右美托咪定对小鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护效应_潘建华.docx

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3、和 1尺十 0既组，阻断 肝 700/0血流 60111111，再灌注 6小时。 80十 0找和瓜 +叉组，手术前 3 0111111给予腹腔注射 右美托咪定 25 113/8； 80和 III组，手术前 30111给予腹腔注射等体积的生理盐水。速 率法测血清丙氨酸氧基转移酶 (血 II丨加肪 1丨 1101服 3知说，丛工 )和门冬氨酸氨基转移酶 如叩 II啦 &11111101:1118？ 61867人 81活 性 ， 酶 联 免 疫 吸 附 法 血 清 白 介 素 和肿瘤坏死因子胃 -甸水平。苏木素 -伊红染色观察肝脏病理改变。原位末端脱氧 核苷酸转移酶介导的 01111？ 缺 口 末

4、端 标 记法 检 测 肝 脏 凋 亡 细 胞 。 结 果 1尺十 0狀组血清仙 I、他 I、江和 I膨 -01水平均比 II？组明显降低 05病理结果显 示， 110狀组小鼠肝细胞损伤较 III组为轻。肝细胞凋亡指数， 110狀组较 III组明显 降低 01)0 50组与 80十 0狀组比较，各项指标均无统计学差异。结论右美托咪 定对小鼠肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与抑制炎性细胞因子生成有 关键 词：右美托咪定；缺血再灌注；肝脏；小鼠 作 者：潘建华 指导教师：杨建平 1)6X1116(161011111116 ？ 1016018 丨 1*0111 乙卜 6 1801161111

5、 6)61*1181011 III 11106 入 1)8111 06046 丁 0 111681:181:6 口 访以 已 6601； 0【 6X1110(161:01111(11110 111 111106 1卜 61 11(3 118 11160111118111 11611101！ 8 ？ 01！ 05781/6 111106 61*6 1*11(101111 11(16(5 11110 811111-01)61*1:1011 01X1 ， 811 这 111-01111011 &11(1 0X01X1 1801161111 1*661*118100 9 1801161111 1*66

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11、 01100 5： ？肪 II&111111 811136186(1 5： 目录 # 胃 1 1材料和方法 3 2 關 11 3谢仑 16 ！吉 1 仑 19 #；南犬 20 综 、 & 2 4 缩略词表 42 攻读学位期间公开发表的论文 43 & 读 144 一 / 1 - 刖 吕 肝脏血液供应非常丰富，肝脏的血容量相当于人体总量的 147。成人肝每分钟血流 量有 1500-2000！ 111。但肝脏是对缺血再灌注损伤最敏感的器官之一。当血管阻断，肝 血流中断，葡萄糖供应不足，八 I？生成减少，依赖八 I？的细胞内外离子跨膜转运减少， 钾离子顺浓度梯度穿过细胞膜到达细胞外，钙离子进入细胞内

12、,导致细胞内钙超载； 氧气的减少会使葡萄糖发生无氧代谢，从而导致乳酸堆积而引起酸中毒；氧自由基的 生成，使细胞器内或细胞膜中的脂肪酸发生过氧化。钠离子和钙离子会随之流入细胞 内，然后大量氯离子和水分子流入细胞内，导致细胞的肿胀或水肿，加大细胞死亡的 风险。钠、钾、钙离子的浓度改变、氧自由基的释放、酸中毒、兴奋性神经递质的释 放加重了细胞的损伤，进一步引起更多的生化改变，反过来再加重肝细胞的损伤，如 此恶性循环。当达到某一域值时，即使缺血的严重程度不足以引起细胞坏死，但是缺 血却可能启动细胞的程序化死亡，即细胞凋亡。 肝脏移植术和 肝脏部分切除术，已经成为终末期肝病和肝癌的有效治疗手段，但 是围

