盐酸右美托咪定预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响_刘晓君.docx

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1、 授予单位代码 10089 学号或申请号 20102507 硕士学位论文 科学学位 盐酸右美托咪定预处理对大鼠肝脏缺血再灌注 损伤的影响 研究生 ： 刘 晓 君 导 师：邢 玉 英 教 授 专 业：麻醉学 二级学院：第四医院 2013年 3月 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师（或指导小组的指导下，由本人独立完成。 本学位论文研宄所获得的研宄成果，其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表 与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试 验材料、原始我据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 否则

2、，承担相应的法律责任。 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研宄工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注等内容外，文中不包含其他人己发表或撰写的研宄 成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 目 录 巾対輕 1 英文摘要 4 研究论文盐酸右美托咪定预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影 响 8 108 材料与方法 9 關 13 酬 15 酿 19 職 21 组仑 26 献 26 综述盐酸右美托咪定的理化性质及临床研究进展 30 至嫌 46 个人简历 47 盐酸右美托咪定预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响 摘 要 背景：肝癌切除术、肝移植术、

3、创伤失血性休克等常不可避免地发 生肝脏缺血再灌注损伤，严重者可导致肝功能衰竭、移植器官无功能和多 器官功能障碍综合征。大量研究旨在探讨肝脏缺血再灌注损伤的机制，其 中炎性反应起着至关重要的作用，而最新的研究机制表明，免疫系统的固 有免疫应答也导致了肝损伤。伤害性因素下，中性粒细胞和单核细胞被激 活和增殖， 111)61细胞产生炎性因子，诱导活性氧产生，诱发细胞凋亡 或坏死。免疫炎症反应攻击和杀伤受应激的细胞，而加重组织损伤。 右美托咪定为高效、高选择性的 0肾上腺素受体激动剂 ，具有镇静、 镇痛和抗交感、抗焦虑、无呼吸抑制、血流动力学更加平稳等作用。近年 来，已经广泛用于临床多个领域，其器官保

4、护和对免疫炎症反应的影响成 为新的研究方向。右美托咪定可通过中枢和外周机制，抑制创伤产生的脂 质过氧化反应及应激反应，减轻伤害性剌激引起的免疫炎症反应中促炎性 细胞因子的生成，减弱脏器缺血再灌注中细胞凋亡和死亡，对心、脑、肺 肾有保护作用。研究发现，右美托咪定减轻脓毒血症时肝组织的损伤，而 其对围术期肝脏缺血再灌注损伤的影响尚无论断。本文通过建立大鼠肝脏 缺血再灌注模型，观察血清八 丁、八 81 109、丁见 、 111卩和肝脏组织 细胞凋亡的变化，来研究右美托咪定预处理对肝脏缺血再灌注损伤的影 目的：探讨右美托咪定预处理对大鼠肝细胞缺血再灌注损伤的影响， 为右美托咪定的临床应用提供新的理论及

5、实验依据。 方法：雄性健康界丨 8加 大鼠 27只，随机分成 3组，假手术组 组肝脏缺血再灌注组 1/11组右美托咪定预处理组 0组，每组 9只。 术前禁食 1211，不禁水。腹腔注射 17。戊巴比妥钠（如 !/!)麻醉， 颈动脉置管。术前 30111丨 1100组腹腔注射右美托咪定 100118右美托咪 定浓度 10118/1X10； 811&111组和 1/ 尺 组 腹 腔 注 射 等 容 量 的 实 施 手 术： 811&111组：只游离肝门，不阻断肝叶供血； 1/11组与 0组：阻断肝左叶及中叶的门静脉和肝动脉分支，使 707。 肝脏缺血， 30111丨 11后，恢复肝左叶和中叶灌注。

6、 三组分别于缺血前 （丁 IX再灌注 30111丨 11 (!)，再灌注 120111丨 IX丁 3 时颈动脉取血 11111，离心提取血清，全自动生化分析仪测定血清八 1丁、 八 8丁、 109 含量，双抗体夹心酶联免疫法 &12丫 11161 丨 111(1 111111111110801136111： 八33吵， 2乙 18八 )测定血清丁勝技、 11.1-13含量。肉眼观察再灌注 120111111 时肝脏组织充血情况，再灌注 120111丨 11后，处死大鼠，取缺血再灌注部位 肝脏组织，流式细胞分析技术 （匕界 0丫 10111的 7， 检测细胞凋亡情 结果： 1三组大鼠体重、月龄、

