M5HiPerPlusSite-DirectedMutagenesisKit升级版使用说明书.docx

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1、M5 HiPer Plus Site-Directed Mutagenesis Kit(升级版)使用说明书产品名称M5 HiPer Plus Site-Directed Mutagenesis Kit 10T MF129-01 (升级版)M5 HiPer Plus Site-Directed Mutagenesis Kit 20T MF129-02 (升级版)【储存条件】长期保存，请置于-20,有效期24个月。【产品简介】本试剂盒用于克隆在质粒上的DNA序列的定点编辑，可实现快速高效的密码子突变、插入或缺失等改变，支持大片段序列的插入和 册I除，配合推荐的引物设计方法，突变效率可达100%。只

2、需通过M5-Mutasemix进行目的质粒扩增和M5-Remase酶清除原始质粒 模板，产物转化大肠杆菌感受态细胞即可得到目的载体的克隆，操作简单方便。本试剂盒采用的高速超保真酶M5-Muta （提供2种适 合不同模板的A和B形式的mix）可极大提高扩增质粒全长成功率，并显著缩短PCR时间。1020kb的质粒的定点突变，只需1天即 可完成目的基因的定点编辑，可以广泛应用于基因及蛋白质的功能研究。【产品组分】组分名称2x M5-Mutase Mix (A) 2x M5-Mutase Mix (B) M5-Remase (10U/pl) 10x M5-Remase Buffer110 pl110

3、pl10 pl25世220pl 220|jl 20 pl50 pl【引物设计】推荐使用“非对称”的引物设计方法，即突变位点不要位于两条引物的中央，而是采取下图1的排布方式，保证两条突变引物的31 端与原始质粒完全匹配的序列的Tm值均达到58-68。图1中所示为将原始质粒上AT替换为GC,引物的上引入突变位点的位置更 靠近5端，使两条引物的5端相重叠的序列的Tm值达到4853（；同理设计插入和删除突变的引物。如对引物设计不熟悉，推荐 采取在线引物设计：。5，Mutation Primer 151 Mutation Primer 2Original Plasmid图1引物设计示意图【操作方法】1.

4、 PCR扩增目的质粒（请注意是扩增质粒全长，而不是某个片段，PCR延伸时间请设置足够）:A、按下表配制PCR反应体系:2xM5-Mutase Mix *10 plPrimer 1 (10 pM)0.4 3Primer 2 (10 pM)0.4 3Original Plasmid1-10 ngddH2O 补足至20 x本试剂盒提供A和B两种不同配方的mix,可以先选择A mix进行扩增质粒全长，如果A mix扩增不出来再尝试B mix。ProcedureTemperatureTimePre-denaturation952 min.Denaturation9425 sec.Annealing54-

5、6425 sec.Extension6815 sec.-30 sec./1 kb DNAFinal extension683-5 min.Keeping4foreverB、推荐使用的PCR程序:15-25cycles*PCR反应结束后，取5-10 3产物进行电泳，必须看到明显和原始质粒大小一致的条带，才可进行下一步操作。 注意：*如果1525个循环看不到明显的条带，可以把循环数提高到30个，看到条带后才可进行下一步操作。2.去除原始质粒模板取8 3 PCR产物，加入1 pl 10x M5-Remase Buffer和13M5-Remase （1011仙）酶,37 水浴1h,即可用于转化dam+

6、型大肠杆 菌感受态细胞（如MF038或MF039）,涂布相应抗性的平板培养。3培养过夜后挑取单克隆进行测序。【注意事项】1 .如果转化后无单菌落出现，请检查PCR的条件（尤其是延伸时间是否足够扩出质粒全长，时间不够导致PCR失败足。2 .如果电泳图没有正确大小的条带，请尝试降低或者调高PCR的退火温度（M5-Mutase酶退火温度按Tm+3设置可能会更好）。3 .如果不是PCR的问题造成，请检查感受态的转化效率及筛选培养基平板。4 .原始质粒的加入量需严格控制，加入的原始质粒的量尽量不要超过10 nq （原始质粒太多，将对PCR有强烈的抑制!）。5 .如出现突变效率低的情况，请检查模板质粒的加

7、入量，并可延长第二步M5-Remase的反应时间。FAQQ：我扩增后得到2条带，是否影响后面的实验？A：这与引物设计有关，可能有非特异结合位点，但是只要有正常大小的目的质粒条带扩增就可以继续消化完成转化，因为小条带只可 能是质粒的一部分序列，不会影响转化。Q：对同一个质粒的3个位点突变，需要设计6条引物，不知道如何使用该试剂盒对这3个位点进行快速突变？A：同时突变多个位点的，比如设计了引物F1/R1, F2/R2,F3/R3,分别用F1+R2, F2+R3, F3+R1配对进行PCR （分3个管独立进行）, 然后消化模板质粒后，混合，50度反应1h后进行转化。每个PCR的产物跑胶鉴定确定PCR成功，是否有非特异或引物二聚体，如 有，建议切胶回收后再混合。【备注】本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。