细菌的培养及鉴定优秀PPT.ppt

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1、细菌培育及鉴定细菌培育及鉴定 标本采集原则标本采集原则1.1.刚好采集微生物标本作病原学检查刚好采集微生物标本作病原学检查2.2.在抗菌药物运用前采集标本在抗菌药物运用前采集标本3.3.采样时严格执行无菌操作采样时严格执行无菌操作4.4.标本容器须无菌，但不得有消毒剂标本容器须无菌，但不得有消毒剂5.5.采样后马上送检采样后马上送检6.6.送检标本应注明来源和检验目的送检标本应注明来源和检验目的咳痰方法咳痰方法病人先漱口，清洁口腔，去除表面的菌群病人先漱口，清洁口腔，去除表面的菌群 病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液无痰可用无痰可用35NaCl 5ml雾吸约雾

2、吸约5min导痰导痰以早晨其次口痰为佳以早晨其次口痰为佳标本采集后放置时间不超过标本采集后放置时间不超过2小时小时 清洁中段尿液清洁中段尿液尽量取早晨第一次尿液尽量取早晨第一次尿液嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水 女性病人女性病人收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水冲收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水冲洗尿道口洗尿道口排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿男性病人男性病人翻转包皮，清洗尿道口翻转包皮，清洗尿道口排出几毫升后，不停止尿流排出几毫升后，不停止尿流,采集中段尿采集中段尿 采集标本后马上送检！采集标本后马上送检

3、！哥伦比亚血平板哥伦比亚血平板养分要求高的细菌养分要求高的细菌巧克力平板巧克力平板含含V、X因子，主要培育嗜血杆菌、因子，主要培育嗜血杆菌、脑膜炎球菌和淋球菌用脑膜炎球菌和淋球菌用中国蓝中国蓝/麦康凯平板麦康凯平板G-杆菌用杆菌用SS平板平板沙门氏菌和志贺氏菌用沙门氏菌和志贺氏菌用M-H平板平板细菌药敏用细菌药敏用TCBS平板平板弧菌科细菌用弧菌科细菌用沙包氏平板沙包氏平板真菌培育用真菌培育用真菌显色平板真菌显色平板真菌培育用真菌培育用罗氏培育基罗氏培育基分枝杆菌用分枝杆菌用常用的培育基种类和用途常用的培育基种类和用途临床标本培育基选择临床标本培育基选择血：血：血培育瓶血培育瓶中断尿：血平板、

4、中断尿：血平板、mac平板平板脑脊液：血培育瓶、血平板、巧克力平脑脊液：血培育瓶、血平板、巧克力平板板穿刺液：血培育瓶、血平板、巧克力平穿刺液：血培育瓶、血平板、巧克力平板、板、mac平板平板胆汁：血平板、巧克力平板、胆汁：血平板、巧克力平板、mac平板平板大便大便:.麦康凯、麦康凯、SS、血平板、血平板细菌接种的基本程序细菌接种的基本程序灭菌接种环灭菌接种环沾取标本沾取标本接种接种灭菌接种环灭菌接种环细菌接种法细菌接种法平板划线接种法：平板划线接种法：目的：使混合的细菌呈单个分散生长，目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。形成单个菌落，以便获得纯菌。方法：方法：分区划

5、线法：适用于含菌量较多的标本分区划线法：适用于含菌量较多的标本连续划线法：适用于含菌量较少的标本连续划线法：适用于含菌量较少的标本分区划线法分区划线法(3区区)第一区划线第一区划线灭菌接种环灭菌接种环其次区划线其次区划线灭菌接种环灭菌接种环第三区划线第三区划线灭菌接种环灭菌接种环连续划线法连续划线法细菌培育法细菌培育法一般培育（需氧培育）：一般培育（需氧培育）：培育温度：培育温度：35（接受恒温培育箱）（接受恒温培育箱）培育时间：培育时间：1824h二氧化碳培育法：烛缸法、二氧化碳培育二氧化碳培育法：烛缸法、二氧化碳培育箱箱厌氧培育法：厌氧培育箱、厌氧袋、厌氧厌氧培育法：厌氧培育箱、厌氧袋、厌

