猪病毒性腹泻的诊断和检测技术.docx

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1、猪病毒性腹泻的诊断和检测技术(猪病)毒性腹泻类疾病是猪场常见疾病，目前已成为危害养 猪业最大的一类疾病之一。腹泻普通有显然的时节性，尤其在秋冬、 冬春换季，天气骤变时易发且流行速度快。主要利用消化道及呼吸道 举行感染，随后诱发全群猪腹泻。几种病原混合感染比较常见，各年 龄段的猪均可发病，发病后的死亡率与年龄密切相关，日龄越小，病 程越短，死亡率越高，其对我国的养殖业造成了巨大的经济损失，严 峻影响经济效益。本文介绍该类疾病的可能病因、鉴别诊断办法和分 子生物学检测(技术)。(猪病)毒性腹泻的病原目前主要有猪流行性腹泻病毒(PEDV)、 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV

2、)、猪轮状病毒 (RV)、猪博卡病毒(PBoV)等，均可导致猪发病，以呕吐、腹泻、脱水 为主要特点，仔猪的发病率和死亡率可高达50%-100%o其它猪的 伪狂犬病毒(Pseudorabies, PRV)、圆环病毒、大肠杆菌和温柔型猪瘟 病毒(classical swine fever, CSFV)也能够引起仔猪腹泻，这需要我们逐 一细致地分析病因，利用流行病学、临床诊断和试验室检测举行综合 诊断。1病毒性腹泻的临床诊断从临床诊断上看,PEDV、TGEV、PDCov、RV、PBoV的症状比较相像，难以区别。但是PRV和CSFV与其它几种病毒性腹泻存在一 定的区分。1.1 PEDV、TGEV、PD

3、Cov这3种疾病的病原都属于冠状病毒科，病毒特性、病猪发病特 征、临床症状和病理变化十分相像：1至3日龄发病，一周内病死或 淘汰率可达到100%o乳猪和小猪严峻腹泻、水样拉稀，部分猪有呕 吐，吃奶后发病更严峻。部分中大猪和母猪呕吐和腹泻，但死亡率不 高。病变普通只集中在胃肠道，胃肠黏膜菲薄、充血，肠系膜淋巴结 充血。PDCov启发的病例不多，但是在国外和国内都有单纯由该病毒 引起的腹泻大暴发的病例报道。1.2 猪伪狂犬病感染伪狂犬病毒的发病猪会整窝发病和死亡，表现为骤然发病, 体温升高达41团以上，精神极度委顿，颤抖，运动不协调，痉挛，呕 吐，腹泻。表现出显然的神经症状、昏睡、呜叫、呕吐、腹泻

4、，一旦 发病，12 d内死亡。剖检主要症状是肾脏布满针尖样出血点，其他 肉眼病变不显然。中枢神经系统症状显然时，脑膜显然充血，脑脊髓 液量过多，肝、脾等实质脏器常可见灰白色坏死病灶，肺充血、水肿 和坏死点。1.3 温柔型猪瘟感染温柔型猪瘟病毒的仔猪会先后浮现以下症状：体温上升达 41团，仔猪常伴有厌食、腹泻，眼结膜潮红发炎，皮肤发炎，共济失 调，甚至后躯麻痹，粪便由褐色变黄色，后期肛门失禁，粪便沿着后 腿淌下，恶臭异样。病猪快速消瘦,腹下部及耳根皮肤呈紫红色淤血。 病猪体温保持在40团左右，症状时轻时重，食欲时好时坏，粪便时干 时稀。病程长者皮肤浮现淤血斑和坏死块，以腹下部为常见。有时也 浮现

5、紫耳朵、干尾巴、紫斑蹄。病猪的皮肤一旦破损或扎针后，局部 淌血不止，血液凝固不良，也是该病的特点之一。温柔型猪瘟的病理变化主要特点性病变是胃黏膜大面积脱落、 充血，肾脏不肿大，呈土黄色，可见大小不等的出血点，以针尖大小 居多，脾脏肿大，色暗，表面散在有米粒大小的紫红色突起，质地较 软，边缘有坏死灶，个别呈点状出血，淋巴结肿胀、水肿或出血、重 者浮现化脓、坏死、溃疡等病变，血液淡薄如水，流在地面上很少凝 固，其他脏器病理变化不大。部分猪浮现咽峡、软腭处和扁桃腺有白色坏死点、出血或溃疡，大肠回盲瓣可见钮扣状溃疡。胆肿大，其边 缘出血，呈暗红色。2病毒性腹泻的生物学检测（技术）猪被PEDV、TGEV

6、、PDCoV、PoRV、PBoV感染后，都会浮现呕 吐和水样腹泻，致使发病猪脱水、生长不良、体重减轻，死淘率高达 90%以上。剖检病变主要在小肠，能够发觉肠壁变薄并且呈半透亮 状，弹性不足，黏膜充血，肠管内含大量液体，肠系膜淋巴结有水肿、 充血等病变。胃内弥漫着白黄色的固体乳状物，胃黏膜充血。排出的 稀粪中会含有没有彻低消化的白黄色凝乳块，具有腥臭气味。临床上很难鉴别这几种病毒病，所以鉴定需要举行试验室相关 的分子生物学（技术）举行鉴别诊断，通常有以下几种检测办法：2.1 RT-PCRPCR （技术）以其迅速、敏感、易于操作等优点在近年来被广 泛应用。按照Genbank中选定病毒的一个基因保守

