槲皮素活化mTOR信号通路对L929成纤维细胞增殖的影响.docx

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1、榭皮素活化mTOR信号通路对L929成纤维细胞增殖的影响莹海良，张颖，黄谢梅黄宏/ ,郭婵，邢伟2 ,孙进，徐祥H00010成庆，通庆侯科大学阳风第.医院皮肤科；4Q0012或庆，第三军医大学第三军医大学大坪医院野战外科研究所第一研究室， 创伤、烧伤与复合伤国家理点实验室5一格希带格式的:字体：小五）批注（Editorll：摘要结果是摘要的核心部分，描述的太 简单.有数据的满拿出上要数据，应具体.英文摘要一 井修改摘要tl的：探讨格皮素uerccdn）对L929成纤维细胞增殖的影响及其分子机制.方法：采用MTT法检测制皮索时L929 细胞增购的影响，荧光素酷报告基因法检测棚皮素对蛋门质疑洋调控

2、的影响,Western blot法检测懈皮素对mTOR介导的蛋白质解洋 网控地路关板基因mTOR的表达和，IE-BP1的磷酸化,细胭周期调控蛋白cyclin D,的表达的影响及mTOR通路用断实5佥.结果：MTT法检 测结果显示在36h Fffl点.浓度为1、1.5、2, 2.5X10%ol/L时,相皮素可明显促进L929细胞增殖（P0.01）：荧光素的报告基因 检测系钱结果显示：在36h干预点.2.5X10mol/L棚皮素 q对照组相比.RLH相对光单位 值明显增加（Pcpartment of dcnnatology. The second AfHliateci lla*piul. Chon

3、gqing Mcdkral Unnerxity. chongqing,40()0l0 ;Sloce Key labaratary of Trauma.Bums and Cambincd Injufy.Instnuic of Surgery Rcscm曲)港格式的：字体：（默认）Times New Roman,英诏（关 国）港格式的：字体：（默认）Times New Roman,英诏（关 国）.Abstract Objective： To determine ihc effect of quercetin on mice flbrob-last cell line L929 proliferat

4、ion and explore its molecular mechanism. Methods： The effect of inice fibctrob-last cell line L929 proliferation was measured by MTT assay.lhc effect of quercetin on protein regulation was delected by luciferase reporter assay, the effect of quercetin on Expression of mTOR、cyclin Di and p-4 吵 BP I,k

5、ey genes in the mTOR-mediated protein translation pathway, were determined by Western Blot analysis. Results： Among the high concentration groups (I、1.5、2、2.5X10 jnol/L )at the point of 36 hours.Quercetin significantly induced proliferation of inice fibrob-las( cell line L929;The Luciferase reporter

6、 gene detection system showed:Compared with the control group, the RLU (relative light units) of 2.5x10-1moi/L quercetin value increased significantly at the point of 36 hours;And quercetin increased the expression of mTOR and cyclin Di.and phosphorylation of 4E-BPI in mice fibrob-last cell line L92

7、9 by western blot.and mTOR pathway blocking experiments .The role of lOOng/ml rapamycin, after 36h. compared with the control group. The P-4E-BP1. mTOR, cyclin DI protein expression of quercetin group was significantly increased, rapainycin signillcanily reduced, rapainycin + quercetin protein was i

8、ncreased, but decreased compared with quercetin.Conclusions:Quercelin can induce mice fibrob-last cell line L929 proliferation through activating mTOR signal pathway io increase expression of cyclin Dj.（Key Mordsjqucrcctin； fibrob-last cell line L929；榭皮素（quercetin,简称QU）是一种广泛存在丁植物 界的黄崩类化合物，为酪氨酸的的特异性抑

9、制剂，广泛 存在于蔬菜和水果中，是中药恻树皮的主要提取物之 一。因其具有抗炎、抗过敏、解痉、强心、降血压、扩 张冠脉、降血脂、抗心率失常、抗血小板聚集、抗氧化、 抗肿痛等广泛的药理作用，而备受关注.研究发现, 擀皮素一方面可通过活P38/MAPK 也路，诱导 Caspase-3的表达，抑制p53、bcl-2的表达，而促进肿 瘤细胞的调亡，发挥抗肿痛作用.另外，楙皮素还可诱 导转化牛.长因子-B1的表达，进而影响细胞周期，将细 胞阻断TG1期（2田。另有研究证实，小剂量榔皮索 （10%oL）抑制细胞增殖，而较大剂量（10 mol/L）则促 进平滑肌细胞增殖g”,其机制可能是由于不同浓度的 楙皮素

10、对MAPK有着不同的影响，而致高低剂量作用不 同。还有，榔皮素对溃疡、创面具有保护作用，并能促mTOR signal pathway ； cell proliferation进伤口愈合，但其促进伤口愈合的作用机制li前仍不消 地文8：,成纤维细胞是伤口愈合的中心细胞,由此，我 们推测榴皮素的促愈作用可能是通过促进成纤维细胞 增殖和分泌相应的促愈因子而发挥促愈作用。再仃mTOR 是调控细胞生长的核心因子，进而我们进一步推测，樨 皮素促进伤口愈合和细胞增殖的分子机制可能是通过 诱导mTOR信号通路活化，激活蛋白质的翻译，进而促进 成纤维细胞的增殖和分泌。闪此,本研究拟以鼠皮肤结缔组织纤维母细胞L9

