：宏基因组学测序技术在中重症感染中的 临床应用专家共识第一版（全文）.docx

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1、最新：宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识第一版（全文）基于宏基因组学测序（mNGS ）的病原学诊断技术是一种非靶向的广谱病原学筛查技术，近几年越来越多的研究表明其在重症感染领域，特别是疑 难、罕见病导致的重症感染中发挥了关键性作用。由于mNGS高昂的成 本及较高的实验条件要求，目前尚未纳入常规临床检验中。可以预见，随 着测序成本的下降及我国医疗水平的不断提高，基于mNGS的病原学诊 断技术在临床大规模开展的条件已经逐步成熟。随着基因组学技术的发展，高通量测序技术又称下一代测序技术（NGS ）越来越广泛地应用于感染性疾病的溯源、检测、分型和耐药评估等各个方面，并且朝着快捷、经济的

2、方向飞速发展。近年来采用宏 基因组及宏转录组发现了两个临床感染病例的新发病原体，例如沙粒病毒 和新型布尼亚病毒，开启了宏基因组学测序（mNGS ）技术在临床感染中 应用的先例。由于mNGS不依赖于特定基因引物的序列扩增，而是将待 测样本的所有DNA或RNA混合测序,并通过将测序数据与病原体数据 库进行比对，获得病原体的分类信息，因此能在较短的时间内完成对样本 的无靶向检测，单次即可检测上千种病原体，检测的病原体种类包含病毒、 细菌、真菌和寄生虫等。现阶段而言，受限于高昂成本，mNGS主要集中应用于重大疾病、突发公共卫生事件和特定病例人群，目前尚未纳入常规临床检测。检测与质控检测设施设备控制：必

3、须按照医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办 法的相关规定开展临床mNGSo检测实验室应符合医疗机构临床基因 扩增检验实验室工作导则的相关规定。实验室空气洁净度需要建立标准 对照和监测系统，实验室存在的背景微生物需要进行定期的汇总更新。测 序设备需要采用获得国家医疗器械注册许可的测序平台。检测实验质控：mNGS过程主要包括样本处理（包含运输）、核酸提取、 文库构建、上机测序及数据比对与判读。对于这些影响检验结果的关键过 程，需要有相应的质控点，包括运输过程保持低温状态、核酸提取质量、 文库出库浓度和片段分布大小、下机总数据量、有效数据量、测序质量及 数据分析可靠性等，任何不符合质控标准的检测都应

4、及时终止并重新检测, 或者在无法重新检测的情况下，可提供预警，以供临床参考。全流程的质 控标准应包含但不限于如下几点：每批次实验中都应该包括内参和（或） 阳性、阴性对照品。内参和（或）阳性对照品被有效检出且检测到的 碱基序列片段数量应满足实验预期的检测敏感度阈值。对于不同类型 的样本，建议有基本的序列数据量。因为mNGS的科学原理是对临床样 本中的所有核酸进行高通量测序，除了测试到样本中包含的病原体序列信 息外，一定也包含了人基因组或转录组的序列。由于临床样本中微生物的 核酸含量远低于人核酸含量，通常不足人核酸含量的5%。因此，为了得 到临床可信的检测结果，理论上需要将所有核酸都测试一遍，这就

5、对测序 的数据量提出了基本的要求。由于不同类型的临床样本中人宿主核酸的含 量是不同的，因此对不同类型样本的测试数据量的要求也不同。在主要代 表类型样本中，单位体积的人核酸含量排序为脑脊液 支气管肺泡灌洗液 血浆 痰液 胸腹水，本共识推荐的高通量测序序列数依次为2 000万 条（20 million , 20 M 1 4 000 万条（40 million , 40 M 1 5 000 万 条（50 million , 50 M 1 8 000 万条（80 million , 80 M 1 1 亿条（1 条 million , 100 MX对于痰液和胸腹水样本,不仅是数据量需要增加，还 需要进行

6、适当的人核酸去除来确保检测的敏感度。为确保序列比对的 准确性，避免因同源错配导致的序列比对错误，建议测序序列读长不少于 50 bp （单端读长50个碱基推荐采用临床应用级别的数据库，对临床 病原体的不同种、不同型别有满足需求的区分度。生物信息分析流程应该 有统一标准，自动化为主，人工纠错为辅。建议mNGS结果报告应涵盖 该批次实验中的内参、阴性和阳性对照品结果，并记录相关质控标准，如 测序质量、单个样本数据量、序列读长、检出的病原体序列数及相对丰度 等。测序结果的实验室判读控制：目前不同厂家测试产品的病原体检测判读阈 值可能不同，因此下列标准应适用于所有二代测序病原体检测流程。满足 质控标准的