13、手术期肝脏缺血再灌注损伤仍是目前临床比较棘手的问题。在肝脏移植手术或切 除术中，尽管阻断肝脏血供是一种有效控制出血的方法，但这过程导致的缺血再灌注 损伤，同样也是术中急性肝衰竭的原因之一 。它导致发病率增加，住院时间延长， 病死率增加，并给国家卫生保健体系带来沉重负担。目前对肝脏缺血再灌注损伤的防 治仍是相关科学研究的重点。 肝脏缺血再灌注损伤与多个进程有关，如枯否细胞的激活，氧化酶（ ()的 产生 1中性粒细胞的浸润，粘附分子的增加，细胞因 子的释放，肝窦内皮细胞的损伤 和分离卜7。近年来的研究提示再灌注激发的以固有免疫为主的炎症反应在脏器 III损 伤过程中具有重要的致病作用包括巨噬细胞、

14、中性粒细胞等炎症细胞以及趋化因 子、粘附分子、炎性细胞因子等致炎性介质均参与其中。巨噬细胞、中性粒细胞等加 重再灌注后炎症反应，造成组织损伤的机制包括：通过分泌大量炎性因子、活化氧簇 以及多种蛋白水解酶，诱导组织细胞凋亡、坏死，造成器官功能损害；上述炎性反应 产物进一步促进效应细胞向损伤部位聚集；大量的炎性细胞浸润到损伤的肝组织以及 微血管内，减少肝实质血流 ，加重微循环障碍。 炎症介质在肝脏 01损伤进程中也居于重要地位 如上述趋化因子能够介导炎症 细胞浸润，同时，多种粘附分子也参与这 过程。肝脏发生 1尺时，毛细血管内皮细 胞表面粘附分子、选择素等表达增加，有利于炎症细胞与内皮细胞间的相互

15、作用，促 进前者透过毛细血管浸润至损伤组织。同时，多种炎性细胞囡子也参与再灌注激发的 炎症反应并诱导组织损伤。比如， 1-01可以直接损伤肝毛细血管，趋化并激活单核、 巨噬细胞，并促进后者产生过多的氧自由基，力口重内皮细胞损伤。而正对肝脏组 织的再灌注损伤也具有童要意义 在已有的文献报道中，实验者使用药物，如抗氧化剂，抗炎剂，以及血管扩张剂 进行缺血预处理，研究其对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用 右美托咪定 1X1114过 0111丨 3丨狀）是 一种高选择性 012-肾上腺素能受体激动剂，02、 011受体结合比例约为 1 600： 1，对 012受体结合能力是可乐定的 7 8倍，其内在活性优

16、 于可乐定 【 11】 ，具有镇静、镇痛、催眠、抗焦虑、抑制交感神经活性等特点，且无呼吸 抑制的 副作用。临床上，右美托咪定已被用来作为辅助麻醉，镇痛，重症监护病房的 镇静作用 【 12】 。同时，研究显示以固有免疫为主的炎症反应在肝脏缺血再灌注（丨 饥 I叩 61118丨 011， III损伤中具有重要的致病作用。 以往的研究表明，右美托咪定对局灶性脑，心，肾，睾丸缺血及止血带引起的缺 血再灌注损伤有保护作用。尽管其临床上使用日益广泛，但右美托咪定对肝脏再灌注 损伤的的影响仍有待研究 【 133。因此，本实验中我们利用小鼠肝脏瓜模型，研究评价 右美托咪定对肝脏瓜损伤的生化和组织学影响，探讨其

17、对小鼠肝脏瓜损伤的保护作 用及其机制。 1材料和方法 1 . 1 实验动物及分组 徤康雄性 0575176小鼠 40只， 6 8周龄，体童 20 25克，由苏州大学医学院实 验动物中心提供。小鼠随机等分为假手术组 “() 、右美托咪定预处理假手术组 缺 血 再 灌 注 组（ 瓜 ) 、右 美 托 咪 定 预 处 理 缺 血 再 灌 注 组 每 组各 10只。动物均于实验前置于实验室适应环境 1周，自由进食、饮水；室温控制 在。 0， 12小时光照，术前禁食 12匕 1 . 2 主要仪器设备 显微手术器械 上海医疗器械 (集团有限公司手术器械厂 无损伤血管夹 5 上海医疗器械 (集团有限公司手术