7、手术时间、出血量及补液量差异无统 计学意义 仍）。 2肉眼观察肝脏形态学变化 丁 3时， 8匕 111组肝脏组织表面光滑，颜色红润，大小正常； 1/11组再 灌注后肝脏组织明显充血，颜色深红，肿大； 0组再灌注后肝脏红肿， 组织充血，程度较 1/11组轻。 3组间比较 丁 1： 各组 血清八 匕丁、 八 8丁、 109、丁犯 和 I匕 -10无显著差异 V 0.05)0 丁 2：于 81*111组比较， 1/尺组血清八匕丁、八 8丁、 109、丁犯 和 I匕 -10 升高 (尸， 0既 组血清 脱丁、八 8丁、丁勝 “ 和 11.-113升高 (尸 0.05)5 0炫组血清 109与811&1

8、11组 相 比 ， 差 异 无 统 计 学 意 义 （ 尸 于 1/ 尺 组 比较， 0炫 组血清 脱丁、八 8丁、 109、丁见 !和 I匕 -10降低（尸 0.05。 丁 3： 于 811&111组比较， 1/尺 组血 清八匕丁、八 8丁、 109、 丁犯 、 11.-113 和细胞 凋 亡 指 数 升 高 ， 0炫组血清 脱丁、八 81 丁凡卜 、 11.-113 和细胞凋亡指数升高（尸 ()， 0炫组血清 109与 811&111组相比，差 异无统计学意义（尸0.05；于 1/尺 组比较， 0炫组血 清脱丁 、八 8丁、匕 09、 丁勝 “ 、 111卩 和细胞凋亡指数降低 (尸 ()

9、。 4 组内比较 811&111组：丁 1、丁 2和丁 3，血清八匕丁、八 8丁、匕 09、丁凡卜。和 I匕 -113 差异无统计学意义（ ()。 1/尺组：于丁 1比较，丁 2和丁 3两时间点，血清八 1丁、八 8丁、 丁乂只 -辽 和 I 11.-113升高（尸 丁 2和 I 丁 3比较，血 I青 八乙丁、八 8丁、乙 09、 和 几 -113差异无统计学意义（ /()。 0炫组： 于丁 1比较， 丁 2和丁 3两时间点，血清八 1丁、 八 8丁、丁见 和 几 -113升高（ / ()，血清 109差异无统计学意义 （ (); 72 和丁 3比较，血清人 丁、八 81 109、丁见 和 扎

10、 -113差异无统计学意义 (尸 (仍）。 结论：右美托咪定预处理降低大鼠肝细胞缺血再灌注血清中八 1丁、 八 8丁、 109的含量，降低了炎性细胞因子丁凡卜 、 几 -印 的释放，降低 了缺血再灌注损伤导致的肝细胞凋亡。 关键词： 再灌注损伤；右美托咪啶；细胞凋亡； ！ ？七； 11.-113 26018 0 1)6X1116(16101111(11116 011 061)3110 18011611113 1161)611181011 111 111 111 1318 厶 8811 8301*01111(1：乙 1801161111& 16|361&81011 111)1117 13 & 1

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27、八乙丁，八 8丁，乙 09， 丁乂只 -辽 ， 11,-113 &11(1 161 0611 &1)01)1:0818 111 1/11 识 011|3 81111110&1111 111016&1116 6|316881011 0【八乙丁 ， 八 8丁，丁 ” 只 -辽 ,111(3 &11(1 161 0611 &1)01)1:0818 111 0炫识 011|3 81111110&1111 1 1 1 0 1 6 & 0051116 6|316881011 乙 09 13616611 06乂 011|3 &11(1 811&111 011|3 1101 81&1： 181： 10&11

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29、881011 0【八乙丁，八 8丁，乙 09，丁 只 -辽 &11(1 111(3 111 丁 2 &11(1 丁 381111110&1111 111016&86(1 &8 001111)6(1 10 丁 尸 （ (); 001111)6(1 13616611 丁 2 &11(1 丁 3， 1116 出任红從 1101 81&11811011 81111110& 111 06乂 011|3： 001111)6(1 10 丁 1,1116 6|316881011 0丨八乙丁 ， 八 8丁，丁 &11(1 11-1(3 111 丁2 &11(1 丁 3 81111110&1111 1 1 1 0

