成漏检和误检。分子生物学技术的发展为军团菌检测

8、提供了新的契机。利用聚合酶链（PCR）技术能够更加快速和有效的对军团菌进行检测。本课题应用聚合酶链（PCR）技术，检测流行环境中的军团菌，了解分析奉贤地区军团菌的污染状况。1 材料与方法1.1材料1.1.1实验菌株大肠埃希菌（ATCC25922）,肠炎沙门菌（ATCC13076）,宋内氏志贺菌（ATCC25931）,副溶血性弧菌（ATCC17802）均购为美国典型微生物菌种中心保藏中心提供标准菌株。1.1.2样品来源2010年5月-10月以单纯随机抽样方式选取奉贤地区具有集中式中央空调设备的各大型超市，酒店共10家。以无菌方式采集空调冷却塔水于无菌广口瓶中，每件450ml，共采集64件。以沾湿

9、生理盐水的棉签反复涂抹空调出风口以及酒店浴室莲蓬头出水口表面，剪去棉签接触手部位，将棉签置5ml生理盐水中，共采集61件，采样后即送实验室检验。1.1.3培养基GVPC平板由柯玛嘉公司提供，血琼脂平板，各反应试剂由上海市疾病预防控制中心提供，均在有效期内使用。1.1.4诊断血清军团菌诊断血清由上海市疾病预防控制中心提供,均在有效期内使用。1.1.5PCR扩增仪TechneFlexigene；全自动数码凝胶成像系统TanonGIS-20101.1.6PCR试剂盒嗜肺军团菌（LP）PCR检测试剂由上海健益生物科技有限公司提供。1.2方法1.2.1细菌的增菌分离培养鉴定样品经负压过滤后,剪碎放入蒸馏

10、水中,混合振荡后吸取1毫升进行酸处理,静置5分钟后同时接种GVPC平板和血平板.36，5%CO2培养72小时后进行鉴定5。1.2.2PCR检测方法取增菌液500ul,12000rpm/min离心5min,弃上清液，加100ulDNA提取液入沉淀中，振荡混匀，置100水浴加热10min,12000rpm/min离心5min，保留上清液待用。取4ul上清液加入26ulPCR反应液中,同时做阳性对照。振荡混匀，将PCR反应管放入PCR扩增仪中。首先预变性945min，然后按9430s、5530s、7260s循环35次，最后72延长5min。取15ul的扩增产物加入2%琼脂糖凝胶孔中进行电泳，然后用凝

11、胶成像系统进行分析。1.1.3PCR特异性试验以嗜肺军团菌DNA作为阳性对照，以其它标准菌株DNA作为干扰菌进行PCR特异性检测。1.1.4测序验证将PCR结果阳性的样品扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序验证。2结果2.1PCR检测结果2.1.1PCR反应和测序验证一共采集125份样品进行嗜肺军团菌的检测，有45份样品检出阳性。经上海生工生物工程有限公司测序验证,送检的阳性样品扩增产物确认为嗜肺军团菌。M:100bpDNA标准带；1:嗜肺军团菌阳性对照;2:阴性对照;3-15:部分样品扩增条带2.1.2PCR特异性引物只与嗜肺军团菌发生阳性扩增，扩增长度为430bp，其它干扰菌没有扩

12、增产物，具有很好特异性。结果见图2。M:100bpDNA标准带；1:嗜肺军团菌;2:空白对照(不加模板);3:肠炎沙门菌;4:宋内氏志贺菌;5:大肠埃希菌;6:副溶血性弧菌2.2样品检测情况用PCR检测的125份样品中，水样64份，环境样品61份，水样的阳性检出率远远高于环境中的阳性检出率。经统计学分析，水样与环境样品检出率的比较（X2=55.37，P0.05），有显著性差异。详见表1表1:PCR法检测125份军团菌样品情况样品种类检测件数阳性数（份）阳性检出率（%）水样644367.19环境6123.28合计12545362.3两种方法检测结果比较64份水样样品中PCR法检测出阳性菌43份，

13、阳性检出率67.19%。常规法检出阳性数32份，阳性检出率为50%，略低于PCR法。经统计学分析，两种方法检出率比较（X2=3.90，P0.05），有显著性差异。而在环境样品中，由于阳性检出率很低，无明显差别。详见表2、表3表2:水样样品中两种方法检出情况检测方法检测件数阳性数（株）阳性检出率（%）PCR法644367.19常规法643250合计1287558.59表3:环境样品中两种方法检出情况检测方法检测件数阳性数（株）阳性检出率（%）PCR法6123.28常规法6123.28合计12246.562.4军团菌的菌型分布情况在125份样品中检出了59株军团菌。其菌型分布为LP1型占50.85