11、29 细胞株为细胞模型，研究榭皮素对成纤维细胞的增范效 应，以及其对mTOR介导的蛋白脑翻译信号通路的影响， 充分探讨榴皮素在促进伤口愈合和细胞增殖中的分子 机制，为榴皮素在伤口愈合治疗中的应用提供理论依 据。基金项目国家白然科学基金No.国家重点实验室基金No. SKI.ZZ2OO9O7通信作者郝进, 1材料与方法1. 1材料1. 1. 1细胞1929成纤维细胞株购自南京凯基生物科技发 展有限公司。在含10%新生小牛血清的高辅DYEN培养基、37-C 5%C0；饱和湿度条件下培养，每3天换液传代，实验选用对数 生长期的细胞.1. 1. 2试剂 榭皮素(Quercetin)购自西安飞达有限公司

12、， 并用培养基稀择成2.5X 10加14；DMEM培养站购自美国 Gibe。公司：新生小牛血清购自HyClonc公司；四甲基偶氮P，： 蓝(MTT)和二甲基亚S4(1)MSO)购自Sigma公司：荧光素饰报告 基因检测试剂盒购自Promega：鼠抗人p-，IE-BPl的克隆抗体购 自Cell Signaling公司；牧抗人GAPDH单克隆抗体、兔抗人 mTOR单克隆抗体购自Santa Cruz： HRP标记的山羊抗fillgG二 抗、HRP标记的山羊抗兔IrG :抗购自中杉金桥。源细胞，为什么选用抗人的抗体？(人蛋白和鼠蛋白有较大 同源性)1.2方法1.2. 1 MTT法核测细胞生长增殆率L9

13、29细胞 按0.2X1Q,个 /ml密度接种于96孔板,榔皮素按终浓度不同，设对照组(0 Jjg/ml)和实验组(1, 1.5x 2. 2.5X10 jiol/L),分别了36 h后进行MTT试验检测.步骤如下:向句孔内加入20 pl M1T(5 g/D溶液，37V, 5% CO：培养箱内培养细胞4 h, 1000 r/min 两心5min,弃去孔内培养液.初孔加入150 pl DVSO.摇床振 荡10min,使结晶物充分溶解，在前标仪上测490nm波长处各 孔的光密度值UX490).细胞生长增殖率=实除组。(190)-1/对照料小490) X 100%1. 2. 2荧光素的报告基因检测皮肤L

14、929成纤维细胞常规 培养至对数生长期,细胞按5X 10,度接种干6孔板，总体枳为2 ml.培养24 h后按如下分组处理细胞：实验共分为2组,对照 组为只加培养基的正常细脆组，等到细胞长到50%左右进行细胞换液,分别用含LOjig PCDNA-LUC质粒和3.0 pl PolyJet Reagent子质体温匀后转染L929细胞，10 h以后换液用2.5X 10 %。1儿榔皮素加入细胞培养茶中，维续培养36 h, 4C预 冷PBS洗3地，然后Gl。Lysis Buffer裂解5min,按Steady-Gio 荧光素版报告基因检测试剂盒说明进行魄作，采用G0UAX Promega发光计检测，重复3

15、次。1.2.3 Western blot检测cIF4E、mTOR蛋白的表达选用生 长状态良好的L929细胞.常规培养至对数生长期,细胞按IX 10个/ ml密度接种十6 cm板.总体枳为3 .培养24 h后按如 下分组处理细胞：实验共分为2组.设只加培养基的正常细胞 对照组，2.5X10%cl/L榔皮素组，培养36h.参照试剂盒说 明书，分组提取总蛋白，采用RCA法测定蛋白浓度，使每个样 品蛋白浓度桶择到1 PM/m 1,用个样品取50Hl行10%SDS-PAGE. 半干转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭2 h.分别加入 负抗人P-4E-BP1单克隆抗体(1： 500)、鼠抗人GAPDH

16、单克隆 抗体(1： 500)、免抗人mTOR单克隆抗体(1： 500),兔抗人cjdin 6单克隆抗体,4C的自过夜，TPBS充分洗膜后分别加入HRP 标记的山羊抗限】侬二抗(1： 15 000)和山羊抗兔IgG二抗(1： 15 000),室温蚂育2 h, TBST洗膜后，ECL试剂显色，在X光 洗片机(HQ-320XT)上邮光，实脸里现3次.1.2.4 mTOR通路阴断实验 实脸分为4组，设只加培养基的正 常细胞为对照组，100nK/ml的砧帕荏素组U&19】，2.5X 10 mol/L褥皮索组,100ng/ml的缶帕霉素+2.5X 10 mol/L相 皮素组，药物剌激36h后，提取蛋白,然