30、 1 6 & 0 05111 丁 2 &11(1 丁 3,1116 6X1)1-6881011 0丨乙 09 001111)6(1 界 1仕 1 丁 1 界狀 1101 81111110&1111 001111)6(1 13616611 丁 2 &11(1 丁 3， 1116 1101 81&1:181:10&11 81 职迅 0110111810118:1)6X1116(161:01111(11116 1)160011(111:10111112 0&11 &06 1116 6X1)1-6881011 0丨八：丁，八 8丁 11(1 ： 0只 111 1116 1&1： 1 红 1/11， &

31、06 1116 1616&86 0丨 1116 11111&111111&11011 0101116 丁乂只 -辽 &11(1 I乙 -113， 16(11106 1116 11&|3&100611111&! &1)01)1:0818 01186(1 1 沈 1/11. 16|361&81011 111)1117； &1)01)1:0818； 丁乂只 -辽 ; 11.-113 盐酸右美托咪定预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响 則 曰 盐酸右美托咪定是高选择性 0肾上腺素受体激动药，有镇静、催眠、 抗焦虑、镇痛和交感神经阻滞作用 。 1999年，美国药品与食品管理局 八 )批准将其应用于成人重

32、症监护病房忙 ； )短时间 24的的镇静与 镇痛近年来，做为麻醉的辅助用药应用日益广泛。 研究表明，在围术期右美托咪定具有稳定血流动力学、抑制应激反 应、减少麻醉剂及阿片类药物的用量和抗寒颤等作用。近年来，研究发现 右美托咪定具有器官保护作用。它通过减少兴奋性神经递质的释放，在不 同的脑缺氧或缺血实验模型中发挥其神经保护作用 ；还可以减少心血管 手术围术期的死亡率和心肌梗死发生率减少失血性休克时急性肺损伤 的产生，减少呼吸机损伤导致的炎性反应 乂减少肾脏 1/6后肾损伤，维 持损伤时肾髓 质血流，减轻肾小管细胞的水肿，提高肾脏对损伤的耐受性 对心、脑、肺、肾有保护作用。 肝脏损伤是临床围术期的

33、主要问题之一，也是导致急性肝功能衰 竭的主要原因。大鼠 1/尺模型已经在科研实验中得到广泛应用，为了解 缺血再灌注中的影响因素和机制提供了重要价值。肝脏缺血再灌注后，促 炎细胞分泌的炎性细胞因子和炎症介质上调，最终导致肝损伤。在肝脏 1/尺中起着极其重要的作用 。 右美托咪定可通过中枢和外周机制，抑制创伤产生的脂质过氧化反应 及应激反应，减轻伤害性剌激引起的免疫炎症反应中细胞因子的生成 1 减少促炎症因子的生成 ，参与免疫调节 ，减弱脏器缺血再灌注中细 胞凋亡和坏死。右美托咪定预处理是否通过上述机制对围术期肝脏缺血再 灌注损伤具有保护作用呢？本文通过建立大鼠肝脏缺血再灌注模型，观察 血清八匕丁

34、、八 8丁、 109、丁凡卜、 I匕 -113和肝脏组织细胞凋亡的变化，来 研究右美托咪定预处理对肝脏缺血再灌注损伤的影响，为其临床应用提供 理论依据。 材料与方法 1主要实验仪器及试剂 1.1主要仪器 全自动生化分析仪 1)11丨 VI 0x0800 美国 8 111犯 1 00111161公司 台式离心机 1&130&與 400 德国 11狀 118公司 酉每标仪 811612 11(116(01111)117111111:6(1 电子台秤 18-100 华鹰衡器有限公司 低温冰箱日本三洋 流 氏 细 胞 仪 均 型 美国 80公司生产 36。 0恒温振荡培养箱 92(X100 哈尔滨东联

35、电子技术开发有 限公司 I. 2主要试剂 盐酸右美托咪定注射液（批号 10110434江苏恒瑞医药股份有限公司 低分子肝素钠（批号 206008251 山东齐鲁制药有限公司 II. -113酶联免疫试剂盒 深圳欣博盛生物科技有限公司 酶联免疫试剂盒 深圳欣博盛生物科技有限公司 2研究对象 清洁级雄性界丨 3也 1大鼠，体重 1808 220 8，由河北医科大学实验动物 中心提供。饲养室每 1211昼夜交替，室温 221 。 0，湿度彡 40。义，避免噪 音，勤换垫料，避免坏尾症的发生。所有大鼠供给实验室标准饮食，供给 充足的食物和水，所有实验程序遵守实验室操作规范 000(1 1油 0如 01