14、%，LP4型占23.73%，LP5型占10.17%，LP6型占8.47%，LP7型占3.39%，LP8型占3.39%。而同一份样品中检出3株菌型的有4份，占阳性样品的11.76%，同份样品检出2株菌型的有8份，占23.53%。详见表4、表5表4：125份样品59株军团菌的菌型分布情况样品种类菌株检出数嗜肺军团菌菌型LP1LP4LP5LP6LP7LP8水样5730146322环境22合计5930146522表5：同份样品检出多重菌株情况同份样品检出菌株数样品数（份）所占百分比（%）3株411.762株823.531株2264.71合计341003讨论3.1这次对奉贤地区大型中央空调和部分环境的军

15、团菌污染调查中发现，中央空调冷却塔水中的阳性率达67.19%，远高于环境中的阳性率3.28%，证明空调冷却水军团菌污染相当严重。冷却塔作为中央空调系统的一部分，其产生的循环水不仅为军团菌提供了理想的生存环境6，而且提供了传播的形式气溶胶。冷却塔水被污染后，通过空调机入口和通风管被抽入室内或在冷却塔一定范围形成气溶胶，人引吸入而被感染。空调系统冷却塔污染是导致军团菌感染的主要原因之一7，由于军团菌是一类水生菌群，生存环境界限广泛，水中存活时间较长，因此水质的跟踪检测及水的消毒十分重要。3.2在此次的调查中，检出了6种不同菌型，显示了军团菌血清型呈多样化发展的趋势。而其中又以LP1为重点菌型，占检

16、出菌的50.85%。这与之前国内报道的军团菌分布情况一致8。而且在同一样品中检出了不同菌型，2株以上的占35.29,%，证明了在空调冷却塔水中存在着严重的多重污染，再次证明奉贤地区军团菌污染状况岌岌可危。由军团菌污染环境可能导致严重后果应该引起我们足够的重视。3.3在军团菌的研究中从流行环境中检出的菌株以空调系统冷却塔水较多，而此次我们在酒店的浴室莲蓬头中检出了2株军团菌，这属少见，也充分说明军团菌就存在我们日常生活中。提醒市民对自己家里的淋浴器等设备也要进行定期检测，消毒，清除水垢，污物。军团菌爆发流行的可能性正日益临近。居民小区的集中供水，加湿器，热水器，空调器的日益普及无时不刻提醒我们卫

17、生管理部门急需重视这个文明病。3.4由于军团菌的培养分离方法繁琐，人工培养条件的苛刻及其生长代谢的缓慢导致标本检出率低下，从而造成事实上的假阴性，漏检。检测技术相对滞后，对于军团菌的预防与治疗十分不利。PCR方法检测军团菌完全是从细菌的基因水平入手，针对5SrRNA设计的属特异性引物，从而比以往所有传统的外显蛋白质表型检测更为可靠。而运用聚合酶链反应技术（PCR）的高敏感性，强特异性和快速等特点，可以克服常规检验技术的缺陷,显著简化了操作，有利于军团菌防治工作的开展。而此次运用两种方法对军团菌的调查分析中也可以看到，PCR方法的阳性检出率要高于常规法的检出率。3.5军团菌病约90%是由嗜肺军团

18、菌所致，某些军团菌含有的巨噬细胞感染增强基因（mip）看调控24-27KD外膜蛋白形成，这种蛋白可以使正常身强体壮的人患病。这使得过去认为军团菌为条件致病菌的理论受到看极大冲击，也使得这种可通过气溶胶传播的呼吸道传染病变得日益恐怖。军团菌造成的空气污染和水源污染正是发展中城市的一个公共卫生问题。因此，加强军团菌监测，建立快速的检测技术，努力做好防范工作是我国卫生管理部门亟待重视和解决的问题之一。目前，尚无军团菌相关疫苗，无人-认传播的有效证据。所以加强对军团菌重要传染源-水系统的卫生管理，是预防军团菌发生和流行的关键。参考文献：1朱水荣,叶菊连,孟真,等.浙江省首次从空调冷却塔水中分离到军团菌

19、J.中华流行病学杂志,2004,25(9)：8232武建国主编.军团菌病.南京:东南大学出版社,1990:1253陈悦等.上海首次从军团菌病例中检出军团菌.上海预防医学杂志,1997,9(7):3264陈悦.上海地区军团菌感染和环境污染状况的调查,上海预防医学杂志,2000,12(7):3055卫生部.WS195-2001军团菌诊断标准及处理原则，20026冯文如,等.广州地区水体环境军团菌污染分布调查J.中国热带医学,2005,5(1):147-148.7胡大林,等.空调冷却水军团菌污染调查J.医学信息,2008,21(1):92-938梁景涛,等.佛山市部分公共场所空调冷却循环水军团菌污染状况分析J.中国卫生检验杂志2009,19(8):1828-1829.-