18、器械厂 匸 1001倒置显微镜 荧光显微镜 石蜡切片机 德 国 公 司 恒温水浴箱 上海天平仪器厂 电热恒温干燥箱 上海医疗仪器厂 架盘药物天平 北京玄武天平厂 电子天平 德国 8丨饥 16113公讀 撕尺 -1恒温水洛振荡器 上海思尔达科学仪器有限公司 离心机 5卯 611(101 免疫组化石蜡包埋机 德国公司 1 . 3 主要药品与试剂 右美托咪定 江苏恒瑞医药股份有限公司 水合氯醛 上海第一生化制药公司 111试剂盒 V汉汝 公司 505八试剂盒 北京达科为公琦 甲醛 上海试剂厂 乙醇 上海试剂厂 1 . 4 主要试剂的配制 1、苏木素和伊红染液 苏木素染液 :苏 木 素 放 入 501

19、111无水酒精中 4搅拌至其完全溶 解；钾 明矾（硫酸铝钾） 1008放入 1000爪 1双蒸水中，加热溶解（煮沸；将溶解的苏木素酒 精倒入明矾水溶液，混合后尽快大火煮沸 1111111，停火后待停止沸腾后慢慢加入氧化汞 粉末 2.58混匀（注意勿沸出，再加热煮沸 2分钟，速将过角烧瓶放入冷水中，冷却 后过夜，第 5天过滤。放一周后使用前加入冰醋酸 101111/5001111染液。 伊红染液 5001111 伊红 2.58溶于 25:011双蒸水中，加冰醋酸 200札加双蒸水 501111， 加冰醋酸 200汕加双蒸水 20111，滤纸过滤，沉淀放于 601烤箱中烤干，然后加 95 乙醇50

20、01111。 2、 135缓冲液： 103配方： 缓冲液 0.5从 只了；） 1001111 01 8.5 940.1511101/10 双蒸水 加至 10001111 185配制方法： 先以少量双蒸水溶解他 再加入了 1讯： 1缓冲液，最后加双蒸水至 1000爪 1，充分 摇匀。 3、 108-1101 8 0 溶液： 配制方法： 1 称量 121.1 覺子 11.烧杯中 # 加入约 8001111的去离子水，充分搅拌溶解。 1加入 42仍 1浓盐酸调节所需要的阳值。 4将溶液定容至 11 5高温高压灭菌后，室温保存。 1 . 5肝脏缺血再灌注模型的建立 参照 2旧等 报道的方法制作小鼠肝脏

21、缺血再灌注模型。 107。水合氯醛 5！ 11敗 8腹腔注射麻醉，碘伏消毒。 0麻醉后小鼠取仰卧位，腹部正中切口；，沿腹中线开腹，暴露肝左中叶与肝 右叶之间的门脉系统，分离门静脉。 用无损伤动脉夹，夹闭门静左叶和中叶分支及肝动脉分支，阻断肝脏左 叶、中叶血供 60 111丨 II，覆盖温湿纱布，以肝脏左中叶颜色变白为夹闭成功标志，此过 程注意保温以及保持腹腔脏器湿润 。 “ ） 111后松开动脉夹，恢复肝脏血供，肝脏颜色变红。逐层关腹，再灌注 6小 时后处死，获取血、肝脏组织。 (五）药物处理：右美托咪定按照 25 112/味，于手术前 30分钟腹腔注射给药。其 余两组，于手术前 30分钟腹腔

22、注射等体积的生理盐水 ()假手术组开腹后覆盡温湿纱布， 60！丨 !1后关闭腹腔。 1 6标本处理 小鼠颈椎脱臼处死，摘眼球放血，血标本收集于无热源五？管中，室温静置化、 后以 2000转丨分离心 15分钟，取上清液，冻存于 -801待检。取部分肝左叶组织用 10甲藤溶液固定后制备 .石婚切片。 1丨 7血清学检测 血清八 0丙氨酸转移酶、血清人 31 (门冬氨酸转移酶）的检测由医院检验科完成。 血清中肿瘤坏死因子 01 (胃 -)和白细胞介素 6 ()浓度的检测，采用相应的 吼 18八试剂盒（购自达科为公司）进行操作。 1、标本及试剂准备 将血清标本从 -80亡冰箱内取出，回复至室温并融化；