36、7 |31&01： 1065 01.？ 3实验方法 3.1 实验分组 雄性健康界丨 3加 大鼠 27只，随机分成三组，每组 9只：假实验组 811&111 组；肝脏缺血再灌注组 1/11组；右美托咪定预处理组 0既组 3.2术前准备 3.2.1药物准备 盐酸右美托咪定注射液 200118/21111， 稀 释 为 201111，浓度为 1011/1111； 低分子肝素钠 500011/1111， 09070&01稀释为 5001111，浓度为 10 11如 1。 3.2.2麻醉 术前禁食 1211，不禁水。腹腔注射 17。戊巴比妥钠（如 !/!)麻醉。 四肢固定于手术台上，备皮，组织剪减去颈前

37、正中和腹中线区毛发。 3.2.3颈动脉置管 颈前正中，碘酒消毒， 757。酒精脱碘两遍； (之）颈前正中切口，分离皮下组织，气管旁找到左侧颈总动脉，玻 璃子游离颈总动脉 1.50111左右，动脉下备两根缝线； 在左侧颈总动脉的近心端夹一动脉夹阻断血流，并在动脉远心 端距动脉夹化 111处结扎； “ ）用组织剪在结扎线的近心侧剪一以 45度角斜向近心端的小口， 向心脏方向插入提前肝素化的动脉导管，用备好的缝线结扎固定，松开动 脉夹，动脉导管内可见动脉搏动。 3.3术前给药 术前 30111丨 11， 0既组腹腔注射右美托咪定 10011的 (右美托咪定浓度 1011/1111 811&111组和

38、 1/尺组腹腔注射等容量的 3.4手术模型制备 3.4.1各组手术处理 811&111组：只行假手术，分离中叶及左叶至横隔及腹壁的韧带，暴露 门静脉周围组织（门静脉，肝动脉，胆管，不阻断肝叶供血； 1/尺组和 0组：开腹，分离中叶及左叶至横隔及腹壁的韧带，无损 伤血管夹将供应肝左叶及肝中叶的门静脉和肝动脉分支阻断，使 707。肝 脏缺血，30111丨 11后，撤掉血管夹，恢复肝左叶和中叶灌注。 丁 士刚扣 !） 丁 116 6X1)61-11116111： 110 011&11 111166 011|38 3.4.2肝脏缺血再灌注模型 术前腹部正中碘酒消毒， 757。酒精脱碘两遍，防止手术区感

39、染 影响实验结果。腹部正中切口，大约 3 0111，始于腹正中，止于胸骨剑突。 止血钳系于切口两侧及胸骨剑突，纱布止血，暴露腹内容物。 (之 ） 弄 湿 两 块 纱 布 ， 其 一 放 于 切 口 右 侧 （ 大 鼠 右 侧 X 两支湿棉签，小心轻置于肠管表面，使其出腹腔，放于预湿的纱布上，以 暴露门静脉及其相关组织，另一块湿纱布覆盖肠管，以防变干。剪刀小心 分离中叶及左叶至横隔及腹壁的韧带，更好的暴露门静脉周围组织（门静 脉，肝动脉，胆管 用无损伤血管夹将供应肝左叶及肝中叶的门静脉和肝动脉分支 阻断，使 707。肝脏缺血，以防发生严重肠系膜静脉淤血。小心把肠管重 放入腹腔，同时注射器直接腹腔

40、注射 10 11/1111的低分子肝素盐水 500 111， 然后湿纱布覆盖切口，把动物置于热灯下。 “ ）维持体温 37。 0，密切监测缺血期，确保纱布保持湿润，在此期 间，可能需要腹腔注射少量麻药来维持麻醉。 接下 来，是实验需要的缺血周期 30111丨 11，然后小心去除血管夹， 腹腔注射 500。无菌盐水，补充手术期间的任何液体流失。 ()关闭腹腔， 4.0丝线缝合肌肉层和皮肤。 妥善处理术后大鼠。 3.4.3视觉检验再灌注的成功的判定 去除血管夹几秒后，缺血的部位由苍白开始呈现恢复至正常组织的赤 褐色。 3.5 检测指标提取和测定 3.5.1检测指标提取 1三组分别于缺血前 71 X