7、合格的下机数据进入分析解读流程后，应遵循以下原则：剔 除试剂、环境中引入的假阳性病原体信息；易赊比对流程中交叉引入 的假阳性病原体信息； 报告病原体信息原则上准确到种（检出序列数 极少、相似度极高的病原复合群和分节段分型的病毒等例外），同时也应 包含相应的属信息；建议将临床高度关注和健康者样本中极少出现的 病原体信息优先呈现（即高度致病可能性），同时将某些部位（如呼吸道、 皮肤、肠道等）的常见、低（或无）致病性病原体（定植菌等）独立呈现。数据库建设：用于生物信息分析的数据库构建包括两个内容，即人源数据 库和病原体数据库。人源数据库收集需尽可能完整，不仅包含染色体基因 组，还要包括线粒体等基因组

8、、转录组及非编码序列信息。病原体数据库 收录的信息应该覆盖主要的病原体，且确保每条收录的序列数据准确完整。规则与应用不同病原体检测方法的特点：临床样本中病原体的常规检测范围包括鉴定 培养物中生长的微生物，通过血清学实验检测特定微生物的生物标志物如通过乳胶凝集进行抗原检测或通过酶联免疫吸附试验（ELISA ）进行 抗体检测，或通过分子生物学实验进行单个或多重病原体特异核酸检测。 这些方法虽然多，并且可以组合应用，对于常见高发感染也非常有效，但 是它们都属于试错型，高度依赖于临床医生的判断选择。目前在重症感染 病例的诊断上，试错型尝试病原体检测耗时较长，临床总体阳性率也比较 低。临床mNGS的技术

9、特点是能够大范围甚至是全方位试错，为临床医 生提供了一个快速的检测手段。但目前由于新技术的成本较高，且mNGS 与宏转录组学测序:mtNGS存在差异导致临床敏感度与预期相对较低, 简单地增加成本投入能有效提高临床敏感度。止矽卜，临床mNGS除了测 序生化反应外，还包含了病原体数据库自动分析比对专家系统，对于检测 结果的准确性也非常重要，故不是一个简单的测序反应。一线工作人员, 尤其是从事重症病例治疗的医生，需要对mNGS的临床应用有更多的了 解，才能使mNGS更好地服务于临床。mNGS报告解读规则：mNGS报告通过测序短序列的数量进行物种的鉴定，碱基序列片段数量越大，表明该物种在样本中存在的可

10、能性越高，但 需要区分不同物种。同时需要考虑基因组的覆盖度，覆盖度与可信度呈正 相关，但并非呈线性正相关。阴性结果的解读：mNGS报告中的信息是经过特定阈值过滤后的结果， 如果是阴性报告，首先需要分析患者的具体情况，再研究除报告外的原始 检测结果，判断是因为未达到阈值误判，还是确实不存在病原体。可以根 据具体的临床信息，在报告阈值之外考虑可能的原始检出感染病原体，如 胞内感染菌。在阴性结果中，如果没有进行RNA的宏基因组检测（也称 为mtNGS ）,可能遗漏了以RNA为遗传物质的病毒，需进一步检测宏转 录组以明确病原体，如一种新型病毒性脑炎RNA病毒的发现，否则存在 假阴性的可能。对于某个临床

11、样本，mNGS和mtNGS都为阴性的情况 下，且内参检测值提示该样本中单位体积内（通常为1mL）已知最小病 毒小于10个分子时，可以考虑阴性价值，即患者不存在感染性疾病，可能存在免疫性疾病和肿瘤等。阳性结果的解读：因不同部位临床样本的背景微生物存在差异，故阳性的 判读需要建立阈值才可以将真阳性的病原体从背景微生物中分离出来。这 些阈值可以包含一些指标，如检出特定微生物序列的数量、归一化为每百 万序列的相对值、检出微生物的基因组覆盖度及内参对照的检出等情况。 但需要在相同的测序平台、相同的实验室进行比较，以排除平台和环境差 异带来的影响。而当某个鉴定达到阳性判断阈值后，其增量与可靠性呈正 相关，

