补益脾胃元气方药对SAMP8小鼠海马区形态功能和皮层胆碱能系统的影响 附脾胃肝肾疾病调治的古方今用.docx
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1、摘要:目的 研究补益脾胃元气方药人参、大补元煎、洗心汤对快速老化痴呆模型 (SAMP8)小鼠空间学习记忆能力、海马区形态功能和皮层胆碱能系统的影响, 探讨其治疗阿尔茨海默病的可能作用机制。方法3月龄雄性SAMP8小鼠随机分为模型组、盐酸多奈哌齐组、人参组、 洗心汤组、大补元煎组,以雄性抗快速老化型(SAMR1)小鼠为对照组。除对 照组和模型组ig蒸偏水外,其余各组ig药物(10mL/kg), 1次/d,连续3个月。 实验结束后采用Morris水迷宫实验检测小鼠空间学习记忆能力,透射电镜观察 小鼠海马CA3区突触超微结构,免疫组化法检测CA1区神经元密度、脑组织0 淀粉样蛋白(A0)水平,生物化
2、学法检测海马胆碱乙酰基转移酶(ChAT)和乙 酰胆碱酯酶(AChE)的活性。结果 补益脾胃元气方药各组小鼠逃避潜伏期平均值明显下降,在目的象限 游泳时间、穿过平台次数显著增加(PV0.05、0.01);各组小鼠Ap阳性细胞数 目显著降低(PV0.05、0.01),神经元特异核蛋白(NueN)阳性细胞密度有上升 趋势,但无显著差异;各组小鼠ChAT活性升高(P0.05、0.01),人参、洗心 汤组小鼠AChE活性降低(PV0.05)。结论 补益脾胃元气方药对SAMP8小鼠空间识别和学习记忆能力有明显改 善作用,其机制可能与影响小鼠海马突触结构、促进海马神经元修复、降低小鼠 脑内A0表达、调节海马
3、胆碱能系统有关。阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种发生于老年前期或老年期 的进行性中枢神经退行性疾病,以记忆认知功能减退、行为学改变为主要临床表 现1,以。淀粉样蛋白(p-amyloidpeptide, Ap)沉积、神经元丢失为重要病理 特征2。研究认为A0的异常沉积是发病的核心环节,其生化改变以海马胆碱乙 酰基转移酶(ChAT)活性下降、乙酰胆碱酯酶(AChE)活性升高为主。由于 本病发病机制尚未完全阐明,目前缺乏阻止AD病理进展的有效治疗手段4。 中医药在AD防治方面积累了丰富的经验5-6。课题组前期在中医“气化精”“精 生髓”理论指导下,以补益脾胃元气方药为
4、切入点,选取补益脾胃元气类方药的 代表方人参、洗心汤、大补元煎干预AD,体内外研究均取得良好效果7-8。本 研究通过考察人参、洗心汤、大补元煎对快速老化痴呆模型(SAMP8)小鼠空 间学习记忆能力、海马区形态功能和海马胆碱能功能的作用,进一步探讨补益脾 胃元气方药治疗AD的作用机制,为临床应用中医药防治AD提供实验依据。1材料与仪器1.1 动物SPF级雄性SAMP8小鼠70只,雄性抗快速老化型(SAMR1)小鼠14只, 3月龄,体质量2024 g,购自实验动物技术有限公司,许可证号()。动物饲 养环境为清洁级,室温1822 ,相对湿度50%70%,自由摄食饮水,小鼠 适应性饲养1周后使用。所有
5、动物饲养和实验操作程序符合中医药大学实验动物 福利伦理委员会相关规定,并经中医药大学动物伦理委员会批准1.2 药品盐酸多奈哌齐(卫材药业有限公司,批号);洗心汤颗粒剂:人参30 g ()、 茯神30 g ()、酸枣仁30 g ()、半夏15 g ()、陈皮15 g ()、炒神曲9 g ()、附 子3g ()、石菖蒲3g ()、甘草3 g (),浓缩中药颗粒每剂共15.6g;人参颗粒 剂:人参30g(),剂量等同于独参汤,浓缩中药配方颗粒每剂共6g;大补元煎 颗粒剂:人参10 g ()、炒山药6 g ()、熟地9 g ()、杜仲6 g ()、当归9 g ()、 山茱萸3 g ()、枸杞9g ()