6、氧罐、疱肉培育法、硫乙醇酸盐法等罐、疱肉培育法、硫乙醇酸盐法等细菌在固体培育基中的生长现象细菌在固体培育基中的生长现象菌落菌落定义：指单个细菌在平板培育基上生长繁殖，定义：指单个细菌在平板培育基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。形成单一肉眼可见的细菌集团。菌落特征：大小、形态、边缘、颜色、表面、菌落特征：大小、形态、边缘、颜色、表面、透亮度、潮湿度、黏度、溶血性透亮度、潮湿度、黏度、溶血性菌落类型：光滑型（菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（）、粗糙型（R）、黏）、黏液型（液型（M）菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌积累物。菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌积累物。菌菌 落落菌落与菌苔菌

7、落与菌苔菌落的三个类型：菌落的三个类型：1.1.光滑型菌落（光滑型菌落（Smooth type ColonySmooth type Colony）：又称：又称S S型型2.2.粗糙型菌落（粗糙型菌落（Rough type ColonyRough type Colony）：又称）：又称R R型型3.3.粘液型菌落（粘液型菌落（Mucoid type ColonyMucoid type Colony）又称）又称M M型型2023/4/1416 S型菌落型菌落 R型菌落M型菌落型菌落革兰染色革兰染色原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结

8、晶紫与碘的复合物，壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，量高、肽聚糖层薄且交

9、联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜快速溶解，薄而松散的肽聚以类脂为主的外膜快速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经复红等红色染通过乙醇脱色后仍呈无色，再经复红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。革兰染色步骤革兰染色步骤 涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片涂片 干燥干燥 固定固定固定的目的：固定的目的：使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘得更坚固；可变更菌体对染料的通透性；加热固定可杀死细菌，比较平安。结晶紫结晶紫 1 1 碘液碘液 1 9

10、5%1 95%乙醇乙醇 30”30”复红复红1 1 冲洗冲洗 滤纸干燥滤纸干燥 油镜视察油镜视察冲洗冲洗冲洗冲洗冲洗冲洗革兰染色程序革兰染色程序初染初染媒染媒染脱色脱色复染复染紫色（紫色（G）革兰氏染色步骤示意图革兰氏染色步骤示意图革兰染色革兰染色甲菌甲菌乙乙菌菌初染初染结晶紫结晶紫媒染媒染碘液碘液脱色脱色乙醇乙醇复染复染稀释复红稀释复红紫色（紫色（G）红色（红色（G-）革兰染色步骤示意图革兰染色步骤示意图【结果结果】细菌被染成紫色者，称为革兰阳性菌；而细菌染成红色者，称为革兰阴性菌；阳性菌阳性菌紫色紫色（G+b)G+b)阴性菌阴性菌红色（红色（G-b)G-b)G+球菌显微镜下的杆菌G-杆菌F

11、igure 2-Gram stain of Gram-E.coli cells痰标本涂片染色低倍镜下分类痰标本涂片染色低倍镜下分类 分级分级 白细胞（个）白细胞（个）上皮细胞（个）上皮细胞（个）A 25 25 25 C 25A、B两种状况的痰适合做培育，两种状况的痰适合做培育，C不合格，应重不合格，应重新留标本新留标本革兰染色留意事项革兰染色留意事项标本涂片不宜太厚标本涂片不宜太厚固定不宜过热固定不宜过热脱色不宜过度脱色不宜过度选用培育选用培育18-24小时菌龄的细菌为宜小时菌龄的细菌为宜抗酸染色抗酸染色原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸其中主

12、要成分为分枝菌酸,此物具有此物具有抗酸性抗酸性,染色时与石炭酸复红结合坚染色时与石炭酸复红结合坚固固,能反抗酸性乙醇的脱色作用能反抗酸性乙醇的脱色作用,因因此抗酸菌能保持复红的颜色此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染达到染色目的。色目的。抗酸染色步骤抗酸染色步骤 1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。、涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片涂片 干燥干燥 固定固定抗酸染色步骤抗酸染色步骤2、染色包括初染、脱色、复染三步。、染色包括初染、脱色、复染三步。石炭酸复红维持石炭酸复红维持 3-5 3%3-5 3%盐酸酒精盐酸酒精30 1 30 1 美蓝美蓝复染复染1 1 冲洗冲洗 干燥干燥 油镜视察油镜视察冲洗冲