12、但并不呈线性相关，在未达到阈值时，其增量与鉴定可靠性呈指数 正相关。因此，在判断阳性时，达到阈值即可信。此外，在阳性报告中， 如果有多种微生物大量存在，则应结合定植微生物考虑假阳性物种。而针 对一些常见病原体，需考虑并增加耐药基因的检测，以提供更多的临床治 疗指导方案。常见微生物检测结果与临床检测结果不一致，且不能排除感染时，应作为 怀疑的依据，再次送高通量检测；如果高通量检测的对应病原体序列升高, 则提示有非常见的微生物，与临床信息吻合，应选择靶向抗感染治疗。非体内正常定植菌的外来侵入性微生物在非感染部位出现，一旦被检出， 即认为是病原体。对于区别背景微生物、病毒以及快速分裂期的微生物，mR

13、NA的诊断价 值有待进一步临床观察与研究加以证实。如果相应mRNA序列数增加, 则提示可能存在DNA病毒快速繁殖，要与病毒RNA进行鉴别。延迟阳性：有一些病原体由于被吞噬细胞吞噬，经一段时间裂解释放核酸 后才能被检出，需考虑多次送检。物种差异判读：不同的病原体类型对应的阈值不同，应分类解读。病毒：一些显著区别于人基因组序列的病毒，如腺病毒和流感病毒等，有 少量的特异序列检出即可信，其阈值通常在3/100万及以上即为可信； 而一些与人源序列相似度高的病毒，如反转录病毒类，在检出序列较少时, 因无法判断是否来自一些转录元件，只有更多序列检出时才可信，其阈值 通常需要超过1 000/100万，因为哪

14、怕确实是某类反转录病毒，相对较 少的检出序列也更多指向其在人体内是潜伏状态，而不是感染状态。真菌：真菌的基因组较大，并且存在较厚的细胞壁，因此在核酸提取的效 率上会大打折扣，即使进行了一些破壁处理,其检出的特异序列数仍然不 会很多，因此对于真菌的鉴定，其阈值考虑在5/100万以上，在达到 100/100万以前，其可信度随序列数增加而增加。细菌：对于一些细菌来说，要着重区分是定植菌、污染还是真正的病原菌。对于非胞内感染菌，因不同细菌间存在同源相似性，菌种间可信阈值差异 较大，并且因不同实验室而有差异，因此鉴定报告应给出具体菌种的阳性 参考阈值，并列出背景菌作为参考；而对于胞内感染菌，如结核分枝杆

15、菌 和军团菌的阈值相对较低，通常有1/100万即可考虑可信，随着序列数 增加，其可信度逐渐增加，但达到30/100万时，其增量不再有增加可信 度的意义。寄生虫：因为目前寄生虫的基因组参考数据库种类不多，且寄生虫生物的 多样性，作为真核生物，有很多与人基因组相似的元件，因此在判断阳性 时要特别要求序列的特异性。寄生虫作为阳性判断的阈值需在10/100万 以上，并且需要严格确认序列的特异性。罕见病原体的阳性价值：罕见病原体在报告中出现时，需要进一步确定其 致病性及临床特征，包括感染病灶的影像。罕见病原体的确认需要进一步 调查患者病史，以确定其为动物疫源或者环境疫源的流行病学证据。污染与定植：在mN

16、GS报告中，需要考虑取样和样本处理等环节带来污 染的可能性。例如：呼吸道肺泡灌洗液的样本报告有大量的口腔菌，首先 考虑取样是否存在污染，其次考虑由于特殊原因造成的感染。但是如果存 在非常多的背景微生物或者杂菌，且没有1种或者几种病原体占有主导量 的优势，可以间接考虑患者免疫状态严重破坏，需要引起治疗和护理上的 重视。总体来说，在众多的分子诊断技术中，mNGS作为一种全面的直 接检测方法，虽然目前的经济成本使mNGS不太可能在短期内成为临床 一线检测手段，但在疑难杂症、危重症、免疫缺陷等特殊人群中仍具有成 为病原体诊断准一线检测手段的潜力，是一种非常有效的广谱病原体筛查 方法。止矽卜，mNGS与传统的分子、血清学检测等方法在感染诊断的检测 中联合使用可发挥关键作用。