23、 (之）将 I灿 -01、 正 -6的 505八测试试剂盒从 41冰箱内取出，回复至室温并从中取 出所需板条，其余板条密封后放回、至 41：冰箱。 03用标本稀释液稀释 1-01、 11.-6标准品，稀释比分别为 1-01： 15.6 558/1111、 31.2 四 ,爪 1、62.5 1)3/1111 125 250 500 1000 1-6： 31.2 13/1111 62.5 125 辟 / 、 250 500口 1111、 1000(/1111、 2000口 爪 1、 40001/1111。标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存，稀释如将标准品振汤混 匀。 将用于检测胃 -01、正

24、 4含量的血清样本用标本稀释液稀释至适当倍数。 2、检测步骤 使用前将所有试剂充分混匀，不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的 气泡，产生误差。 0根据待测样品数量加上标准品的数量确定所需的板条数。每个标准品和样品均 至少做 3个复孔。 反应孔内加入稀释后的标本 100 0。 “) 加入稀释后的标准品 1000于反应孔并立即加入 50 0的生物素标记的第 抗体。 盖上膜板，轻轻振荡混勻， 371温育 1.5小时。 0甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡 30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍午。重 复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。 每孔加入 100 0的亲和链酶素标记的抗体，轻

25、轻振荡混匀， 371温育 30分钟。 (了）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡 30秒，甩去洗浲液，用吸水纸拍干。重 复此操作 3次。 ()每孔加入底物 50 0，轻轻振荡混匀， 371温育 10分钟。避免光照。 ()取出酶标板，每孔迅速加入 100 0终止液，加入终止液后应立即测定结果。 ( ）在 45011111波长处测定各孔的吸光值 00值 X 3、结果判断 每个标准品和样品的 00值减去 0四 标 准 品 的 00值，即为各个被检测样品 (标准品和血清样品的 00值。 分别以 1-01、正标准品的浓度为纵坐标，以它们的实际 00值为横坐标， 利用软件作出标准曲线，并获得标准曲线和回归方

26、程。 利用已 经获得 的回归方程，根据各待测样品的实际 00值分别计算其 1-01、 11.-6的浓度。 1 . 8卜 染色（苏木素一伊红染色 肝 脏标本保存于 107。福 尔马林液中， 用 于制备石蜡切片并行五染色，进行组 织学分析，具体操作如下：脱水：不同浓度梯度的乙醇脱水，每级 20分钟，依次为 6004乙醇、707。乙 醇 、乙 醇 、 907。乙醇、 957。乙醇 I、 II以及无水乙醇 I、 II； 透明： 二甲 苯透明 I、II级，每级 10分钟；包埋：将组织块放于 601： 温箱内浸腊 4 小时，利用金属柜进行包埋，凉却后修整腊块；切片：石蜡切片厚度为 3 4 展 平置于 60

27、1烤箱内烘烤 4小时；脱蜡：二甲苯透明 I、 II级，每级 5分钟；脱水： 不同浓度梯度的乙醇脱水，每级 2分钟，依次为无水乙醇 I、 II、 957。乙醇 1、 II、 卯。 /。乙醇、 807。乙醇、 70。 4乙醇、水洗；染色：埃利克苏木素液染色 5 10分钟、自来 水洗、盐酸酒精分化片刻、自来水洗、 501： 601蒸馏水蓝化 5 10分钟、自来水 洗、酸化伊红复染 2分钟；不同浓度梯度的乙醇透明：依次为 707。乙醇片刻、 8070乙 醇片刻、 957。乙醇 I、 II级各 5分钟、无水乙醇 I、 II各 5分钟；树脂封固、晾干； 光镜下阅片。 1 9肝细胞凋亡检测 采用原位末端脱氧