13、洗冲洗冲洗初染初染脱色脱色复染复染抗酸染色结果抗酸染色结果抗酸菌呈红色，抗酸菌呈红色，常积累成团，常积累成团，排列无序，排列无序，偶呈分枝状生长。偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。背景及非抗酸性细菌呈兰色。抗酸杆菌报告抗酸杆菌报告300个视野仅见到个视野仅见到18条抗酸杆菌填写条条抗酸杆菌填写条数数1+：镜检查见：镜检查见3-9条抗酸杆菌条抗酸杆菌/100高倍镜高倍镜视野视野2+：镜检查见：镜检查见19条抗酸杆菌条抗酸杆菌/10高倍镜高倍镜视野视野3+：镜检查见：镜检查见1-9条抗酸杆菌条抗酸杆菌/高倍镜视高倍镜视野野4+:镜检查见镜检查见9条抗酸杆菌条抗酸杆菌/高倍镜视野高倍镜视野抗

14、酸染色留意事项抗酸染色留意事项染色染色充分充分脱色时间脱色时间宁长勿短宁长勿短在涂抹痰标本时在涂抹痰标本时严禁严禁对载玻片进行对载玻片进行加热加热临床标本培育基选择临床标本培育基选择生殖道标本依据临床医生所写的检验项生殖道标本依据临床医生所写的检验项目接种相应的平板及操作：目接种相应的平板及操作：淋球菌培育接种淋球菌平板淋球菌培育接种淋球菌平板;念珠念珠菌培育接种沙保罗培育基；支原体培育菌培育接种沙保罗培育基；支原体培育则按支原体培育的操作规程操作；则按支原体培育的操作规程操作；作一般培育则接种血平板和巧克力平板作一般培育则接种血平板和巧克力平板 视察细菌在平板上的生长现象视察细菌在平板上的生

15、长现象血平板：大小、形态、边缘、颜色、表血平板：大小、形态、边缘、颜色、表面、透亮度、潮湿度、黏度、溶血性面、透亮度、潮湿度、黏度、溶血性mac平板：大小、形态、颜色、透亮度、平板：大小、形态、颜色、透亮度、潮湿度、黏度潮湿度、黏度巧克力平板：大小、形态、颜色、透亮巧克力平板：大小、形态、颜色、透亮度、潮湿度、黏度度、潮湿度、黏度2023/4/1437 革兰阴性菌革兰阴性菌 葡萄球菌葡萄球菌细菌的初步分类细菌的初步分类细菌的分别与纯化：自血平板挑出待检细菌的分别与纯化：自血平板挑出待检菌株的单菌落进行初步的鉴定。假如混菌株的单菌落进行初步的鉴定。假如混有杂菌，应当重新转种分纯。有杂菌，应当重新

16、转种分纯。染色与镜检：染色与镜检：首先通过革兰氏染色确定首先通过革兰氏染色确定基本的分类：（基本的分类：（1）G+球菌（球菌（2）G-球菌球菌（3）G-杆菌（杆菌（4）G+杆菌。此外，假如杆菌。此外，假如镜下发觉革兰氏染色阳性、椭圆形、有镜下发觉革兰氏染色阳性、椭圆形、有芽孢状的较大菌体，可能是真菌。芽孢状的较大菌体，可能是真菌。金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌最重要最重要的致病葡萄球菌的致病葡萄球菌血平板上菌落有明显血平板上菌落有明显溶血环溶血环，颜色呈金，颜色呈金黄色、灰白色或柠檬色黄色、灰白色或柠檬色分解分解葡萄糖葡萄糖、麦芽糖麦芽糖、蔗糖蔗糖和和甘露醇甘露醇血浆凝固酶和血浆凝固酶和DNA酶

17、酶阳性阳性 2023/4/1441葡萄球菌葡萄球菌念珠菌显色培育基念珠菌显色培育基绿色绿色白色念珠菌白色念珠菌蓝色蓝色热带念珠菌热带念珠菌白色白色其他，细菌被其他，细菌被抑制抑制紫色紫色光滑光滑粉色粉色克柔假丝酵母克柔假丝酵母菌菌嗜血杆菌的鉴定途径嗜血杆菌的鉴定途径只能在养分条件高的巧克力平板上生长，只能在养分条件高的巧克力平板上生长，菌落为中等大小、圆形、灰白色、透亮菌落为中等大小、圆形、灰白色、透亮革兰染色：革兰染色：G-小杆菌小杆菌卫星试验就可以帮助初步鉴定卫星试验就可以帮助初步鉴定2023/4/1448嗜血杆菌嗜血杆菌奈瑟氏菌属鉴定奈瑟氏菌属鉴定在血平板和巧克力平板上生长，在血平板和巧