41、再灌注 30111丨丁 2 X再灌注 120111丨 “ 丁 3， 颈动脉取血 11111，室温静置 111后， 41300011)111离心 10111丨 11，提取血清， 分装 3份， -701冰箱保存。 1份全自动生化分析仪测定血清人 1、八 8丁、 109含量；另 2份，酶联免疫法测定血清！ ？七、 11-13含量。 (之）丁 3时间点肉眼观察肝脏大体形态学改变，采到血样后，空气 栓塞处死大鼠，开腹，取肝左叶及中叶，切成黄豆粒大小样数块， 707。 酒精固定于青霉素小瓶， -701冰箱保存。流式细胞检测技术测定肝组织 细胞凋亡指数。 3.5.2 实验方法测定检测指标 3.5.2.1 全

42、自动生化分析仪检测血清中八 1丁、人 8丁 、 109的含量。 3.5.22 酶联免疫法 51121116111 止 6(1 111111111110801136111：人 88吵 ， 5118八）测定血 清丁勝 “ 、 I乙部含量 从冰箱取出试剂盒及标本，平衡至室温； (二）制备洗涤液、标准品、生物素化抗体工作液、酶结合物工作液 (避光室温 221-251放置； 从已平衡至室温的密封袋中取出实验所需板条，空白孔加标准 品汝标本通用稀释液，其余相应孔中加入标本或不同浓度标准品 100111/ 孔 X封板胶纸封住反应孔， 36。 0孵箱孵育 90111111； (斗）洗板 5次； 0空白孔加生物

43、素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作 液（ (丨 /孔，新封板胶纸封住反应孔， 36。 0孵箱孵育 60111111； (石）洗板 5次； 空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液 100111/ 孔 X新封板胶纸封住反应孔， 36。 0孵箱，避光孵育 30111111； ()打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序； ( 洗板 5次； (川）加入显色底物（丁 100111/孔，避光 36。 0孵箱，避光孵育 15111111； )加入终止液 100111/孔，混匀后即刻测量 00450值 0111丨 II内， 在仪器保存并读取试验结果； (口）汇制标准曲线，以标准品浓度为横坐标

44、， 00值作纵坐标，以 平滑线连接各标准品的坐标值，通过 898813.0软件，计算两数值关系方 程式，计算出标本的 00值 代 表 的 血 清 几 -113含量。 3.5.23流式细胞分析技术（匕界 0丫 101116117，检测肝细胞凋亡 将 100目铜网扎在小烧杯上，标本组织用生理盐水冲洗一遍。 (之）将剪碎的组织放在铜网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边 用生理盐水冲洗，直到将组织搓完。 300目尼龙网过滤细胞，去团块。 收集细胞悬液，离心 1000卬 0,5111，弃上清液，保留 1.51111 沉淀液。 0上样，流式细胞仪测定细胞凋亡指数。 4统计学处理方法 统计学处理：应用 89

45、8813.0统计软件进行统计分析。计量资料以均 数土标准差（过）表示，组间比较，方差齐，采用单因素方差分析；方 差不齐，采用界此 0X011秩和检验。 0.05为差异有统计学意义。 结 果 1三组大鼠体重、月龄、手术时间、出血量及补液量差异无统计学意 义（尸奶）。 2再灌注 120111丨 11后， 8匕 111组肝脏组织表面光滑，颜色红润，大小 正常；1/11组再灌注后肝脏组织明显充血，颜色深红，肿大； 0组再灌 注后肝脏红肿，组织充血，程度较 1/11组轻。 3 缺血前，三组 血清八 1丁、 人 8丁、 109、丁见 !和扎 -印差异无统计 学意义 (&仍 )； 再灌注 30111丨 11

46、时，于 811&111组比较， 1/尺组血清八 1丁、八 8丁、 109、 丁勝 “ 和 11.-113均增高， 0炫组血清八乙丁、八 8丁、丁勝 “ 和 11.-113均升高， (/()， 组血清匕 09于 811&111组比，差异无统计学意义 (尸 0.05； 于 1/尺组比较， 0炫组血清八 1丁、八 8丁、 109、丁凡化！和扎 -113均降低 (尸 0.05。 再灌注 120111丨 11时，于 811&111组比较， 1/尺组血清八 丁、八 8丁、 109、 丁凡卜 、 111卩和细胞凋亡指数均升高， 0炫组血清八 丁、八 81 1？七、 11.-113和细胞凋亡指数均升高，（ /()， 0炫组血清 109于 81犯 111组 比较，差异无统计学意义 仍 ） 于 1/尺组比较， 0炫组八 1丁、八 8 丁、 乙 09、丁见 、 I匕 -113和细胞凋亡指数均降低（ /(仍），见 7&1)161 7&1)16 3。 4 811&111组：缺血前，再灌注 30111丨 11，再灌注