28、核苷酸转移酶介导的 3171？缺 0末端标记法 0111对肝脏 凋亡钿胞进行检测，试剂盒购自 匕公司 （ 出丨 0(111卩 1入 39。 操作流程： 八 .样本的脱蜡处理 1、室温下将石蜡组织切片放入甲苯中浸泡 5分钟。更换新的二甲苯再浸泡 5分钟 以彻底脱掉石蜡。 2、鼙温下用 1007。乙醇浸泡切片 5分钟，更换新的 1007。乙醇再浸泡 5分钟。 3、室温下用梯度乙醇 90、 80、 70。 0各浸洗 1次， 每次 3分钟，逐渐增加水分。 4、用 1x108轻轻润洗切片，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。这时 可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平

29、衡标记 操作。在实验过程中，切勿让样品干燥。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。 只 .增加样本的通透性 1、按 1： 100的比例，用 10 1111411丨 5溶液 （阳 8.0作为稀释液来稀释 21/1111的蛋 白酶 X溶液，使其终浓度为 20昭如 1。每个样本需要 100士蛋白酶 X溶液可以将 1(1的 2111的 111蛋白酶 X溶液加至 990的 101111113溶液中配制而成 2、每个样本上滴加 1000浓度为 20昭 / 的蛋白酶 X溶液，使 其被全部覆盖，室 温孵育 20分钟。注意严格控制孵育时间，孵育时间过长可对细胞造成一定的伤害， 过短则可能造成透性处理不充分，影响

30、标记效率。 3、用 1x135溶液润洗样本。 4、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸千载玻片上样本周围的液体。处理好的样本 放在極盒中保持样本的湿润。 匸 .平衡和标记反应 1、按 1： 5的比例用蒸馏水稀释 5x11平衡缓冲液每个样本需用 200 缓冲液 和 800蒸馏水混合稀释成 1000缓冲液 X 2、滴加 1004 平衡缓冲液使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育 10-30分钟。 或者将载玻片放入一个含有 1x1(11平衡缓冲液的缸中，保证缓冲液没过样本。在等 待孵育的同时准备标记反应混合物。 3、把 1(11酶从冰箱中取出，为了减少试剂损耗，在打 幵管盖 前需短暂离心试管。将 置于冰上酌

31、洁净离心管一一做好标记，用移液器准确加入 57(1突光素片段末端标记 反应混合物尺 -？ !昭 2IVI人 650拙八 II0XVIIX)和 30 1(11酶 轻轻吹打混匀备用。阴性对照的标记反应混合物中不加酶， 而用蒸馏水替代。 4、轻轻吸千样本周围的 1x7(17平衡缓冲液，注意不要触碰到样本。 5、在每个样本上立即滴加 600上 述 准 备 的 标 记 反 应 混 合 物 。 6、用预先裁剪好的比样本稍大的封口膜覆盖样本。注意：可将封口膜折起 角以便于取放。封口膜的使用不仅可以确保反应混合物的均匀分布，也能减少孵育 过程中的液体蒸发。 7、将切片置于湿盒中于 37。 0孵育 60-90分

32、钟。 13.终止与结果评断 1、移走？虹通丨 !.封口膜，并将切片置于 1x138溶液中室温孵育 1分钟。 2、轻轻去掉多余液体，换用新鲜的 1x188溶液室温孵育 1分钟。 :重复该步骤 1次。 3、用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的 138溶液。 4、逐谪滴加 “01111 如 8封片剂并盖上盖玻片。 5、在盏玻片的边缘擦掉多余的 10111111118 1如，用指甲油密封边缘 。 0111111113 6(31 & 中含有的 0？ 1染料可与细胞 0八特异结合并染色，并可用适于 01的滤光片观 察样本中的全体细胞。 0？ 1可使所有标记和未标记的细胞在 330-38011111波长处被 激发