18、克力平板上生长，mac上不上不生长生长血平板形成灰色、潮湿、透亮或半透亮、血平板形成灰色、潮湿、透亮或半透亮、不溶血的菌落不溶血的菌落巧克力平板上形成圆形、灰蓝色的似露巧克力平板上形成圆形、灰蓝色的似露滴状菌落滴状菌落革兰染色：革兰染色：G-双球菌，呈肾形或咖啡豆双球菌，呈肾形或咖啡豆形，凹面相对形，凹面相对氧化酶和触酶都均为阳性氧化酶和触酶都均为阳性 奈瑟氏菌属有奈瑟氏菌属有11个种，临床就个种，临床就淋病奈淋病奈 菌菌和和脑膜炎奈瑟菌脑膜炎奈瑟菌 最为重要最为重要奈瑟氏菌属鉴定流程奈瑟氏菌属鉴定流程 菌落视察：灰色、潮湿、透亮或半透亮、菌落视察：灰色、潮湿、透亮或半透亮、不溶血不溶血 涂片

19、染色：涂片染色：G-双球菌，呈肾形或咖双球菌，呈肾形或咖啡豆状啡豆状 氧化酶试验氧化酶试验+触酶触酶+麦芽糖麦芽糖 -脑膜炎奈瑟菌脑膜炎奈瑟菌 淋病淋病奈瑟菌奈瑟菌细菌的鉴定与药敏细菌的鉴定与药敏卫生部重点监控的卫生部重点监控的6种种MDRO MASA:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌推断标准：对苯唑西林耐药或头孢西丁诱推断标准：对苯唑西林耐药或头孢西丁诱导试验阳性导试验阳性CRAB：耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌：耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌推断标准：对亚胺培南或美罗培南耐药推断标准：对亚胺培南或美罗培南耐药 VER：耐万古霉素肠球菌：耐万古霉素肠球菌推断标准：对万古霉素耐药推断标准：对万

20、古霉素耐药ESBLs：产超广谱：产超广谱内酰胺酶细菌。包括：内酰胺酶细菌。包括：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌等菌等推断标准：对第推断标准：对第3代和第代和第4代头孢菌素和代头孢菌素和氨曲南耐药氨曲南耐药CRE:耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌推断标准：对亚胺培南等碳青霉烯类耐推断标准：对亚胺培南等碳青霉烯类耐药药MDR/XDROA:多重耐药多重耐药/泛耐药铜绿假单泛耐药铜绿假单胞菌胞菌推断标准：对亚胺培南等碳青霉烯类耐推断标准：对亚胺培南等碳青霉烯类耐药药临床常见问题临床常见问题痰涂片与痰培育结果不一样？痰涂片与痰培育结果不一样？培

21、育和涂片选择的痰液不同；标本培育和涂片选择的痰液不同；标本采集时间过长，部分苛养菌死亡；采集时间过长，部分苛养菌死亡；选择药敏结果敏感的药物，临床治疗无选择药敏结果敏感的药物，临床治疗无效？效？体外药敏试验只能预料体内治疗效体外药敏试验只能预料体内治疗效果，并不等同；一般来说，耐药果，并不等同；一般来说，耐药=治疗无治疗无效，敏感效，敏感治疗有效治疗有效今日培育结果与前天结果不一样？今日培育结果与前天结果不一样？1）取材是否规范？）取材是否规范？2）痰标本有时候选择优势菌做，可能结）痰标本有时候选择优势菌做，可能结果果 不一样不一样3）抗生素的运用）抗生素的运用鉴定结果为四联球菌、革兰阳性杆菌

22、，为鉴定结果为四联球菌、革兰阳性杆菌，为何没有药敏结果？何没有药敏结果？1）四联球菌为微球菌，一般不引起人体）四联球菌为微球菌，一般不引起人体致病，考虑为污染致病，考虑为污染2）革兰阳性杆菌目前没有参照标准，故）革兰阳性杆菌目前没有参照标准，故暂不做药敏试验，若须要治疗参考阳性球暂不做药敏试验，若须要治疗参考阳性球菌用药菌用药B群链球菌群链球菌寄生在产妇生殖道。孕产寄生在产妇生殖道。孕产妇脓毒血症和新生儿脑膜炎的重要缘由妇脓毒血症和新生儿脑膜炎的重要缘由支原体、衣原体支原体、衣原体 感谢大家！感谢大家！检测结果为找到抗酸杆菌，临床已经解检测结果为找到抗酸杆菌，临床已经解除了结核除了结核抗酸杆菌包括结核与非结核分枝杆菌，抗酸杆菌包括结核与非结核分枝杆菌，抗酸杆菌阳性不确定就是结核。抗酸杆菌阳性不确定就是结核。