7、区域基因序列设 计引物，合成特异引物，然后从感染病毒的粪便或肠道组织中提取总 RNA,以此总RNA为模板，用下游特异引物将RNA反转录为cDNA, 然后在2个特异引物存在的状况下用Taq DNA聚合酶举行扩增，合 成特异的双链DNA目的片段。对扩增的DNA片段用琼脂糖凝胶电泳 举行检测，然后举行测序分析，从而对患病动物举行确诊。PCR能同 时检测大批量的样品，并且能举行活体检测，适合于临诊诊断。2.2 实时荧光定量PCR办法实时荧光定量PCR办法是在PCR （技术）基础上进展起来的一 种高度敏捷的核酸定量（技术），融汇了传统（技术）敏捷、迅速、 特异的特征及光谱（技术）高敏感性和高精确定量的优

8、点，具有特异 性强、敏捷度高、重复性好、定量精确 、速度快、全封闭反应 等优点。按照病毒设计特异性引物和Taqman探针，实行含病毒多的 发病猪的器官组织部位，建立Taqman实时定量RT-PCR检测病毒的办 法。不仅适合病毒的临床样品的早期检测，也适用于疫苗生产过程中 的质量控制及疫苗制品的效价评估。2.3 酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验（ELISA）诊断办法具有敏感性和特异性强、操 作容易、检测迅速、高通量、无辐射、价格低廉等特征，是当前动物 传染病检疫、流行病学调查等广泛采纳的免疫学诊断（技术），可用 于规模化猪场大批样品的抗体检测。抗原：应用推举的毒株的病毒或 相应蛋白制备。用于制备

9、抗原的细胞应没有任何其他腹泻病毒感染。抗血清：用于竞争或阻断实验的多克隆抗血清可利用实验推举的毒株 来制备，单克隆抗体则可采纳相应的病毒免疫显性蛋白直接法制备。 间接法采纳的抗猪免疫球蛋白试剂应能检测到猪IgG和IgMo按照 ELISA的基本原理，进展出了间接ELISA、Dot- ELISA、微波迅速ELISA、 竞争ELISA以及抗原捕捉ELISA。2.4 免疫荧光法实行病猪的肠道或其他组织，做成冷冻切片，举行直接免疫荧 光法检测抗原。这个办法是活体诊断，能够快速做出推断。或者通过 已研制的抗病毒蛋白的单克隆抗体，采纳间接免疫荧光实验对接种病 毒的细胞培养物举行了病原检测，并与全病毒制备的抗

10、血清举行比较, 以评价抗病毒蛋白单克隆抗体迅速检测的潜在应用价值。2.5 免疫电镜法这几种腹泻冠状病毒，外形十分相像，在一般电镜下无法区分， 为此需用免疫电镜法(IEM)。同时免疫电镜在举行临床样品或细胞培 养样品中病毒的血清学鉴定上显示出了更大的优势。通过A蛋白和抗 病毒的特异性血清包被电镜网格而制作的固相免疫电镜检查法，能提 升检测的敏捷度，其效力至少提升100倍。此办法不单可用于发病时 的诊断，也能够用于发病的埋伏期诊断。2.6 环介导等温核酸扩增（技术）环介导等温核酸扩增（技术“LAMP）是一种新型的核酸扩增（技 术），依靠4条特异设计的引物和一条具有链置换特性的DNA聚合酶， 在等温

11、条件保温几非常钟，即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热 变性、长时光温度循环、繁琐的电泳、紫外观看等过程。近年来该法 被广泛应用于病原体的检测。LAMP检测试剂盒不需要先进的仪器， 并且具有特异性强、敏感度高、检测周期短、操作简便以及易于推广 等优点。不过LAMP也有缺点，就是由于敏捷度高，一旦开盖简单形 成气溶胶污染，加上目前国内大多数试验室不能严格分区，因此需要 避开假阳性的问题。3总结虽然当前浮现腹泻症状的疾病种类相对较多，但在全国范围内, 以流行性腹泻（PED）为主的病毒性腹泻危害最为严峻，且自2022年以 来疫情持续不断。各种病毒性腹泻病的临床症状和解剖病变非常相像, 给临床迅速诊断带来不少困难。为了准时对症防控和（治疗），削减 经济损失，需要准时正确实行病料送至试验室做相关的试验室确诊。 同时，在平时的猪场管理中，注重生物平安防控，控制产房的温度和 湿度，做好产房的全进全出措施，并注意消毒空栏，切断一切可能的 传染源，才干更好地控制该病。免疫防控时一定要选用高质量的腹泻 疫苗，最好选用高抗原含量的变异株PED+TGE疫苗。