33、荧光，从而观察到所有细胞。 6、用标准的绿色荧光滤光片，可在 465-49511！波长下激发并对被标记的凋亡细胞进 行分析。在此条件下，被标记上的细胞会发出亮绿色荧光。 7、免疫荧光显微镜下观察，细胞核为绿色则为凋亡细胞。每张切片随机选取 5个高倍 镜视野 (如幻 )，然后按凋亡指数 (叩 0辦 03丨 3丨 六 幻 气 .凋亡细胞数 /了细胞数 ； 100 5计算。 1 . 1 0统计学分析 釆用 5953 16. 0统计软件，计量资料以 1 8表示，组间差异采用单因素方差分析， 05表示差异有统计学意义。 图 1各组小鼠 I、八 817欠平， 11=10， 3 2结果 2 . 1 右美托咪

34、定降低肝脏 I 卩后处了、八 3 了水平 吣和八 81是反应肝损害的重要指标，与缺血再灌注组 110相比，右美托咪 定预处理缺血再灌注组（汉 +狀）血清 1、人 81水平明显降低（料，？ 0別 01， 假 手 术 组 与右 美 托 咪 定 预 处 理 假 手 术 组 无 统 计 学 差 异 。 上述结果表明，右美托咪定减轻肝脏 01后的肝功能损害，本实验剂量的右美托咪定 肝脏毒性并不明显。 图 2各组小鼠正 -6、 1-01水平 ， 1 产 10， 3 2 . 2 右美托咪定减轻肝脏 后 11-6、了表达 胃 -01、 几 -6是重要致炎性细胞因子，多由炎症细胞分泌，能够加重炎症反应并 诱导肝

35、脏组织细胞的凋亡、坏死。采用酶联免疫吸附试验检测各组小鼠血清内 1化 01、 11-6水平，与缺血再灌注组（汉）相比，右美托咪定预处理缺血再灌注组（汉 +狀 ) 血清几 -6、表 达 水 平 明 显 降 低 （ 义 假 手 术 组 与 右 美 托 咪 定 预处理假手 术 组 无 统 计 学 差 异 。 上 述 结 果 表 明 ， 右 美 托 咪 定 抑 制 肝 脏 III 后的炎症反应。 2.3右美托咪定改善肝脏 I卩后肝组织形态学变化 假 手 术 组 与 右 美 托 咪 定 预 处 理 假 手 术 组 标 本 无 明 显 病 变 ， 肝 脏组织结构正常，脉管系统形态结构正常，血管内皮完整，肝

36、细胞 形态结构正常，肝 窦内皮完整，见图 3八、 38。缺血 60爪丨 11，再灌注 6 11后（汉） ， 肝细胞水肿、变性、 坏死，大量炎性细胞浸润，肝窦充血，见图 3(1。 右 美 托 咪 定 千 预 组 标 本 病理改变较 III组明显减轻，部分肝细胞变性，少量坏死，炎性细胞浸润减轻，肝窦 充血明显减轻，见图 30。上述结果表明，右美托咪定可以明显减轻肝脏 III后肝细胞 损害，且本实验剂量的右美托咪定对正常肝组织的损害并不明显幻 人 ： 80 81*01113； 8： 80十 0找 31*01113； 0： III 0： I尺十 06乂 讲0叩 3 丑汗 6(8 0？ 6(61:011

37、11 1116 011 11乂 6 1118101037 10X11II6081II 81&11111189 400 图 3右美托咪定对肝组织形态学的影响 () 2.4右美托咪定减轻肝脏 1卩后肝细胞凋亡 凋亡是 种程序性细胞死亡的过程。当肝脏面临再灌注等损伤剌激时，肝细胞往 往首先出现凋亡，随着损伤的加重逐渐坏死，因此，分析肝细胞的凋亡情况也是衡量 再灌注损伤的重要指标。 111法标记，免疫荧光显微镜下观察，绿色荧光则为凋 亡细胞。假 手 术 组 与 右 美 托 咪 定 预 处 理 假 手 术 组 无 凋 亡 细 胞（ 图 4八、图 43。右美托咪定预处理缺血再灌注组（顶 +狀）凋亡细胞少，