6、、炙甘草6g (),浓缩中药颗粒每剂共12.4g。实验 所用中药颗粒均购自制药有限公司。1.3 试剂与仪器神经元特异核蛋白(Neun)抗体(GR249899-22, abeam公司);免疫组织 化学SP试剂盒、DAB显色剂(生物技术有限公司);兔抗鼠神经胶质纤维酸性 蛋白(GFAP)抗体、兔抗鼠A042多克隆抗体(生物技术有限公司);SP免疫组 化试剂盒、DAB显色试剂盒(公司);AChE、ChAT试剂盒(生物工程研究所); H-7650透射式电子显微镜(日本Hitachi公司);LKB-V/NOVA超薄切片机(瑞 典LKB公司),RM2145石蜡切片机(Leica公司);TD5A台式低速离心
7、机(实 业公司)。2方法2.1 分组与给药SAMR1小鼠为对照组,SAMP8小鼠随机分为模型组、盐酸多奈哌齐(DON) 组、人参(RSD)组、洗心汤(XXD)组、大补元煎(DBYD)组,每组14只。 根据患者临床用量的等效剂量和动物体表面积计算9,小鼠ig RSD、DBYD、 XXD、DON剂量分别为1.2、2.5、3.2 g/kg和1.027 mg/kg,药物溶解于蒸储水 配制成相应浓度的溶液。各给药组每日按剂量ig药物,给药体积为10 mL/kg, 对照组和模型组均ig等体积蒸储水,1次/d,连续3个月。2.2 行为学测试给药结束后采用Morris水迷宫测试学习记忆能力。第15天进行定位航
8、行 实验,平台置于W象限,位于水面下2 cm,每次60 s,分别以I、II、HI、IV 的4个象限池壁的中点作为入水点,记录小鼠找到平台所用的时间,为逃避潜伏 期。第6天进行空间探索实验,撤除平台,记录60 s内小鼠游经平台次数和在 平台所在象限的游泳时间。2.3 电镜观察海马超微结构末次行为学测试后,每组随机选取2只小鼠进行心脏灌注固定,取脑组织, 低温下切成1 mm3小块,于2.5%戊二醛溶液固定过夜,以0.1mol/L PBS缓冲液 浸洗30 min后,于1%四氧化饿固定液中固定2 h。以0.1 mol/LPBS缓冲液浸洗 10 min,依次用30%、50%、70%乙醇脱水10 min,
9、 70%醋酸双氧铀块染2 h,经 90%、100%乙醇脱水,还氧丙烷置换10 min,环氧树脂Epon812浸透、包埋后 切片,厚12pim。美兰染色后于光学显微镜下定位,超薄切片机切片,柠檬酸 铅和醋酸铀双染色,采用透射式电子显微镜下观察海马细胞超微结构。2.4 免疫组化法检测小鼠海马NueN、A0的表达末次行为学测试后,每组随机选取4只小鼠,取脑组织,海马切片脱蜡处理 后,经PBS缓冲液冲洗,于O.Olmol/L柠檬酸盐微波修复20 min以暴露抗原, 再放入0.03% H2O2中15 min以灭活内源性过氧化物酶,经山羊血清封闭液封闭 20 min后分别加入鼠抗NueN单克隆抗体(1 :
10、 100)和兔抗鼠A0多克隆抗体(1 : 100), 4 过夜。于37 复温lh后加入生物素标记的羊抗兔IgG, 37 孵育 30 min后加入生物素标记的链霉亲和素,37 孵育30 min,最后用DAB显色, 苏木素染液复染,中性树脂封片,于光学显微镜下观察。取光镜下3个连续不同 视野,分别计数海马CA1区神经元的NeuN阳性细胞数和Ap阳性细胞数,通过 Image-Pro plus测量该视野下CA1的面积,计算CA1区NueN的阳性细胞密度。2.5 生物化学法检测皮质ChAT、AChE活性末次行为学测试后,取小鼠脑组织,在冰浴上剥离出皮层,滤纸吸干后称定脑组织质量,按质量体积比1 : 9加
11、入4 C预冷的生理盐水,用内切式匀浆机制 备|0%的组织匀浆,低温低速离心1。min,取上清液,按照试剂盒说明书测定 皮质ChAT、AChE活性。2.6 统计学处理实验数据以表示,应用SPSS 20.。软件进行统计学分析。各组数据比较采用 单因素方差分析和多因素重复测量方差分析。3结果3.1 各组小鼠空间学习记忆能力比较结果如表1所示,在定位航行实验中,随着训练时间的增加,各组小鼠逃避 潜伏期均呈下降趋势,与对照组相比,模型组小鼠平均逃避潜伏期明显延长(P 0.01);与模型组相比,DON、RSD、XXD、DBYD组在第4、5天逃避 潜伏期明显缩短(PV0.05、0.01 )o在第6天空间探索