17、后用Western Blot检 测p-4E-BP】、mTOR、cyclinDl蛋白的表达(方法同上).1.3统计学处理数据以K 土 s表示,应用统计软件SPSS进行?检验？2结果2.1帼皮素对L929细胞的增殖效应带格式的:字体颜色：红色)格式的:#体：9.51,字体颜色：黑色 一 带格式的:字体颜色：红色)恬格式的:再新色厂药色经不同浓度的榭皮素处理，培养36 h后对L929成纤的细胞 生长增殖绪果表明，在1.02.5) X10moL浓度范用内. 的发药物浓度的增加，细胞存活数愤增加，成正比白势(图I)。硼皮 恭对L929成，很细她OO似的影响a： /K0.01.与对熙tfl比较:b： AO

18、. 01.不问浓度81 间比较:Sl=0. S2= 0.1521；图1不同液度的榭皮素在y h后对1929细胞的影V)带格式的:上标)标注统计学怠义,补充标准差，横坐标单位是否应该是(X1Q) ?2. 2狒皮素时细胞增殖的影响 榭皮素作用于1.929细胞显示：2. 5X 10 mol八榭皮素与财照组相比，RLUJ1I对光36 h后,Steady lo荧光素的报告基因检测系统结果地位值明显增加.见图2.图2 2.5乂10%1八棚皮素处理L929细胞36 h后RLU值标注统计学意义，补充标布/.横坐标单位是否应该是（X10：） ?注:与对照组比较，P、J 4 IT TVZ7 - L K IIJ1E

19、复合物进乐LjmRNA的帕结构结合，录终 启动帽依赖性蛋白质的翻译。其中eIF-4F的形成 是帽依赖性蛋白的翻译起始的关键限速步骤之 一。本研究发现脚皮素正是通过激活mTOR信号通 路，进而启动蛋白质翻译起始豆合物的形成，而 调控I.929细胞的蛋白质翻译。cycling作为mTOR 信号通路和elF4E的耙基因，其的翻译过程也是 通过帽依赖性蛋白质的翻译途径进行。本研究也 证实，褥皮素也可上调cyclin 上的表达。细胞 周期蛋白cycling增加，可刺激细胞从G。期进提 前进入S期，从而促进成纤维细胞的增殖和分泌 【22 e本研究显示搦皮素在在定浓度范围内可通 过诱导mTOR的表达，活化此

20、信号通路，进而调控 细胞周期调控蛋白cyclin %的表达，促进皮肤 L929细胞的增殖，在皮肤溃疡、创面愈合的促愈 中发挥重要的作用。目前的研究尚未解决榭皮素 是否存在靶受体，传递致细胞增殖信号具体转导 途径等关键问题。因此进一步研究将明确树皮素 促进细胞增殖作用机制、探索可能的分子作用靶 点。参考文献：LIMitsuyoshi M Naoko S. Kotan* S. el al.CyUXoxicity of flavonoids louarxi cuhunxi nomial human cclls|J|.Bol Plurm Bull.200528 2532 Rang TBJJnng NC

21、.StwIk on the inhibitory effects of quervdin xi the growth of NB4 laikcmia cm Pharmaool.r997,54:l O13KM83王箭.眠明辉.涂植丸郴皮率对肝腺癌A549利电生长的影响Ul.ffi;军医大学学报,2()07.29(19)： 1K52.IK54.LljMarian RA, Juan AV, Jose C u al.Qucrvc(in m edintes tbc down-regulation of mutant p53 in the human breast canocf cell line r R

22、ex.l994.54:2424.2428.X向静.王伯.王绿姬,ei aL根素与大豆肯元对，管邛滑肌细胞增殖 的抑制作用儿沪国泸的侏武2aM.29(5):437.440.外潴.史道华.中药抑MS管平满肌细更增殖的新途径-mTORIJI. 海峡药学,2006. 17(6)： 10-12.|7|许,L宇，阳永利,葛根等.不同黄例类药物对大秋骨摘伤愈合的 疗效比较山,山东医药.2009.49(29):70|8|舒毅,诲阳,布皮索的药理学进展叫华西药学杂志.200&23(6力 689-691.9 Chen XY. I.iu JT.Siudy on tumund healing promoicd by

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25、r Res 27, 20()7.67 ():35ft9-3573.”8如暧,周晨燕.离举的,雷柏帝东逆转性淋巴细胸白血病 CEM细悒对他皮质激素耐药的哂咒叫临床儿科杂志.2010.我 (5)： 414-419.U9刘兆龙,仪波，罗芸役等加柏将忒抑制加货蜘GBCSD班阐的 生长和利移I”.中国肿钮生物治疗杂志.2009. 16 (6)： MKI MM.20刘宏.赵洪安，李敛,骨格他术后雷柏奇力:初始治疗疗效的初 步分析第三军医大学学报200氏妙力：64416.|2| Mirumb kleijiu Gert C. schepcr. Harry ().XMmia.Adn A.M. Thomas. R

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