38、缺血再灌注 组（瓜）凋亡细胞多，细胞凋亡指数统计学有显著差异（料 (图 4匕 图 40夂结果显示，右美托咪定减轻肝脏 III后肝细胞凋亡 3 图 4各组小鼠肝细胞凋亡 XI胃 1检测 表 1缺血再灌注组 尺）与右美托咪定预处理缺血再灌注组（瓜 +狀）细胞凋亡指 数（图 4匕 图 仍 ） 组别 例数 细胞凋亡指数 () III组 10 46.752.69 服 0级组 10 213212 ？ 0001 ，乂 ； . III 邑 !) 3讨论 肝脏移楦术和肝脏部分切除术，已经成为终末期肝病和肝癌的有效治疗手段，但 是围手术期肝脏缺血再灌注损伤仍是目前临床比较棘手的问题。在肝脏移植手术或切 除术中 ，

39、尽管阻断肝脏血供是一种控制出血的有效方法，但这过程导致的缺血再灌注 损伤，同样也是术中急性肝衰竭的原因之一 -可以说瓜是肝脏手术，尤其是肝移植不 可避免的过程，可导致急性炎症反应并由此引起器官的严重损伤和功能丧失。最大限 度的减轻汉，可以使更多的患者从肝脏手术中康复。因此，探索肝脏缺血再灌注损伤 的预防和治疗具有很重要的临床应用价值。 右美托咪定是一种新型的 012-肾上腺素能受体激动剂， 012受体已被证实存在于外 周和中枢神经系统，激活 02受体能够产生镇静催眠、镇痛、抑制交感活性、且无呼吸 抑制作用。临床上，右美托咪定已被用来作为辅助麻醉，镇痛，童症监护病房的镇静 作用 除此之外右美托咪

40、定还具有其他方面的重要应用，如神经保护、心肌保护和肾 脏保护作用 ，但右美托咪定对肝脏缺血再灌注损伤的影响国内外报道较少 。 本实验通过成功复制小鼠肝脏缺血再灌注模型 【 14】 ，研究发现右美托咪定预处理， 能够降低小鼠肝脏 III后转氨酶水平，抑制肿瘤坏死因子 01 (-)和白细胞介素 6 ()的表达 ， 减轻肝组织形态学改变并抑制肝细胞凋亡。上述结果说明，右美托 咪定对小鼠肝脏 01损伤具有保护作用，这种保护作用与其抑制肝脏见后炎症反应密 切相关。 1-01是细胞因子家族中最强效的炎症介质，胃 -01可通过上调血管内皮的细胞 黏附分子、促进炎性介质激活白细胞、刺激中性粒细胞以释放超氧阴离

41、子、激活巨噬 细胞释放，白细胞介素 1，白细胞介素 6，白细胞介素 8，？ 022及 等在缺血再灌 注过程中对移植肝产生损伤作用 网。 I尺中，缺血直接导致组织缺氧 ， 0 6 1 1 3 等对 III比肝细胞更为敏感。 X叩饱聒化后可产生多种细胞因子 以及氧自由基，直 接损伤血管内皮细胞和肝细胞 【 3一 7】 。同时，激活的 X叩取 115产 生 大 量 的 肝 脏 I凡可导致胃 4的表达上调。实验证明，通过干预 &的产生和活化，可达到减 轻肝脏 III的目的 。 缺 血 前 用抗 单 克 隆 抗 体 中 和 1-01能减少肝细胞凋亡、 减轻瓜 【 24】 。说明，胃 -01和正表达的高低

42、，可以反应缺血再灌注损伤的轻重程度。 11.-6是急性炎症反应最重要的介质，参与了炎症时多种细胞活动，包括细胞增殖、 分化和凋亡等。 11.-6信号途径可能对肝脏组织的再灌注损伤更具意义： 11.-6与受体结 合 :后活化了諷 13激酶丨信号转导子和转录激活子（彳狐 13 11 II&867 31111血 113(111! &11(1 奶丨碰 0 0？血肥。 !丨饵丨 011，了人 /81 入 I信号通路，促进调亡相关半胱氨酸天冬氨酸特异 性蛋白酶 叩 3&)表达升高，进而诱导肝细胞凋亡；部分免疫细胞亚群包括单核细 胞、中性粒细胞和部分 I细胞、 8细胞也表达正 -6受体，再灌注时大量内源性正