12、实验中,与对照组比较, 模型组小鼠穿越平台次数和目的象限游泳时间显著较低(PV0.05、0.01);与模 型组比较,各组小鼠穿越平台次数和目的象限游泳时间明显增加(PV0.05、。)。表1各组小鼠在不同时段的平均逃避潜伏期、穿越平台次数、H的象限游泳时间(工$, = 6)Table 1 Average escape latency, number of crossing platforms, and shimming rime in target quadi ant of each group of mice in different periods (7s, = 6)与对照组比较:0.05
13、P0.01;与模型组比较:Pv0.05”Pv0.01,下表同醐剂坎gkg4)第1天逃避潜伏期/s穿越平台次期 次第6天目的象限游泳第6天弟2天第3天第4天第5天搬39 於 11.723593士1797335312813185 14.6328.40+ 9.551500.5216.525P753.63士 491A5273 7.0?51.13 775A5044 829V48 .阱士 4 .1420330.52A8.774 了DON1.027X10-34631 9.4545.10 11.0342.6715.1737P2 8836.15 12.68,0.831.1714P9+5.70*RSD12+4.7
14、4+18.4140P4+112739Ps125335331225*34.081155*1.00+0.89*15P1+4.45*XXD3242.4311555406619593893士15 夕35.07+ 9蓟322315.7(T1.17+0.41*14.61+3.44-DBYD1541281127937.71+135736551165T33.72+173*30.8810.ir133+05T15.1224PP z 0.05 P- 0.01 control groq): *P 0.05 *P 0.01 vs model sroq). same as below tables3.2 各组小鼠海马突触
15、超微结构比较如图1所示,对照组小鼠神经元正常,胞质可见较多线粒体、内质网等细胞 器,突触前后膜间距正常、间隙清晰,可见突触囊泡,未见病变。模型组小鼠海 马胞质局部空旷不均匀,多数线粒体可见脊消失溶解,内质网粗大深染,可见自 噬小体;完整突触较少,突触结构深染,前后膜分界不清、间隙消失,电子致密 带范围异常增大,囊泡明显减少。DON组胞质局部空旷不均匀,但仍线粒体、 内质网等细胞器,少数突触前后膜分界不清,后膜电子致密带范围较大,但前膜 相对正常,囊泡较多,病变明显减轻。DBYD组胞质局部空旷不均匀,细胞核可 见染色质固缩,线粒体内可见自噬体,突触结构清晰,但突触脑囊泡明显减少。Fig. 1 l
16、ltrasti uctui e of hippocampal synapse of mice in each group3.3 免疫组化法检测小鼠脑内NueN、A0表达如图2、表2所示,Neun表达于神经元胞质中,呈浅黄色或棕黄色颗粒。 与对照组比较,模型组NueN阳性细胞密度升高(P0.05);与模型组比较,各 给药组均无显著差异。如表3、图3所示,A0表达于海马区,呈褐色或黄褐色 斑点状。对照组小鼠海马细胞几乎未检测到A0表达;与对照组比较,模型组小 鼠海马内AP阳性细胞数目明显升高,聚积形成老年斑(P0.01);与模型组比 较,各给药组小鼠神经细胞内A0阳性细胞数目显著降低(PV0.05
17、、0.01 )o图2各组小鼠脑内NueN的表达(X200)Fig. 2 Expression of NueN in brain of mice in each gi oup (x200)图2各组小鼠脑内NueN的表达(X200)Fig. 2 Expression of NueN in brain of mice in each gi oup (x200)各组小鼠脑内NueN密度(三土$, =6)Table 2 Density of NueN in brain of mice iu each groupTable 2 Density of NueN in brain of mice iu eac
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