43、与 受体结合后活化此类免疫细胞，进而加重組织损伤。服也伽匕 -人加丨 7 丫等研究正 -6 信号通路对氯化亲诱导从 1的作用时发现，与野生型小鼠相比，正基因敲除小鼠肾 功能损害较轻，肾小管周围中性粒细胞浸润明显减轻。临床研究也发现在移植物功能 恢复不良的肾移植患者中，再灌注 5 111丨 !1内肾静脉即可检测到髙水平的正 -6和正 -113， 因此高表达正 -6和几 -叩对 III损伤有明显的加重作用 0 随着右美托咪定的临床使用日益广泛，越来越多的学者对其器官保护作用及机制 展开了研究，相关报道日益增多，为我们进一步研究作用机制，提供了很多参考 。 &11 等人发现【 25】 ，右美托咪定既

44、减少了大鼠心 肌的 八水平，又抑制其血浆中的儿茶酿 胺水平的增加。儿茶酚胺导致自由基产生和。自由基引起脂质过氧化，诱导细胞通透 性 的 改 变和 的 积 累 ， 最 终 导 致 细 胞 损 伤 。 同 样 ， 表 明 ， 右 美 托 咪 定 对肾缺血再灌注损伤的保护作用，与减少儿茶酿胺的水平有关 右美托咪啶防止肝脏 缺血再灌注损伤，可能与其激活突触前 012受体，抑制儿茶酚胺的释放有关。 等人发现 【 27】 ，右美托咪定对不完全性脑缺血的保护作用，与抗凋亡蛋 诌阶 1-2和 1111-2水平的增加有关。 如如油扣 11等 【 28】 报道，大鼠注射激动剂后，右 美托咪定能减轻其神经元损伤。实

45、验证实，与右美托咪定抑制尺 人受体及抑制腺 苷酸环化酶和鸟苷酸环化酶，从而防止胞浆内 42十超载有关。 5放！ 等 【 291研究发现，在脓毒症大鼠模型，右美托咪定减轻肝擀血和汇管区炎症， 并能减轻肝细胞的凋亡。有研究表明，右美托咪定通过降低白细胞介素 6 (-)和 肿瘤坏死因子 X爾 水平，减少细胞因子产生和中性粒细胞浸润，从而抑制炎症反 应，产生脏器保护功能 31】 ，这与本实验结果一致。 综上所述，右美托咪定干预能减轻小鼠肝脏缺血再灌注损伤后的炎症反应，有效 改善肝功能和肝脏 病理损害，抑制肝细胞凋亡；机制可能在于其能抑制缺血再灌注损 伤肝组织中肿瘤坏死因子 01(1-00和白细胞介素

46、6 ()的表达，具体作用机制， 尤其是相关信号转导通路，有待进一步探讨。 结论 1、右美托咪定干预能减轻小鼠肝脏缺血再灌注损伤后的炎症反应，抑制肝脏 I尺 后肿瘤坏死因子 畝胃 -幻 和白细胞介素 6 11.-63的表达。 2、右美托咪定干预能有效改善肝功能和肝脏病理损害，抑制肝细胞凋亡。 3、本实验剂量的右美托咪定 拉） 腹腔注射， 小 鼠肝脏毒性并不明显 3 参考文献 【 1】人 1x1-111 IV！， 118 87，丁 3111*1& V，？ 111161 6， 01(18011 8,8611111 八 . 1801161111/1*61)611181011 1111117： 131*0068868 111 111 打迕 111111 017 1*616 丁 I贏 口 1 2010； 16： 1016 1 11611(161*8011 刀 1 1,11 IX过 1181)1 过加